第五章 中药指纹图谱ppt课件.ppt

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1、,第五章,中药指纹图谱与特征图谱,大纲要求,掌握中药指纹图谱分析及评价熟悉中药指纹图谱研究程序及技术要求了解中药指纹图谱测定方法,同一个成药，疗效一致么？,不同厂家：不同工艺：不同辅料：,质量相差悬殊的连翘药材Great disparity of ingredients in different Lianqiao crude drugs,青翘老翘无籽老翘所含有效成分递减,相同处方，不同工艺，疗效？,2022/12/23,7,目前中药质量控制的局限,齐墩果酸、熊果酸、大黄酸、槲皮素、小檗碱, 缺乏化学对照品, 化学对照品缺乏专属性, 物质群体间的量化特征无法体现, 中药整体的用药的特色无法体现,

2、第一节 概述,中药色谱指纹图谱的提出,中药依赖其所含的多种化学成份发挥疗效任何单一的活性成份或指标成份都难以有效地评价中药的真伪优劣利用现代分析技术分析不同中（成）药的整体特征以提高鉴别的准确性,指纹图谱分析（Chromatographic Fingerprint Analysis）,第一节 概述,定义: 中药指纹图谱是指中药经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该中药特性的共有峰的图谱，是一种新的中药质量控制模式。 中药指纹图谱的基本属性：整体性和模糊性。整体性：强调多个成分（共有指纹峰）的相对稳定的比例、排列顺序及相互的牵制，反映的质量信息是综合的。模糊性：中药化学成分复杂性+次

3、生代谢产物化学成分不确定性，具有无法精密度量的模糊性。,中药特征图谱的提出,定义: 中药特征图谱是指中药经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其中各种组分群特征的共有峰的图谱，是一种新的中药质量控制模式。,中药指纹图谱和中药特征图谱均以表征中药内在质量的整体变化为评价目的,图谱分析：强调准确的辨认，而不是精密的计算。 图谱比较：强调的是相似性，而不是相同。特点：(1)通过指纹图谱或特征图谱的特征性，能有效鉴别中药的真伪。(2)通过指纹图谱或特征图谱主要特征峰的面积和比例的制定，能有效控制中药质量，保证中药质量的相对稳定（即稳定性和均一性）。,指纹图谱的作用,对中药质量标准的补充和提高

4、。控制原料、中间体、成品的一致性，控制工艺，减少批间差异。,指纹图谱的特性,稳定性（重现性）,特征性,在规定的方法与条件下，不同的操作者和不同的实验室应能重复,能反映中药有效部位所含大部分成分的种类，或指标成分的全部,能特征地区分中药的真伪与优劣,整体性（模糊性）,指纹图谱中应包含的信息,中药材和中药饮片：种的共性产地、采收期、炮制方法的个性信息。半成品和中药制剂：原药材（甚至辅料）的信息工艺信息等。药效信息,(二) 指纹图谱的发展现状,1.指纹图谱的发展阶段： 初级阶段: 是确立指纹图谱的建立方法及相似度判定。研究重点主要是测定方法的建立，方法稳定性和适用性考察，化学有效部分基础研究，图谱多

5、指标控制等，力求基本说清中药化学基础及质量控制参数，将中药质量控制提到整体量化的高度。,高级阶段: 即指纹图谱特征和药效相关性研 究，指纹图谱的生物等效性研究。 中药指纹图谱的研究向多学科的相互渗透、从单指标向多指标（多维多息）的综合发展，最终建立体现谱效关系的指纹图谱，确保中药安全、有效和可控。,国内，目前还处在初级阶段。1.针对中药注射剂这一相对简单的体系，进行大量研究和深入探讨。2.利用指纹图谱手段表征中药注射剂的特性，表达成品的质量，以达到控制工艺操作和原药材的目的，利用指纹图谱追寻工艺操作中的问题和实现对原药材GAP的质量要求。3.通过对大量注射剂的指纹图谱研究，建立系统的测定方法和

6、全面的指标控制参数，寻找一定的数学模型，最终达到指纹图谱的可操作，可控，稳定，显性和量化的目的，提高整个中药注射剂的质量控制水平。4.逐步建立其它类中药制剂，中药复方制剂的指纹图谱。,2.指纹图谱的分类,指纹图谱可按应用对象、测定手段进行不同的分类。按应用对象分类： 中药材(原料药材)指纹图谱中药原料药(包括饮片、配伍颗粒)指纹图谱中药中间体（工艺生产过程中间产物）指纹图谱中药制剂指纹图谱,按测定方法分类: 中药化学指纹图谱 指纹图谱系指采用色谱、光谱和其他分析方法建立的用以表征中药化学成分的特征的指纹图谱。中药化学指纹图谱对控制中药质量具有更直接、更重要的意义。 色谱指纹图谱：TLC、GC、

7、GC-MS、HPLC、HPLC-MS等光谱指纹图谱：UV、IR、FP、NMR、MS等,中药生物指纹图谱包括：中药材DNA指纹图谱 中药基因组学指纹图谱 中药蛋白组学指纹图谱中药材DNA指纹图谱主要是测定各种中药材的DNA图谱，由于每个物种基因的唯一性和遗传性，中药材DNA指纹图谱可用于对中药材的种属鉴定、植物分类研究和品质研究。它对中药材GAP基地建设、中药材种植规范(SOP)、选择优良种质资源和药材道地性研究极为有用。,中药基因组学图谱和中药蛋白组学指纹图谱系指用中药作用于某特定细胞或动物后，引起的基因和蛋白的复杂的变化情况，这两种指纹图谱可称为生物活性指纹图谱。 中药蛋白组学指纹图谱是指纹

8、图谱研究的最高级阶段，可确定中药的主要活性物质。,第二节 中药指纹图谱研究程序及技术要求,（一）指纹图谱的要求 中药指纹图谱应满足特征性、重现性和可操作性的技术要求（即三性要求）。,当一张指纹图谱不足以表现其全部特征，可用几张指纹图谱来表现某种中药(药材或复方)的各个不同侧面的特征，从而构成其全貌。对每一张图谱都应有其特征性。,丹参滴丸多元HPLC指纹图谱,指纹图谱I (280nm),指纹图谱II (203nm),首先具备专属性或唯一性。能够表达某品种特征的性质。在满足专属性前提下要有较好的重现性，指同一品种的同一样品，同一操作条件下，结果的重现性要好，即不同实验室和不同操作者得到的色谱整体特

9、征应有较高的相似度(0.9以上)。具有可操作性。指针对不同用途，选用不同分析方法来达到不同的要求，选择的方法和试验条件应便于推广和便于操作，要有普遍适用性。,（二）指纹图谱的构建方法,1、色谱法 色谱技术具有极强的分离能力和极大的适应性，中药指纹图谱首推色谱法，其常用的方法有： TLC、GC、HPLC、HPCE、SFC等。,薄层色谱Thin Layer Chromatography (TLC),可在同板同时分析多达18个样品，时效高所用的是正相展开剂，其组成变化灵活，可适应多种成分的分离既可直观比较图谱，又可扫描得到轮廓图和处理数据具有色彩参数，可获得色彩丰富的色谱图像，直观性强；同时辅以功能

10、团显色剂还可提示成分的类别，提高鉴别的专属性。离线操作，占机时间短,展距局限10cm20cm ，柱效相对较低，对复杂组分不提高分离度则难以提取指纹特征的药材受到限制。开放系统，对环境温度、相对湿度要求较高,反相高效液相色谱法 Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography,适用范围广分离性能好分析速度快流动相选择范围宽灵敏度高色谱柱可多次重复使用流出组分可以收集采用多种检测器，可同时获取保留值信息和化合物的光谱、质谱信息,对较为复杂的色谱实验条件要求比较苛刻，由此带来不同实验室之间重现性的难度增大,诃子指纹图谱,诃 子,小诃子,大诃子

11、,绒毛诃子,气相色谱Gas Chromatography (GC),分离效能高分析速度快适用于植物的挥发油成分及其它易挥发性成分或可转化为可挥发的成分测定可提供保留值信息，与质谱联用，还可提供更丰富的化学结构信息,分辨率高，得到的色谱组份非常复杂，尤其是含挥发油药材，单萜类成分组成很不稳定，样品间差异可能很大，处理数据和判别相似度时一定程度的取舍,毛细管电泳Capillary Electrophoresis,分离效能高分析速度快高分辨率可与紫外、荧光、电化学、质谱、拉曼光谱等联用，可提供更丰富的化学结构信息,肉桂油的气相色谱指纹图谱,HPCE指纹图谱,红外光谱 Infrared Spectra

12、,几乎所有的物质都有特征的红外光谱。虽然植物中药提取物还是一个混合物，但是由于不同物质的红外光谱具有加合性，因此，植物中药提取物的红外光谱能反映出所有成分的综合信息因而具有全息光谱的特点。,操作简便（不需要复杂的提取仪器）、快速、准确、经济、溶剂低毒、重复性高、实用性强。,中国药典规定：小蓟在开花时采。 根据1384cm-1处吸收峰的有无，可以鉴别其采集时间是否正确。,小蓟丁酮提取物的红外指纹图谱,中药指纹图谱的研究程序,一、研究方案设计 1、研究对象的确定 君药、臣药中有效成分作为主要研究对象,2、研究内容样品收集：要求有一定的数量，以保证供试品的代表性和均一性溶液的制备：包括对照品溶液和供

13、试品溶液的制备。检测方法确立：包括测定方法、供试品溶液制备的提取条件、测定条件等筛选。方法学考察试验：包括精密度试验、稳定性试验、重复性试验以及图谱采集记录时间的考察试验。标准制定 ：根据多批次样品测定图谱，建立共有模式，制定评价指标等。,二、样品收集 样品收集是研究指纹图谱最初也是最关键的步骤，收集的样品要有足够的代表性。要求收集10批次以上的样品。样品数越多越好，使得到的指纹图谱更具生物统计学意义。,最关键的步骤 真实性 代表性10批以上 原药材 ：不同产地、不同采收季节等,样品收集原则： 1）正品优质道地药材，或规范化种植药材。 2）结合临床使用情况选择性收集药材样品。 3）不同产地、不

14、同采收期药材样品（指导实际合理“勾兑”过程） 。 4）中间体、中药制剂的样品收集，应选择工艺稳定、疗效恒定、临床使用中很少异常的批次。,注意：收集药材样品“批次”，其含义与工业产品“批次”的含义是完全不同的，它是指相互独立的样品，即不能将同一地点或同一渠道同一时间获得的样品分成若干批次样品。不同产地或同一产地不同等级规格的样品，均可视作不同批次。同一产地的样品，存在不同的种植园和地块之差异，也均可视作不同批次。,三、供试品溶液的制备 根据中药中所含化学成分的理化性质和检测方法的要求，选择适宜的制备方法。制备方法必须确保中药中的主要化学成分或有效成分在指纹图谱中得以体现。,原药材、饮片供试品溶液

15、的制备 尽可能与生产工艺的提取溶剂接近或一致，定量操作 半成品/中间体供试品溶液的制备 参考制剂和产品制备工艺 中药制剂供试品溶液的制备 直接使用、稀释或溶剂提取的方式,四、 对照品(参照物)溶液制备,建立指纹图谱应设立参照物或参照峰。 对照品作为参照物：常为供试品中主要成分 或者峰面积相对较大、较稳定的共有峰（内参物）制备：根据检测方法的需要，选择适宜的方法进行。,五、研究方法的选择,包括指纹图谱试验方法和试验条件的优选，是通过比较试验，从中选取相对简单易行的方法和条件，获取足以代表品种特征的指纹图谱，以满足指纹图谱的专属性、重现性和可操作性的要求，并须经过方法学验证。,首选色谱方法，其中H

16、PLC法适用范围广，对含生物碱、蒽醌、黄酮、有机酸、酚类、木脂素等成分的中药均可采用。 (一) 测定条件的选择 提取条件、色谱条件需进行优化，在定量操作的前提下，使供试品中所含成分尽可能地被提取并获得分离，即分得的色谱峰越多越好，使中药的内在特性都显现出来，为中药指纹图谱评价及其品质鉴定提供足够的信息。, 液相色谱 色谱柱：比较试验加以选择,流动相比较,适宜的柱温和检测波长,15,20,25,30,35,203,210,236,254,365,(二) 方法学验证,1. 精密度试验： 主要考察仪器的精密度。取同一供试品溶液，连续进样5次以上进行检测，各共有峰峰面积比值的RSD3，各共有峰的相对保

17、留时间应在平均相对保留时间1min内。或用“中药指纹图谱相似度计算软件”计算，相似度应大于0.9。,2.稳定性试验： 主要考察供试品的稳定性。取同一供试品溶液，分别在不同时间检测（0、1、2、4、8、12、24、36、48h），考察色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性，确定检测时间。或用“中药指纹图谱相似度计算软件”计算，相似度应大于0.9。,3.重复性试验： 主要考察实验方法的重复性。取同一批号的样品5份以上，分别按照选定的提取分离方法制备供试品溶液，并在选定的色谱条件下进行检测，各共有峰峰面积比值的RSD3，各共有峰的相对保留时间应在平均相对保留时间1min以内。或用“中药指纹图谱相似

18、度计算软件”计算，相似度应大于0.9。,4. 指纹图谱的记录时间考察： 如采用HPLC或GC法一般为60min。但实验中，应记录2小时的色谱图，考察1小时以后的色谱峰情况，以确定记录时间。,指纹图谱的建立,根据足够样品数（10批次以上）测试结果所给出的峰数、峰值（积分值）和峰位（保留时间）等相关参数，确定共有指纹峰（相对保留时间、峰面积比值），选取特征指纹峰群（色谱峰组合），制定指纹图谱。采用阿拉伯数字标示共有峰，用“S” 标示参照物峰。,中药材指纹图谱要对不同产地、不同等级规格或不同采收季节等的代表性样品进行分析比较，从中归纳出中药材共有的、峰面积相对稳定的色谱峰作为特征指纹峰。对于多来源的

19、中药材，必须考察品种间的特异性。 中药制剂指纹图谱的建立，要将原药材、半成品、成品之间的图谱进行比较，考察相互之间的相关性。,指纹图谱的辨认应注意指纹特征的整体性，从整体的角度综合考虑，注意各具有指纹意义的谱峰之间相互的依存关系。 指纹图谱的评价指标是供试品指纹图谱与该品种对照用指纹图谱(共有模式)及供试品之间指纹图谱的相似性。 相似性比较可以用“相似度”表达，一般指纹图谱相似度计算结果在0.91.0(或以90100表示)之间即符合要求。,指纹图谱的相似性从两个方面考虑:色谱的整体面貌是否相似，以判断样品的真实性；供试品与对照样品或“对照用指纹图谱”之间及不同批次样品指纹图谱之间总积分值作量化

20、比较，如总积分面积相差较大(如20%)，则说明同样量的样品含有的内在物质有较明显的“量”的差异，这种差异是否允许，应视具体品种、具体工艺的实际情况，并结合含量测定项目综合判断。这种比较应在同一台仪器平行进行测定。,中药指纹图谱分析及评价,根据指纹图谱所获取的信息，建立指纹图谱分析比较的重要参数，如共有峰、重叠率、n强峰、特征指纹等；计算特征指纹的相似率与差异率，进行指纹图谱评价；应用相似度分析、主成分分析、聚类分析或人工神经网络等计算机技术，进行解析、识别图谱信息以及图谱相似度评价，以建立可行、实用的中药指纹图谱量化评价标准。,（一）重要参数的建立,1. 共有指纹峰 中药指纹图谱中，多个样品所

21、具有的相同相对保留值的色谱峰，即为共有指纹峰。(1) 共有指纹峰的相对保留时间：相对保留时间=tR/tRs。,图5-2 大黄HPLC指纹图谱,(2) 共有指纹峰面积比值：指纹峰面积比值=A/As 各共有指纹峰的面积比值必须相对固定。 未达基线分离的共有峰，以该组峰的总峰面积计，同时标定该组各峰的相对保留时间。非共有峰：供试品的图谱与指纹图谱比较，共有指纹峰以外的相对保留值不同的色谱峰。,特征指纹峰 所有供试品图谱中均存在的色谱峰，可以认为它们是该中药品种所特有，故又称之为特征指纹峰。 特征指纹是指由一系列特征指纹峰所组成的固定峰群，从多组分的角度来反映中药内在特征，为原药材或饮片品种鉴定，特别

22、是同属不同种或含相同有效成分不同种的药材的鉴别，提供更多更细致的信息和依据。,要求“准确的辨认”而不是“精密的测量”；比较供试品与对照品的色谱指纹图谱要求“相似”而不是“相同”。评价色谱比较的结果，是根据其模糊属性，着眼于宏观的规律性的特征分析，即着重辨认完整色谱的“图貌”，而不是求索细枝末节。,计算机辅助相似度评价,第三节 中药指纹图谱研究实例,例1 中药大黄指纹图谱研究(一) 基源 为蓼科植物掌叶大黄Rheum Palmatum L.、唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim. ex Balf.或药用大黄Rheum officinale Baill.的干燥根及根茎。(二) 产

23、地 掌叶大黄主产于甘肃、青海、西藏、四川等地；唐古特大黄主产于青海、甘肃、西藏及四川等地。二者商品均称为“西大黄”、“北大黄”。药用大黄主产于四川、贵州、云南、湖北、陕西等地，商品称为“南大黄”、“川大黄”。商品以掌叶大黄产量大，唐古特大黄次之，药用大黄少见。,据产地考察及调查，甘肃庄浪、礼县大黄种植面积约6666.67km2，年产量约5万吨，资源十分丰富。,甘肃主产区大黄资源分布图,(三) 化学成分 主含蒽醌类成分：大黄酸(rhein)、大黄素(emodin)、大黄酚(chrysophanol) 、芦荟大黄素(aloe-emodin)、大黄素甲醚(physcion)、番泻苷A、B、C、D、E

24、、F(sennoside A、B、C、D、E、F)、大黄酸-8-葡萄糖苷(rhein-8-mono-D-glucoside)、大黄素甲醚葡萄糖苷(physcion monoglucoside)、芦荟大黄素葡萄糖苷(aloe-emodin monoglucoside)、大黄素葡萄糖苷(emodin monoglucoside)、大黄酚-1-葡萄糖苷(chrysophanol-1-monoglucoside)。还含苯丁酮苷类、鞣质及相关的多元酚类等成分。,(四) 实验仪器和材料仪器: Agilent1100液相色谱仪，DAD检测器；样品: 大黄采自甘肃省华亭、庄浪、礼县、宕昌四县，共15份样品，采

25、集时间为2001年11月，经品种鉴定为掌叶大黄。对照品: 没食子酸(gallic acid)、大黄素(emodin)均由中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用，纯度分别为98.14%、99.02%。试剂: 乙腈（美国Tedia公司，色谱纯）、甲醇（上海化学试剂有限公司，分析纯；Tedia公司，色谱纯）、冰醋酸（南京化学试剂一厂，分析纯）、重蒸去离子水（实验室制备）。,(五)供试品溶液制备 精密称取大黄供试品粉末(过20目筛) 2g，加入甲醇50ml，水浴(80)加热回流1h，滤过。残渣加甲醇50ml，水浴(80)加热回流1h，滤过，合并两次滤液。置蒸发皿中，水浴挥去部分溶剂，加甲醇溶解并定容

26、至25ml。用微孔滤膜（孔径为0.45m）滤过，滤液作为供试品溶液。(六)参照物溶液制备 精密称取没食子酸、大黄素对照品各5mg，用甲醇溶解并定容至25ml，配成0.2mg/ml的溶液，再将该溶液稀释10倍，作为参照物溶液。,(七)色谱条件 色谱柱:Inertsil ODS-3分析柱(250mm 4.6mm，5m) 流动相: (A)1%HAc-H2O与(B)1%HAc-CH3CN梯度洗脱 055min B（）025 5575min B（）2555 7590min B（）5585 流量:1.0ml/min 柱温: 30 检测波长: 280nm 参比波长:380nm 分析时间: 90min,(八)

27、方法学考察 1. 精密度试验 取同一批次供试品（9号样品：庄浪大黄），连续进样5次，考察色谱峰相似度的一致性，用“中药指纹图谱相似度计算软件”计算，结果相似度大于0.9，表明仪器精密度良好。 2. 重复性试验 取同一批次样品（9号样品：庄浪大黄），按上法分别制备5份供试品，平行测定，考察色谱峰相似度的一致性，用“中药指纹图谱相似度计算软件”计算，结果相似度大于0.9，表明实验重复性良好。,3.稳定性试验 取同一批次供试品溶液（9号样品：庄浪大黄），分别在0，2，4，7，11，16，22，29，36h不同时间点进行检测，用“中药指纹图谱相似度计算软件”计算，结果相似度大于0.9，表明供试品在36

28、h内稳定。 (九)供试品溶液测定 同一上述实验条件，测定10批次供试品HPLC色谱图。,(十)指纹图谱及技术参数 1.指纹图谱的建立 根据10批次供试品溶液测定结果所给出的峰数、峰值（积分值）和峰位（相对保留时间）等相关参数，进行分析比较，制定优化大黄指纹图谱。见图5-2，彩图5。,彩图5 大黄三维HPLC指纹图谱,2.共有指纹峰的保留时间及峰面积 大黄HPLC可分离出约90个色谱峰，经与参照物对照以及比较所有测定记录的色谱图，选取其中10个共有峰作为指纹图谱的特征峰。其保留时间（min）、峰面积见下表：,3. 共有指纹峰标定 根据10批次供试品溶液测定结果，标定共有指纹峰。大黄HPLC指纹图

29、谱中，共有指纹峰10个。与大黄素参照物S峰（10号峰）相比，其他9个共有指纹峰相对保留时间依次为：0.095(1)、0.117(2)、0.2369(3)、0.403(4)、0.557(5)、0.675(6)、0.689(7)、0.694(8)、0.794(9)。 4. 共有指纹峰面积比 4、5号共有指纹峰面积为共有指纹峰总峰面积的65%，规定4号峰相对峰面积比值为13.736025.5096。5号峰相对峰面积比值为19.704136.5933。,5. 相似度评价 将测试数据导入中药指纹图谱相似度计算软件，经选峰，设定匹配模板，将谱峰自动匹配；然后设定标准模板，进行谱峰差异性评价和整体相似性评价。掌叶大黄HPLC指纹谱共有模式如图5-3；华亭、庄浪、礼县、宕昌四地样品的相似度较高，大多在0.850.95之间，说明四地大黄之间既有较好的相关性，又有区别。,图5-3 掌叶大黄HPLC指纹谱共有模式图,小结,中药指纹图谱是一种量化的鉴别手段。指纹图谱必须符合整体性、特征性、稳定性的基本要求。指纹图谱与药效相结合才有现实意义。特征指纹峰的含量测定结合指纹图谱是理想的质量控制模式。,Thank you!,