第五章 STR自动分型解析ppt课件.ppt
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1、第六章 STR自动分型,STR自动分型,特点:自动化程度高 快速、灵敏、准确、稳定 重复性好核心:建立多基因复合扩增体系时采用3-4种荧光染料分别标记不同的STR基因座引物,同一种荧光染料标记的STR基因座扩增产物大小不重复。复合扩增产物的片段分离识别及各个等位基因命名由自动化设备完成。,荧光标记STR复合扩增,实质:采用四、五种荧光染料,其中一种用于染料与复合扩增产物混合后同步电泳的分子量内标DNA片段,余下的3或4种染料颜色标记STR基因座。 荧光染料标记在引物的5端,扩增后使相应PCR产物的一条链均携带标记引物的荧光染料。使扩增产物在检测设备上易识别。注意事项: 同一荧光标记的不同STR
2、的等位基因片段范围不能重叠,前一个STR最大的等位基因与后一个STR最小的等位基因相距最少10bp。 在一个荧光复合扩增体系中,组合荧光染料的发射波长相差越大越好。,荧光标记的分析方法,荧光法:亦称荧光PCR技术(fluoresencePCR, F-PCR),是1995年由美国PE公司首先研制成功。在荧光染料与引物保持完整时,荧光报告基团的荧光被荧光抑制基团淬灭,而在荧光染料与引物分离后,荧光报告基团才发出报告荧光,且荧光的强度与PCR产物的数量呈正比。荧光检测仪器透过PCR管壁能直接检测到荧光信号的波长和长度变化。荧光法融汇了PCR的灵敏性、DNA的特异性和光谱技术精确定量的优点,电脑同步跟
3、踪,数据自动化处理,直接探测PCR过程中的变化以获得定量的结果,不需要做PCR后处理或检测,完全闭管操作。,荧光标记方法示意图,毛细管电泳图谱,步骤,步骤:1 多色荧光标记STR复合扩增。2 扩增产物电泳前进行处理。3 毛细管电泳分离STR片段,激光诱导的荧光检测,由设备检测并数据化存储。4 自动数据采集并分型。荧光颜色分离,计算片段大小,确定各个等位座的基因分型。,毛细管电泳,毛细管电泳仪的基本结构包括高压直流电源,荧光激发光源,荧光检测器,自动样品盘和控制进样、电泳、检测与记录的计算机。适用范围:能够检测100500bp范围,长度相差1bp的两个DNA片段。,分离DNA片段的机制,毛细管中
4、的聚合物溶液在一定的浓度下形成筛网状结构。DNA片段在溶液中泳动时,不同片段DNA受到的阻力不同,小片段较大片段受到阻力小,易通过。变性的DNA片段电泳迁移率与片段的大小表现为线性关系。,荧光标记STR基因分析技术是利用荧光标记的引物在PCR扩增STR基因座时,使PCR产物的一条链带上荧光标记。这种带有荧光分子的DNA片段在凝胶中从阴极向阳极迁移,按片段长度大小排列,当迁移到阳极端的激光扫描仪的扫描窗口,荧光染料受到激发,发出一定波长的光,按荧光强度记录下来,每一个带荧光染料的DNA片段电泳轨迹按各自通过激光扫描窗口的实际时间被记录下来,以荧光吸收峰来表示每一个片段。峰值越高,表示该片段量越多
5、;峰出现的时间与片段大小有直接关系,片段越小,峰越早出现。计算机保存所有片段通过扫描窗口的实际时间及其荧光特征。,过 程,ABI 310 的检测路径图,ABI310遗传分析仪 (310 Genetic Analyzer),毛细管电泳原理,电泳上样前样品处理,变性对检验结果的影响 对近百份血液(斑)、精斑、烟头及组织等生物样品分型结果进行比较发现,使用310电泳时,样品变性与否不影响检验结果,可简化了检验方法。310上样样品组成为12ul去离子甲酰胺、0.3ul0.5ul ROX及lul PCR扩增产物,混匀后即可上样电泳。电泳前未变性而得到与变性一样检验结果的原因可能为:第一去离子甲酰胺(中性
6、或弱酸性)本身有变性作用;第二于7M尿素变性聚丙烯酰胺凝胶毛细管电泳中60 电泳时本身可使样品变性;第三上述一、二的联合作用。,甲酰胺及ROX对检验结果的影响,长久暴露于空气中的去离子甲酰胺被氧化成甲酸盐,后者在电泳进样时有两个不利作用,一是甲酸盐会与PCR产物中的DNA竞争吸附于毛细管上,减少PCR产物中DNA上样量.二是甲酸盐本身会淬灭荧光,这两个作用的结果是降低毛细管电泳检测灵敏度,使本该能检见PCR扩增产物的结果表现为阴性。PCR扩增后模板DNA量会成千上百万倍增长,有时分析结果时虽可以看到很高PCR峰,但无法分析这些结果,原因是甲酸盐竞争的结果使ROX进样量很少(甲酸盐也能降解DNA
7、),无法比对分析。所以,去离子甲酰胺应分装于0.5ml离心管内,冰冻保存,防止氧化,每次使用一个;电泳时ROX用量应合适,太多则浪费,太少则电泳顺序越靠后的样品,有可能无法分析结果。去离子甲酰胺较甲酰胺纯度为高,可增加毛细管电泳检测灵敏度。,DNA 分型,电泳对荧光颜色不同的DNA片断的峰进行长度检测,并对应不同的颜色。DNA片断与内标比较后确定长度。最后与以同样方式确定的等位基因Ladder比较,得到未知样本的PCR产物片断分型。,310分析原始图谱 (Raw data),STR等位基因分型流程,数据收集,确定峰,标记峰,与Ladder对比,Genotype读取等位基因,颜色分离,分析者浏览
8、数据,确定结果,GeneScan,Genotyper,光谱分离前的现象,荧光检测器对多色荧光信号进行检测时,荧光染料间的发射波长差值越小,不同的荧光染料间存在明显的光谱交叉重叠,光谱交叉重叠形成的干扰信号就越强。当干扰信号达到和超过数据分析设定的阈值时,就被误判为一个片段峰,一个荧光标记在不同荧光在相同的位置上显示大小不同的伪峰、无法识别片段。,光谱分离,概念:每种荧光染料标记的特殊颜色的一系列片段峰单独区分出来,同时消除不同颜色间的干扰峰,这个处理过程就叫光谱分离。步骤:1 设定一个判断信号峰的信号强度阈值。 根据一个峰信号最强的颜色,将该峰归到相对应的颜色组中,就可以把峰信号归到不同的颜色
9、组中。 2 消除一种颜色峰中的存在的其他的干扰信号。 重点:建立matrix文件 根据Matrix数值表,消除干扰信号,只保留单一、最强的颜色峰。该峰的峰高和面积在处理前后无变化。,matrix文件,Matrix数值表:用来定量表现荧光片段峰中各种颜色信号强度相对的比例关系的数值表,在STR荧光标记检测分析技术中称为Matrix数值表。matrix文件:由此数值表构成的相应计算机文件称为matrix文件。matrix文件是在电泳matrix标准品时,计算各种颜色峰之间的平均干扰强度值而获得。注意事项:当更换缓冲液、毛细管、激光管、荧光检测器等物时,需重新建立matrix文件。,矩阵处理(Mat
10、ix),Matrix及Ladder对结果分析的影响,1 对于使用仪器,国外实验室通常做法是一般每隔36个月做一次Matrix,以有利于得到准确的分析结果。2 每次电泳时都应同时电泳Ladder,如果采用以前做的Ladder分析Profiler plus9个STR位点时,大部分检材大片段STR位点D18S51、D7S820在3l0上均能自动标上等位基因名称时,仍可采用该Ladder分析电泳结果。如果多数等位基因表现为OL Allele(offladder allele)则应考虑重新电泳Ladder。,毛细管的更换,ABI公司早先推荐检验STR的毛细管电泳次数为100次,以后又提高到200300次
11、。大量使用后认为,一般情况下,每根毛细管电泳可超过千次。更换毛细管的条件为:首先电泳时引物峰出现后吸收值基线高于2048RFU以上;其次TH01 9.3、10等位基因无法区分;其三在其它条件均不改变的条件下,分析已知血斑结果时,杂峰多。其中第二点最为重要。,DNA片段分子量计算,分子量内标:含有一系列已知碱基数的标记DNA片段。内标片段的电泳相对时间数据,描述了各个已知碱基数的内标DNA片段电泳迁移速度与片段大小的关系。利用已知碱基数的内标DNA片段与电泳获得的相对时间值,可建立一个直线回归方程。已知一个未知片段电泳获得的相对时间值,就可通过方程式得知未知片段大小。注意事项:未知片段不能超出内
12、标长度的范围。,内标,红色峰的片段大小,等位基因分型,Ladder:包含扩增体系中每个基因座的全部的已知等位基因。Ladder中每个基因座等位基因的荧光标记与未知样本扩增产物的标记种类相同。Ladder经颜色分离和计算分子量大小后,程序对Ladder中的等位基因命名。未知样本数据中的各种颜色及每种颜色各片段与Ladder中的相应的颜色和等位基因范围相比较,通过比较样本中的片段与Ladder中等位基因相同,如相同,就用该等位基因命名,不同,就识别为off-ladder。,Figure 5.6, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition
13、 2005 Elsevier Academic Press,通过与等位基因标准比对来进行STR分型 (STR genotyping is performed by comparison of sample data to allelic ladders ),DNA分型图谱,分型标准品等位基因命名错误,在ladder中,每个基因座的各个等位基因的量不是完全相等,电泳检测时,其相应的信号强度也不同。若某个基因座的某个等位基因片段相对较少,电泳时上样量又偏少,峰的阈值设置过高, ladder中该等位基因未能被正确识别。在对ladder进行等位基因命名时,相应基因座的等位基因全部或部分命名不能被命名或
14、错误命名。,Figure 5.6, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition 2005 Elsevier Academic Press,如果这个未识别的等位基因是ladder中某个基因座的第一个等位基因,计算机系统就会把第2个等位基因错误的命名为等位基因1.,该基因座的样本的等位基因也必然减少1个等位基因命名。如果在某一个基因座的第1个等位基因前出现伪峰,这峰是由于PCR扩增滑脱造成的。当上样量过大或峰阈值设置过低的,这伪峰就误认为是该基因座的等位基因1.该基因座的样本的等位基因也必然增加1个等位基因命名。,处理方法,为防止这种错误
15、出现,要求STR分析中,每次检测电泳时需要同时分析一个已知对照DNA样本。,内标识别错误,现象:内标信号太低,标准品峰信号太低,电泳系统不能有效分辩相邻的两个等位基因的情况下,自动分型系统将不能完成对分型标准品的数字化命名。原因:信号太低,分析范围设置错误和电泳数据不全。,处理方法,1 信号低 通过调整阈值可正确识别内标,或重新电泳。2 分析范围设置错误 通过调整分析范围纠正。3 电泳数据不全 通过修改分子量内标参数可以正确识别内标。,基线跳跃或摇动,现象:基线跳跃或摇动可使基线太高,超过阈值峰,程序将把这些超过阈值的基线识别为无数个峰片段,在图谱上标为off-ladder.原因:分析调用的m
16、atrix文件错误或者不适合。尤其是信号过强时。处理方法:避免盲目增加电泳上样量,信号过强,应降少上样量或稀释产物。理想的峰值在1000-3000之间。,Stutter带,概念:在STR分型图谱中,常常在一个目标STR等位基因峰前少一个重复单位的位置出现一个信号较弱的峰,这种额外的峰就是由于PCR过程中的复制滑脱形成的扩增片段,称为阴影峰。Stutter带形成原因是PCR扩增时有时Taq酶滑脱,导致某些PCR产物比正常PCR产物少一个重复序列 。Stutter带峰高一般是正常PCR峰高的15%以下,对于非混合样品,Stutter带很易区分,Stutter带总是位于阴极侧,量少(峰低)且少于主峰
17、一个重复单位。在同一位点,Stutter带的出现机率随着等位基因片段的增大或者扩增体系中DNA量的增加而增加 。对于混台样品,尤其是随机混合的现场检材,则判断混合等位基因时应慎重。,处理方法:减少样本DNA模板,或者减少电泳的上样量以降低峰信号强度。提高峰阈值或采取锋信号过滤,就可以消除Stutter带。,非模板依赖加A,现象:在DNA聚合酶能够在扩增产物的3末端非特异性地连接一个腺苷酸。 Profiler Plus及Cofiler试剂盒28个循环后需延长6045min,其目的是使3末端未加A PCR产物加A ,如果省略6045min,则在扩增时同一等位基因部分会未加A,表现为双峰。双尖峰:同
18、一个等位基因形成加A PCR产物片段与未加A PCR产物片段,在电泳分析时被识别为2个峰, 2个峰基部融合为一个峰,这种尖部分分叉形成两个峰尖,称为双尖峰。,形成原因:模板过多、含有PCR抑制剂、酶过少或酶活性减低。一般小片段的等位基因内多见。如果大片段出现双尖峰,可能是该基因座出现等位基因变异。比较同一样品是否省略6045min的检验结果,分型无差异(见图1),但FGA23.2、23.3、24及D21S11 30.2、30.3、31及TH01 9.3、10等位基因分型时应慎重。模板DNA太多时也会使PCR扩增产物部分等位基因未加A,电泳结果也可表现为双峰,用Profiler Plus试剂盒P
19、CR扩增是否省略60 45min对检验结果的影响,其他伪峰,现象:当设备电流输出出现短暂跳动时。在数据峰图上会出现信号基线的突然跳动。表现为图峰突然抬高的断层式图峰,可能识别为片段峰。特点:左侧近似直线抬高,达到峰尖后稍慢回落。呈现楔形。每种颜色在相同的位置都会类似的峰。,当电极缓冲液中有带负电固体颗粒,信号峰上出现棒状图形。(直线上升,直线下降)处理方法:过滤电极缓冲液。,性别识别图谱异常,Amelogenin基因座常用于鉴定样本性别。偶尔会存在Amelogenin基因座区域的基因变异或缺失。出现错误结果。男性样本只检出X或Y。处理:加做Y-STR.,峰的均衡性,一般情况下,纯合子的峰高和面
20、积比杂合子的高, 但相差不会超过30 。两个杂合子的峰高和面积相当。实际上,在两个杂合子等位基因中,小片段的峰高大于大片段的。原因是扩增不平衡。有些检材9个STR位点等位基因均与对照样品一致,但检材中每个位点内等位基因之间峰高相差远远大于30 。这主要是因为DNA模板量太少,等位基因不平衡扩增所致,这时应重新或加大模板量后再进行PCR扩增,或者用有机法重新提取DNA后再扩增,一般可以解决上述问题。若出现两等位基因的峰高相差超过70%,就要考虑混合样本。,杂合性丢失或3等位基因,杂合性丢失:在杂合子中,只出现了一个等位基因,但它的峰高和面积与其他的杂合子的等位基因相似。判断杂合性丢失:同一基因座
21、重新设计引物,或与亲缘鉴定出现矛盾。3等位基因:一个基因座出现3个等位基因。分析:如果有多个基因座出现3个或4个等位基因,说明样本污染。如果一个基因座出现3等位基因。说明基因突变。,某三甲医院委托鉴定是否存在交叉污染现象,采用16个基因座系统检测。 结果显示:该细胞在4个基因座出现三等位基因现象,说明有其他人类细胞交叉污染。,3 等位基因(二),分析3l0电泳结果,有时一个样品Profiler Plus系统的78个STR位点均为单纯检材,仅12个STR位点表现为混合检材,即一个位点出现3个等位基因。遇到这种情况,可将该检材4色荧光图谱置于一个窗口内,使4色荧光图谱纵轴线同一位置上均含有一吸收峰
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