外源基因的表达系统ppt课件.ppt

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1、第八章 外源基因的表达系统,第一节 基因表达的机制第二节 外源基因表达系统,表达系统,克隆的基因只有通过在宿主细胞中表达才能进一步研究其功能和调控机理，同样，也只有通过其表达才能获得具有特定生物活性的目的产物。这种表达外源基因的宿主细胞就叫表达系统，它可分为原核(主要是大肠杆菌)表达系统和真核(酵母、昆虫细胞、哺乳类动物细胞、植物细胞)表达系统两类。要使克隆基因在宿主细胞中表达，就要将它插入带有基因表达所需要的各种元件的载体中，这种裁体就称为表达载体。对不同的表达系统，需要构建不同的表达载体。,基因表达,遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程中心法则（central dogma）。,克隆基因的表达

2、,外源基因在宿主细胞中表达。,外源基因,表达载体,重组载体,导入宿主细胞,在宿主细胞中 表达出蛋白质,提取蛋白,宿主细胞：,原核细胞或真核细胞。,第一节 基因表达的机制,1 外源基因的起始转录 2 mRNA的延伸与稳定性 3 外源基因mRNA的有效翻译4 表达蛋白在细胞中的稳定性 5 目的基因沉默,1 外源基因的起始转录,外源基因在宿主细胞中的有效表达是基因工程的核心问题，而外源基因的起始转录又是基因表达的关键步骤。转录起始的速率是基因表达的限速步骤。选择可调控的启动子和相关的调控序列，是构建一个表达系统首先要考虑的问题。一般来说，理想的可调控的启动子在细胞生长的初期不表达或低水平表达，当细胞

3、增殖达到一定的密度后，在某种特定的诱导因子(如温 度、光和化学药物等)的诱导下，RNA聚合酶开始启动转录,合成 mRNA。,原核生物基因表达的启动子可分为: 诱导型启动子和组成型启动子(前者如lac trp等的启动子,后者如T7噬菌体的启动子)。真核生物基因表达的启动子可分为：诱导型、组织特异型和组成型等类型。,2 mRNA 的延伸与稳定性,转录后 , 保持 mRNA 的有效延伸、终止及稳定是基因有效表达的关键。在转录物内的衰减和非特异性终止都可诱发转录中的mRNA提前终止。衰减子 (attenuator) 类似于简单的终止子 , 在原核生物中一般位于操纵子的启动子与第一个结构基因之间。在构建

4、表达载体时要尽量避免该序列的存在。为了防止mRNA在转录过程中的非特异性终止可以在构建表达载体时加入抗终止的序列元件。,另一方面，存在正常转录终止序列也是外源基因有效表达的重要因素，它可以防止产生不必要的转录产物，使mRNA的长度限制在一定的范围内，从而增加外源基因表达的稳定性。对于真核细胞来说，表达载体上含有转录终止序列和poly(A)掺入位点是外源基因表达的重要条件。poiy(A) 掺入的信号序列AAUAAA对 mRNA3端的正确加工至关重要，AAUAAA位点的缺失甚至可以导致基因表达的减少。,mRNA 的稳定性直接决定翻译产物的多少。对原核细胞来说 , 最佳的 方法是选择一个 RNase

5、 缺失的受体菌。对真核细胞来说 , 则需要考虑增加 mRNA 的正确加工 , 提高成熟 mRNA 的稳定性。,3 外源基因 mRNA 的有效翻译,在原核细胞中影响翻译起始的因素有:起始密码子、核糖体结合位点(SD序列)、起始密码与SD序列之间的距离和碱基组成、mRNA的二级结构、mRNA上游的5端非翻译序列和蛋白编码区的5端序列等。因此,外源基因mRNA有效翻译须考虑下列基本原则:,mRNA有效翻译须考虑的基本原则,AUG(ATG)是首选的起始密码子。SD序列为与核糖体16SrRNA互补结合的位点，该序列至少含有AGGAGG序列中的4个碱基。SD序列与翻译起始密码子之间的距离为39 个碱基。

6、在翻译起始区周围的序列不易形成明显的二级结构。,对于真核细胞mRNA的5非翻译区不存在SD序列，但绝大多数mRNA的起始序列都含有共同的序列5-CCA(G)CCATGG-3，如果改变这一序列，可使翻译的起始效率大大降低。此外， 在起始密码ATG的上游区域含有另一个起始密码而又不被随后的一个符合阅读框的终止密码所终止，则该起始密码会影响mRNA翻译的起始。,4 表达蛋白在细胞中的稳定性,外源基因的表达产物能否在宿主细胞中稳定积累而不被内源蛋白水解酶 所水解是基因有效表达的一个重要因素。如果表达的外源蛋白具有 相同或类似于宿主细胞天然蛋白的构象 , 则被降解的可能性就会大大降低。,避免外源基因表达

7、蛋白降解,构建融合蛋白表达系统：在融合蛋白中外源蛋白与受体细胞蛋白能形成良好的杂合构象，它能在较大程度上封闭外源蛋白分子上的水解酶作用位点，从而增加其稳定性。 构建分泌蛋白表达系统：使外源基因表达的蛋白质分泌到细胞周质腔或直接分泌到培养基中，避免细胞内的水解酶对表达蛋白的降解。构建包涵体表达系统：外源基因的表达产物以包涵体的形式存在于受体细胞中不易被宿主蛋白水解酶所降解。选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统。,5 目的基因沉默,基因沉默(gene silencing)是导致外源基因不能正常表达的重要因素。其作用机制主要有三种：位置效应的基因沉默、转录水平的基因沉默和转录后水平的基因沉默。基因沉默

8、现象主要表现在转基因植物和转基因动物中。,5.1 位置效应,是指基因在基因组中的位置对其表达的影响。在植物和动物转基因中，外源基因进入细胞核中并整合到染色体DNA上，其整合的位点与基因的表达密切相关。如果外源基因整合到甲基化程度高、转录活性低的异染色质上,一般不能表达;,5.2 转录水平的基因沉默,是在DNA水平上的基因调控，主要是由于启动子的甲基化或外源基因的异染色质化而引起的。重复序列可导致自身甲基化，外源基因若以多拷贝的形式整合到同一位点上，形成首尾相接的正向重复(direct repeat)或头对头、尾对尾的反向重复(invert repeat)序列，则外源基因不能表达，并且拷贝数越多

9、，基因沉默现象越严重。其原因可能是由于重复序列自发配对，甲基化酶特异性地识别这种配对结构而使其甲基化，从而抑制其表达。,5.3 转录后水平的基因沉默,是在RNA水平上的基因调控，比转录水平的基 因沉默更普遍。共抑制(cosuppression)是转录后水平基因沉默的一种，指被整合的外源基因沉默的同时，与其同源的内源DNA的表达也受到抑制。转录后水平的基因沉默的特点是外源基因能够转录成mRNA，但正常的mRNA不能积累，mRNA合成后就被降解或被相应的反义RNA或蛋白质封闭，因而不能指导mRNA的翻译。,第二节 外源基因表达系统,1 概述2 原核基因表达系统3 真核基因表达系统,1 概述,外源基

10、因表达系统由基因表达载体和相应的受体细胞两部分组成。基因表达系统有原核生物基因表达系统和真核生物基因表达系统。目前应用最广泛的是原核生物基因表达系统，如大肠杆菌表达系统、芽子包杆菌表达系统、链霉菌 表达系统和蓝藻表达系统等。,2 原核基因表达系统,2.1原核生物作为基因表达系统的受体细胞具有如下特点:原核生物大多数为单细胞异养，生长快，代谢易于控制，可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。基因组结构简单，便于基因操作和分析。 多数原核生物细胞内含有质粒或噬茵体，便于构建相应的表达载体。 生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间构象。 内源蛋白酶会

11、降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定性。,2.2大肠杆菌表达系统,2.2.1正确表达的基本条件基因在大肠杆菌细胞中实现正确有效表达的基本条件是必须能够正常地转录和翻译，在许多情况下还需进行转录后加工以及在细胞中正确定位，这些过程中的任何一步发生差错，都会导致该基因表达的失败。所以必须考虑表达载体、外源基因的性质、原核细胞的启动子和SD序列、开放读码框架(open reading frame，ORF)及宿主菌调控系统等基本条件，,正确表达的基本条件,外源基因不能带有间隔序列(内含子)；必须利用原核细胞的强启动子和SD序列等调控元件控制外源基因的表达；外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开

12、放阅读框架；通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白；利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。,2.2.2大肠杆菌基因表达载体,大肠杆菌基因表达载体的构建，应包括这些基因元件：复制子、启动子、核糖体结合位点、终止子、密码子、选择标记等。,（1）复制子,复制子：复制子是一段包含复制子起始位点和反式因子作用区在内的DNA片段。大肠杆菌基因表达系统的表达载体一般是质粒表达载体， 含有大肠杆菌内源质粒复制起始位点和有关序列组成的能在大肠杆菌中有效复制的复制子。 在同一大肠杆菌细胞内，含同一类型复制子的不同质粒载体不能共存，但含不同类型复

13、制子的不同质粒载体则可以共存于同一细胞中 。,（2）启动子,启动子与 mRNA 的合成有很大关系。在大肠杆菌细胞中大多数基因的启动子与转录起始位点之间的距离为69bp,但启动子与转录起始位点的最佳距离还有待实验来确定。,是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。,大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序（consensus sequence）。,启动子,-35 Box 和 -10 Box,启动子序列,consensus sequences,5-TTGACA-3,5-TATAAT-3, -10box（Pribnow Box）,TTGACA,TATAAT,转录起始位点,17bp,5

14、,核糖体结合位点,RNA聚合酶 亚基的识别位点 。, -35box,原核启动子共有序列的功能,核糖体结合位点（ RBS）,1）Shine-Dalgarno（SD） sequence：,mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列。,ribosome binding site,SD,mRNA 5AGGAGGUAUG,16S rRNA3,UCCUCCA,S-D序列距离AUG的距离也影响翻译,（3）翻译的起始位点,AUG（91%） GUG（8%） UUG（1%）,位于SD序列下游,2）起始密码：,E.coli中促使转录终止的DNA位置有一段反向回文顺序，其后紧接一串A，称为内终止子，形成终止信号。,终止

15、子对外源基因的表达同样起着非常重要的作用,它能有效控制目的基因 mRNA的长度,提高mRNA的稳定性,避免质粒上其他基因的异常表达。,（4）转录终止子,由于茎环3段紧接一串A/U的配对，稳定性比较差，有利于转录物脱落而不利于转录延续。,原因：,反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结构，使转录物与模板之间配对的碱基数降低，整个减弱了RNA 与DNA的互作, 茎环结构, 多聚A/U,5-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAA CT TCT TTCT-3 3-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板),转录,5-

16、CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA),RNA折叠,mRNA折叠,U C,C,U G,GC,AU,CG,CG,GC,CG,CG,GC,A A,CCCAC UUUU3,DNA,RNA聚合酶,脱落,2.2.3 宿主菌, 大肠杆菌基因表达系统的基因一般都是异源基因，某些甚至是真核生物基因，而在细胞内积累大量的异源蛋白极易被降解。造成重组异源蛋白在大肠杆菌中不稳定的原因包括：大肠杆菌缺乏复杂翻译后加工和蛋白质折叠系统。大肠杆菌不具备类似真核细胞的亚细胞结构和表达产物的稳定因子。大量的异源重组蛋白在大肠杆菌细胞中形成高浓度微环境，导致蛋白质分子之间的作用增强

17、。,为了使外源基因高效表达，必须构建作为基因表达受体菌的大肠杆菌工程菌株。,2.2.4常见的大肠杆菌基因表达系统,目前较为广泛应用的表达系统包括以下几种：Lac和Tac表达系统、PL和PR表达系统、T7表达系统等。,2.2.5.1. 细胞质中表达,（1）包涵体（inclusion body）,是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。,形成原理未知,2.2.5 外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位,在大肠杆菌细胞内表达人生长激素（human growth hormone, hGH）。,例：,使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞,回收的蛋白生物活性差。, 缺点, 优点,

18、（1）周质（periplasm）,格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。,蛋白质从细胞质转运到周质的复杂机理目前不完全清楚,优点： 容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。,2.2.5.2. 周质中表达,hoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、-内酰胺酶（lactamase）、 肠毒素（enterotoxin）ST-II、LT-B等,（3）常用的原核信号肽,大肠杆菌的信号肽：,能带领蛋白穿过膜到达周质。但以后需要正确切割掉。,（2）信号肽（signal peptide）,一般位于N端。,鼠源RNase、人生长激素信号肽。,也能在细菌中起作用。,（2）真核信号肽,胡萝

19、卜欧氏杆菌的PelB蛋白。,金黄色葡萄球菌的蛋白A。,枯草芽孢杆菌的内切葡聚糖酶 （endoglucanase）。,由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。,用溶血素（hemolysin）基因构建分泌性融合蛋白；,使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白分泌到细胞外的培养基中。,或与细菌素释放蛋白（bacteriocin release protein)共表达。,2.2.5.3. 胞外表达,5-TTGACA-3,5-TATAAT-3, -35box, -10box（Pribnow Box）,2.2.6.1. 启动子的结构对表达效率的影响,RNA聚合酶 亚基的识别位点

20、,（1）一致顺序,2.2.6影响外源基因表达效率的因素,（2）-35区与-10区之间的距离,间隔为17bp时，启动子最强。,（3） -35区和-10区的碱基顺序,越接近一致顺序，启动子越强。,5-TTGACA,TATAAT,一致顺序,lac,trp,PL,recA,tac I,tac II,5-TTTACA,TATGTT,5-TTGACA,TTAACT,5-TTGACA,GATACT,5-TTGATA,TATAAT,5-TTGACA,TATAAT,5-TTGACA,TTTAAT,-35box,-10box,5-AGGAGGU-3,S-D序列后面的4个碱基： 如果是A（T）, 翻译效率最高； 如

21、果是G（C）,效率只有50%或25%。,（1）S-D序列,？,2.2.6.2 转译起始序列对表达效率的影响,AUG左侧的三个碱基也有影响。,（2）起始密码AUG,-半乳糖苷酶的mRNA中： AUG左侧如果是UAU或CUU时，最为有效； 如果是UUC、UCA或AGG时下降20倍。,2.2.6.3. 启动子与外源基因之间的距离,转录终止区的存在保证载体不会转录非必须基因，不必浪费源量和能量、不会干扰正常的表达。,增加载体的拷贝数会增加转录出的mRNA数目。增加表达效率。,2.2.6.5 载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响,2.2.6.6.外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响,但过度的外源基因的

22、表达会影响宿主的正常生长。,2.2.6.4. 转录终止区对表达效率的影响,2.2.7.1选择强启动子序列，如tac 等,2.2.7.2 调整S-D序列与AUG碱的距离,距离过长或过短都影响真核基因的表达。根据不同的启动子选择不同的距离。,2.2.7.3 改变起始密码下面的几组密码子,一般为5-9bp。,能提高翻译的起始效率。,2.2.7 提高表达水平常用的方法,在外源基因的下游插入“重复性基因外回文序列”能防止mRNA受到35外切酶的攻击。,2.2.7.5. 减轻宿主细胞的代谢负荷,合理地调节代谢负荷与外源基因高效表达的关系。,将宿主生长代谢与外源基因表达分开。,（1）诱导表达,一般采用温度诱

23、导或药物诱导。,2.2.7.4. 增加mRNA的拷贝数和稳定性,cI857阻遏物有活性，抑制PL启动子，外源基因不表达，宿主大量生长。,32C:,42C:,cI857阻遏物失活，PL启动子启动，外源基因高水平表达，宿主生长受到限制。,cI857,PL,外源基因,PO,PL启动子是温度诱导型,调节基因lac I（位于宿主基因组内或载体上）始终产生阻遏物。,无IPTG:,阻遏物与lac操纵基因结合，抑制外源基因转录。宿主大量生长。,有IPTG:,阻遏物与IPTG结合，lac操纵基因解放，外源基因大量转录。宿主生长受抑制。,tac启动子是药物诱导型,（2）表达载体诱导复制,将宿主的生长与载体的复制分

24、开。,当宿主大量生长后，再诱导载体制粒的复制，增加拷贝数。,当需要宿主大量生长时，抑制载体质粒的复制。,N末端：由原核基因编码一段多肽， C末端：是完整的真核外源基因。,（1）设计成融合蛋白,这是避免被降解的最好措施。,质粒基因产物,目的基因产物,N,C,切割,防止被宿主的酶降解。,2.2.7.6. 提高表达产物的稳定性,Z系列载体：,ZUV5载体:,lac Z,G,AATTC,CTTAA,G,外源基因,Z2载体:,lac Z,GGG,AATTC,CCCTTAA,G,外源基因,Z3载体:,lac Z,GG,AATTC,CCTTAA,G,外源基因,提供三种融合插入阅读框。,使用次黄嘌呤核苷（lo

25、n）缺陷型菌株，减少宿主菌的蛋白酶合成。 大肠杆菌的htp R基因突变也减少蛋白酶的降解作用。 T4噬菌体的pin基因产物能抑制细菌的蛋白酶。可把pin增加到载体上。,（2） 使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解,减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。,（3）表达分泌蛋白,细胞质,外膜,内膜,周间质,质粒,染色体,“外排”： 蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。 “分泌”： 蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。,细菌蛋白分泌的条件：,位于N端，一般为15-30aa 。真核与原核的结构相似, 功能相似，可以互换。,碱性氨基酸,N,疏水氨基酸核心区,切割位点,Arg、Lys,Leu、Ile,AlaGlySer

26、,信号肽酶,外源蛋白, 有信号肽。, 细胞内的转运机制。,真核细胞中的分泌蛋白能在大肠杆菌中很好地分泌表达； 但非分泌蛋白很难在大肠杆菌中分泌。,信号肽酶I、信号肽酶II等近20多种蛋白质的参与。, 蛋白质内有与分泌相关的aa 序列。,为蛋白指明目的地。,3 真核基因表达系统,3.1 酵母表达系统3.2 植物表达系统3.3 动物表达系统,真核或病毒启动子,MCS,PolyA信号,终止子,外源基因,真核细胞表达系统表达外源基因具有下列特点,真核细胞可识别并切除外源基因的内含子，从而成功表达目的多肽，所以不必像原核细胞表达体系那样必须从mRNA制备cDNA；真核基因在真核细胞中表达时，其SD序列与

27、细胞核糖体RNA(rRNA)16S亚基3 7末端的互补程度较高，对翻译水平的调节有利；在真核细胞内，由外源基因表达的蛋白可被糖基化，成为糖蛋白，有利于保持或提高免疫原性；,外源基因导人真核细胞的效率较低，其在染色体DNA上的整合是随机的和自发的，目前还无法控制整合的位置和适当的拷贝数；真核细胞的培养要求较高，大量生产比较困难，成本也高。,3.1 酵母表达系统, 能在E.coli中克隆和扩增。,1. 酵母克隆载体,一、在酵母中表达,Leu2+、His+、Ura3+、Trp1+;, 有合适的克隆位点。, 有酵母的选择标记,Ori,有大肠杆菌的选择标记,Ampr、Tetr。,Dividing Sac

28、charomyces cerevisiae (bakers yeast) cells,由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片断（选择标记）构成。,ColE1,酵母Leu 2+,如 PYeleu10:,（1）整合型载体(YIp),转化率低（1-10转化子/微克DNA）。,特点：,载体上只有细菌的复制区，没有酵母的自主复制区。,可与受体细胞的染色体DNA同源重组，随染色体一起复制。,不能在酵母细胞中自主复制,整合到酵母的染色体上,不能从酵母细胞中提取载体。,由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片断(选择标记和酵母DNA自主复制顺序ARS）构成。,大肠杆菌质粒,酵母ARS,（2）复制型载体(YRp),酵母选择标记,

29、ARS,ARS（automously replicating sequence）:,ATTTTATATTTA,T G T,250bp,保守区,特点：,转化率高（102-103转化子/微克DNA) 。,不稳定，容易丢失。,可从大肠杆菌和酵母中提取质粒。,既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母细胞中自主复制。,穿梭载体（shuttle vector）,在YRp质粒中插入酵母染色体的着丝粒区。,特点：,YRp质粒,酵母着丝粒,（3）着丝粒质粒(YCp),不易从细胞中提取。,行为像染色体，能稳定遗传。 单拷贝存在。,由大肠杆菌质粒、2m质粒及酵母染色体DNA选择标记构成。,大肠杆菌质粒,酵母选择标记,2m质

30、粒,如pYF92:,pBR322,2m,酵母his 3+,（4）附加体型载体(YEp),2m质粒：,酿酒酵母的内源质粒，长度是2m 。含有自主复制起始区ori和STB序列（使质粒在供体中维持稳定）。,特点：,很高的转化活性（103-105转化子/微克DNA）. 拷贝数多（25-100分子/细胞）。 比YRp稳定。,YEp24,Leu- 酵母,原生质体,感受态,酶去壁,CaCl2、 PEG,整合到染色体上， 或独立在酵母细胞内,转化,Leu营养缺陷型 培养基筛选,转化子克隆生长,酵母载体,大肠杆菌,提取,插入外源基因,鉴定克隆,发酵表达,外源基因产物,分离、纯化,2. 酵母转化和表达的一般过程,

31、（1）优点,对其遗传学和生理学的研究比较深入。 小量培养和大规模反应器中都能生长。 已经分离出很强的启动子。 有翻译后的加工。 本身自然分泌很少，便于胞外蛋白的纯 化。 安全性高（FDA确认的安全生物），不 需要宿主的安全性检验。,3. 酵母表达系统的特点,常常发生质粒丢失。 重组蛋白常常超糖基化,表达量普遍低。,（2）缺点,每个N-寡糖链上含有100多个甘露糖，,分泌困难。,正常的高甘露糖寡糖链上仅有8-13个甘露糖。,分泌型蛋白有时会留在壁膜间隙，,4. 在啤酒酵母中表达的重组蛋白,24,（1）细胞质内表达,例：人Cu/Zn-SOD在酵母中表达：,5. 在啤酒酵母中表达外源蛋白的方式,超氧

32、化物,H+,H2O2,H2O,过氧化物酶,表达出的SOD修饰正确：,起始氨基酸被切掉， 第二个氨基酸丙氨酸也被乙酰化。,SOD(超氧化物歧化酶),宿主： 亮氨酸合成缺陷型酵母。,GAPD： 甘油醛磷酸脱氢酶,（2）表达分泌型蛋白,在啤酒酵母中，只有分泌型的蛋白质才能被糖基化。 需要糖基化的重组蛋白必须是分泌蛋白。,方法：,构建载体,在重组蛋白的前面加一段编码酵母菌交配类型因子a1的前导肽，与重组蛋白的N端通过Lys-Arg相连。,前导肽（leader peptide）：,蛋白质分泌到壁膜间隙时，酵母菌的内切蛋白酶识别这个切点信号，把重组蛋白正确切下来。,信号肽的切割：,前导肽,Lys-Arg,

33、重组蛋白（水蛭素）,内切蛋白酶,6.其它酵母表达系统,（1）乙肝表面抗原在嗜甲烷酵母中表达,在大型发酵反应器中容易生长； 以甲醇作唯一的碳源和能源，成本低。 有甲醇时，表达的乙醇氧化酶高达胞内总蛋白的40%！,嗜甲烷酵母（Pichia pastoris）的特点,HBsAg: 乙肝表面抗原。可以作为疫苗。 Aox1：乙醇氧化酶基因1启动子（受甲醇激活调控）。 His4：组氨酸合成所需的组氨酸脱氢酶基因。 3-aox1：整合到特定染色体的位点序列。,表达载体构建（整合型）：,诱导物：甲醇。,产量： 9106剂疫苗/240L发酵罐。,整合到染色体中,三、外源基因在植物中表达,根瘤,存在于能引起植物形

34、成冠瘿瘤的土壤农杆菌中，诱导冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导质粒（tumor inducing plasmid）。,1. Ti质粒:,Ti plasmid,环状双链DNA，1.5105-2.0105bp（185kb）,(相当于细菌染色体的3%-5%）。,（1）Ti质粒的结构,转移DNA，编码冠瘿碱的合成，能随机整合到植物的染色体上。长度一般为12-24kb，是Ti质粒最重要的部分。,左边界,右边界,生长素 基因,细胞分裂 素基因,冠瘿碱 合成,T-DNA（transfer-DNA）,生长素基因:,iaaM（tms1）和iaaH（tms2）编码合成吲哚乙酸（植物生长激素）的酶,iaaM: 色氨酸-2-单

35、加氧酶,色氨酸-2-单加氧酶,色氨酸,吲哚-3-乙酰胺,iaaH:吲哚-3-乙酰胺水解酶,吲哚-3-乙酰胺水解酶,吲哚-3-乙酰胺,吲哚乙酸,细胞分裂素基因,tmr（ipt）：异戊烯转移酶, 催化：,二磷酸异戊烯（IPP）,异戊烯酰嘌呤单磷酸（IPA）,5-AMP,章鱼碱（octopine),胭脂碱（nopaline）,NH-(CH2)3-CH-COOH,NH,CH3-CH-COOH,HN=C,NH2,NH-(CH2)3-CH-COOH,NH,HOOC-(CH2)2-CH-COOH,HN=C,NH2,Arg与丙酮酸缩合成,Arg与酮戊二醛缩合成,冠瘿碱（opine）的类型和化学结构,农杆碱（a

36、gropine）,冠瘿碱（opine）的作用,冠瘿碱是在冠瘿瘤内合成并分泌出来的，是农杆菌的碳源和氮源。大部分其他土壤微生物都不能利用冠瘿碱。,Glu的二环糖衍生物。,毒性基因（vir）,决定土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA的转移， 进入和整合。,vir的产物能诱导Ti质粒产生T-DNA区域的单链拷贝。单链拷贝从Ti质粒脱离后，可与vir的产物VIR D2蛋白结合，并在VIR D4和VIR B蛋白的帮助下穿过浓杆菌内膜、外膜、壁和植物细胞壁、细胞膜及核膜，最后整合到植物染色体上。,单链的5端是右边界区域，含有25bp重复序列，参与整合。,章鱼碱代谢基因和胭脂碱代谢基因：,不相容性基因,控制T

37、i质粒的不相容性。,冠瘿碱代谢基因,分别编码代谢这两种冠瘿碱的酶。维持农杆菌生长。,（1）第一步:植物受伤,植物受伤后能分泌酚类化合物（如乙酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮），诱导Ti质粒上的毒性基因表达。,2. 农杆菌的感染和生存,（1）第二步 感染植物,（3）第三步 毒性基因（vir）表达,T-DNA上的产物催化产生过量的生长素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。,脓杆菌吸附于植物的表面伤口部位（常在茎的基部）。,virA、virG、virD、virB,（4）第四步 T-DNA转移,T-DNA被vir基因产物切下来，并运送到植物细胞核里，整合到植物基因组中。,（5）第五步 诱导冠瘿瘤,（6）第六步 土壤

38、农杆菌代谢冠瘿碱。,3. Ti质粒的种类,根据所编码的冠瘿碱（opine），分为,（1）章鱼碱（octopine)型质粒,（3）农杆碱（agropine）型质粒,（2）胭脂碱（nopaline）型质粒,裸子植物、双子叶被子植物、禾谷类单子叶植物（玉米）。,（1）能够自发地整合到植物的染色体上。 （2）能转化多种植物。 （3）强启动子,4. Ti质粒转化的对象,5. Ti质粒作为载体的可能性,T-DNA的opine合成酶基因上有一个强启动子，能启动外源基因的表达。,25,（1）分子量太大（200kb）！ （2）限制性酶切位点太多。 （3）被转化的植物细胞成为肿瘤，不能 再分化。 （4）在大肠杆菌

39、中不能复制。,6. 天然Ti质粒作载体的缺点,（4）冠瘿碱合成对于植物无意义。应剔除掉。,（5）加入大肠杆菌的ori和选择标记。,（6）加上真核生物的转录信号和结束信号以 及添加polyA的信号序列。,（1）保留T-DNA的转移功能部分（vir基因， 左右边界）。 （2）减少限制性酶切位点，引入单一插入位 点。 （3）取消T-DNA的致瘤基因，使被转化的植 物细胞不再成为肿瘤，能正常分化。,7. Ti质粒的改造,改造后的Ti质粒载体模式,left,right,M C S,AMPr,ori,Vir,select,8. Ti载体的类型,（1）共整合载体（cointegrate vectors）,最

40、早获得广泛应用的Ti质粒是比利时科学家P.Zambrisky等1983年改造的pGV3850,需要同源重组才能插入外源基因。, pGV3850的特点：,是一种受体质粒，外源基因不能直接插入，而是需要借助于pBR322质粒作为中间载体。,宿主土壤农杆菌的选择标记是位于中间载体pBR322上的卡那霉素抗性（Kanr）基因。,位于T-DNA右半部分的胭脂碱合成酶基因（nos）。,1）脓杆菌选择标记,2）最终受体植物的选择标记, 选择标记,卡那霉素抗性（ Kanr ）基因（卡那霉素对植物有剧毒！）, 外源基因插入pGV3850的过程,外源基因,Kanr pBR322,土壤农杆菌 含pGV3850,植物

41、组织,卡那霉素筛选,胭脂碱筛选,抗卡那霉素 的土壤农杆菌,外源基因 表达鉴定,转化,插入,感染,BR322与pGV3850重组,整合到 染色体上,BR322不能在土壤农杆菌中复制，只能同pGV3850重组。只有这样，土壤农杆菌才能得到抗卡那霉素性状。,转化后可诱导愈伤组织分化成转基因植物,（2）双元载体（binary vectors）,既有大肠杆菌复制起点也有农杆菌复制起点，是个穿梭载体。,Ti质粒被剔除了T-DNA、冠瘿碱代谢基因、vir基因。 大幅度减小质粒的体积。（10kb）,双元载体的结构,Ti的精髓：Vir基因（转移）和左右界（整合）,双元载体的转化,转化农杆菌之前，所有的克隆步骤都

42、在大肠杆菌里操作。,受体农杆菌内要求带有整套vir基因（但缺失T-DNA及左右边界）的“帮助质粒”提供vir产物。,1）基因插入,2）帮助质粒（ helper plasmid）,Vir产物使双元载体上的T-DNA左右边界及其外源基因转入到植物细胞，并整合到植物染色体上。,左,右,外源基因,双元载体,Vir,帮助质粒,农杆菌,Vir,农杆菌,左,右,外源基因,感染植物,转化,左,右,外源基因,进入植物细胞核，整合，表达,E.coli,（3）三亲融合法(triparental matig),含双元载体的大肠杆菌：,含有外源基因和左右边界。,含有帮助质粒的辅助细菌：,含vir基因。,受体农杆菌（空）

43、：,三种菌混合培养，然后通过各自的抗菌素抗性标记选择吸收了外源基因、左右界、和Vir的农杆菌。,三亲,四、在哺乳动物细胞中表达,1.动物细胞基因克隆和表达载体-SV40病毒,常用的SV40载体，是从猿猴空泡病毒SV40（simian vacuolating virus40）改造而来的。, 20面体外壳：,由VP1、VP2和VP3三种病毒外壳蛋白构成。,5243bp的环状双链。, DNA：,（1） SV40病毒的结构,SV40,猿猴细胞,细胞裂解,释放SV40,啮齿类细胞,细胞癌变,SV40DNA整合到寄主染色体上,permissive,nonpermissive,（2）SV40感染和生存方式,

44、T-抗原（tumor antigen）:,两个6聚体的T抗原结合在SV40 DNA的复制起始点上，分别向相反方向移动，将双链DNA解螺旋。 随后单链DNA结合蛋白（ssB）与解开的单链DNA结合维持解旋状态。,(3) SV40 DNA的复制,解链,SV40编码的蛋白。功能是在SV40 DNA复制的时候解开DNA双链。,T抗原,SV40 DNA双链, SV40 复制起始位点,5-CTCACTACTTCTGGAATAGC,3-GAGTGATGAAGACCTTATCG,1,20,早期回文序列,TCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCCTCT,AGTCTCCGGCTCCGCCGGAGCCGGAG

45、A,21,47,T抗原结合位点,GCATAAATAAAAAAAATTAGTC,CGTATT TATTTT TTTTAATCAG,富含AT区,48,69,早期表达区：,(4) SV40病毒的转录和翻译,编码大T抗原（控制DNA复制）和小t抗原。,晚期表达区：,在DNA复制一段时间后表达，产物是VP1、VP2和VP3三种外壳蛋白。,对非受纳细胞（non permissive cells），只有T 抗原表达，随后病毒基因组随机整合到宿主染色体上。,SV40,整合,(5) SV40病毒的整合,有严格的包装限制。如果插入的外源基因过大，就无法包装。,(6) SV40病毒的包装,去掉一部分DNA(T抗原或

46、者VP基因）。,助手型SV40,去掉T抗原基因的病毒，保留晚期复制启动子。,提供外壳蛋白。,(7) SV40基因组的改造,不能复制，但能包装。,需要这两种缺陷型病毒混合感染，才能互补。既能使插入SV40的外源基因，又能使外源基因被包装进病毒颗粒，得以扩增。,去掉VP基因，插入外源基因的病毒，保留早期表达启动子。不能包装，但能复制。,重组型SV40,包装重组型SV40,提供重组DNA和T抗原。,助手型SV40: 提供VP外壳蛋白。,重组型SV40： 提供T抗原。,包装成的病毒颗粒中，既有含外源基因的重组型，又有助手型DNA。,(8) SV40混合传染过程,感染细胞，整合,用复制起点有缺陷的SV4

47、0病毒侵染的猴细胞株CV-1得到的。所以称COS（CV-1，Origin, SV40）,病毒不能复制，但能产生T抗源（类似重组型SV40）。 DNA整合到猴染色体上。所以COS细胞中只有T抗原，无游离的SV40DNA。,(9) COS细胞, COS细胞的特点：,有SV40的T抗原。有利于SV40来源的载体复制,利用COS细胞扩增外源基因,只保留SV40的复制起始区（ori）、早期区域（T抗原）的启动子、Poly A化位置以及t抗原的内含子。如pSV2:,a区: 1-323bp，SV40的复制起始区、T抗原启 动子、转录起始区。 b区：324-3369bp，pBR322的复制起始区、 氨苄青霉素

48、抗性基因。 c区：3370-4217bp，t抗原内含子（拼接信 号）、 Poly A化位置。 d区：外源基因插入位置。,(10) SV40 DNA载体,电刺激或脂质体转化法送入动物细胞。,不需要包装，可插入10kb以上的外源基因。 既能在大肠杆菌中增殖，又能转染哺乳动物细胞。 受感染的动物细胞不会裂解，能建立稳定的细胞株。,SV2的特点：,不能在猴细胞中复制（没有T抗原）。 在哺乳动物中存在的途径是整合到染色体上。,GPT：Glutamic-Pyruvic Transferase（谷氨酸-丙酮酸转氨酶，谷丙转氨酶）,pcDNA3,Invitrogen Corporation,CAT：chlor

49、amphenicol acetyl transferase（氯霉素乙酰转移酶）（用于分析表达量）,pcDNA3.1,pcDNA3.1CAT,2. 人乳多空BK病毒载体,人乳多空BK病毒（human papova BK virus）能以多拷贝（多于500拷贝）的染色体外双链DNA形式在培养的哺乳动物细胞中持续存在多代。,（1）构建穿梭载体,删除编码病毒核心蛋白和外壳蛋白的基因。,把病毒复制功能的基因插入到大肠杆菌 质粒中。,加入SV40的新霉素抗性基因Neor。,加入一个受细胞色素P450 dioxin诱导的增强子（doxin-responsive enhancer，DRE）。 加入一个DRE调控的小鼠乳腺癌启动子（MMTP）。,TCDD（2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-doxin）诱导表达。,基因工程总结,目的基因的获得,载体的提纯,重组载体的构建(酶切/连接）,转化/转染细胞的筛选,宿主细胞的转化/转染,宿主细胞的培养,目的基因的诱导表达,