外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备ppt课件.pptx

《外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备ppt课件.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备ppt课件.pptx（14页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备,染色体组型分析,实验目的,1、了解动物细胞培养的方法。掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。2、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。,实验原理,人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养。每1ml外周血中一般含有约13106个小淋巴细胞，几乎都处于G1期或G0期的非增殖状态，一般情况下是不再分裂的。但当在培养液中加入植物凝血素（PHA）后，淋巴细胞受刺激便转化为淋巴母细胞，重新进入增殖周期，进行有丝分裂。经过6672小时(三个周期)的短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂相细胞，从而进行染色体标

2、本制备和核型分析。,1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为122号，性染色体用X和Y标记；并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组，用大写字母AG表示。,人染色体组型及其特征,实验材料,1.1试验材料:人外周血淋巴细胞1.2试验用具:离心管、吸管，量筒、 载玻片，常规清洗烘干，培养瓶、1ml/5ml移液枪,灭菌处理， 天平、离心机、恒温培养箱、显微镜、普通冰箱，酒精灯。1.3试剂药品 完全培养基 凝血素(PHA ) 5mg/ml 肝素 0.

3、2,秋水仙素 50g/ml低渗液 0.35KCl固定液（Carnoy固定液） 甲醇冰乙酸（3l），临时配制 Giemsa染液 1份原液和10份磷酸缓冲液，临时配制 1/15M磷酸缓冲液 NaH2PO4&Na2HPO4NaHCO3 5%（无菌）PH试纸,磷酸缓冲液的配制,磷酸缓冲液PH4.49-9.18(1/15M)PH 甲液X(ml) 乙液Y(ml) PH 甲液X(ml) 乙液Y(ml)4.4 90 10 6.98 6 44.9 40.1 9.9 7.71 7 35.29 0.25 9.75 7.58 8 25.59 0.5 9.5 7.75 9 15.91 1 9 8.04 9.5 0.56

4、.24 2 8 8.2 9.7 0.36.47 3 7 8.54 9.75 0.256.64 4 6 8.68 9.9 0.16.81 5 5 9.18 10 0,乙液：一水磷酸二氢钠,1/15M溶液含9.2g/L甲液：二水磷酸氢二钠,1/15M溶液含11.864g/L根据要求的PH值,取X毫升甲液与Y毫升乙液,混合均匀即得.,实验步骤,1培养液的分装:在无菌室或接种罩内,用移液管将培养液和其它各试剂剂分装入玻瓶,每瓶量为 :完全培养基3mlPHA 20ul肝素 一滴用 5%NaHCO3调 pH 到 7.27.4,分装到 10ml的培养瓶中（5ml）,用塞子塞紧,置于 4 条件下 保藏。用前从

5、冰箱内取出,放入 37 恒温锅中温育 10分钟。选取2培养瓶标记A，B。,2采血:医院肘静脉采血200ul，迅速在无菌条件下将肝素化血液滴入至外周血培养基内。3培养:置 37温箱中培养 6872小时 。培养期间，定期轻摇匀，使细胞充分接触培养基。4秋水仙素处理:终止培养前24小时，用移液枪向A加入26ul，B加入39ul。轻轻摇匀后，再放入恒温箱内，继续培养23h。,5低渗处理:秋水仙素处理完毕后, 小心的从温箱取出培养瓶, 将培养物全部转入洁净离心管中，以1000rpm离心810分钟，弃上清液。然后加入温浴的低渗液 1毫升, 用滴管轻轻吹打成细胞悬液，补加7ml低渗液。 37水浴中低渗处理

6、20分钟。6预固定:加入0.5ml固定液（预温37C），轻轻混匀后1000rpm离心78分钟。弃上清液。7固定: 每支离心管中,加入固定液 3ml,2min后用 滴管轻轻冲打成悬液,在室温中固定 15分钟后离心,吸弃上清液。,8再固定:加入固定液 3毫升,用吸管轻轻打散,室温下继续固定 15分钟。离心，去上清液。9制片:留固定液 0.5毫升, 用滴管小心冲打成悬液。 从冰箱的冰格中或冰水中取 出载玻片,每片滴加悬液 13滴,吹散,在酒精灯火焰上过火。室温过夜。11染色:用磷酸缓冲液（PH7.4）稀释后的姬姆萨染色液染色 20分钟,然后倒去染液,用蒸馏水轻 轻冲洗 .12镜检:待稍干后,在显微镜下观察,先用低倍镜寻找良好的分裂相,然后再用高倍油 镜观察。,实验结果,核型分析表,核型分析步骤：,讨论,接种的血样愈新鲜愈好 , 最好是在采血后 24小时内进行培养 , 如果不能立刻培养 , 应置 于 4存放 , 避免保存时间过久 , 会影响细胞的活力 . 在培养中成败的关键 , 除了至为重要的 PHA 的效价外 , 培养的温度和培养液的酸碱度也十分重要 . 人的外周血淋巴细胞培养最适温 度为 370.5.培养液的最适 pH7.27.4. 制片过程中 , 如发现细胞膨胀得不大 , 细胞膜没 有破裂 , 染色体聚集一团伸展不开 , 可将固定时间延长数小时或过夜 .,