生物化学酶化学PPT课件.ppt

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1、酶 化 学 (Chemistry of Enzyme),本章重点及难点重点：了解酶作为生物催化剂的特点、国际命名；了解酶催化作用机理 ；掌握酶促反应动力学中米氏方程及Km的意义、应用，掌握影响酶促反应动力学的因素及与影响酶催化高效性的因素之间的区别。掌握别构酶的特点及核酶、同工酶、诱导酶等的概念。难点：酶催化作用机理 、各因素对酶促反应速度的影响及酶促反应动力学的应用。,第一节 通 论,一、酶学研究历史,公元前两千多年，我国已有酿酒记载。一百余年前，Pasteur认为发酵是酵母细胞生命活动的结果。1877年，Kuhne首次提出Enzyme一词。1897年，Buchner兄弟用不含细胞的酵母提取

2、液，实现了发酵。1926年，Sumner首次从刀豆中提纯出脲酶结晶。1982年，Cech首次发现RNA也具有酶的催化活性，提出核酶(ribozyme)的概念。1995年，Jack W. Szostak研究室首先报道了具有DNA连接酶活性DNA片段，称为脱氧核酶(deoxyribozyme)。,二、什么是酶？ 酶是由活细胞产生的，能在体内或体外起同样催化作用的一类具有活性中心和特殊构象的生物大分子，包括蛋白质和核酸，是生物催化剂。 三、酶与一般催化剂的共性及特性,1、共性（1）不发生质、量的变化，但能 改变反应速度（2）不改变反应的平衡点，但能 缩短反应时。（3）可降低反应活化能（4）只能催化热

3、力学允许的反应,2、个性（1）极高的催化效率（2）高度专一性（3）易失活（4）酶活性可调控（5）催化作用与结构有关,酶专一性类型,1. 结构专一性 酶对所催化的分子（底物，Substrate）化学结构的特殊要求和选择 类别：绝对专一性和相对专一性2. 立体异构专一性 酶除了对底物分子的化学结构有要求外，对其立体异构也有一定的要求 类别：旋光异构专一性和几何异构专一性,四、酶作用专一性的假说,(1)、锁钥学说（模板学说）,(2)、多位点亲和理论(3)、诱导契合学说,(3)、诱导契合学说,五、酶的命名和分类,1. 命名：习惯命名；系统命名2. 国际系统分类法及编号 *国际生物化学会酶学委员会（En

4、zyme Commsion）将酶分成六大类：1.氧化还原酶类，2.转移酶类，3.水解酶类，4.裂解酶类，5.异构酶类，6.合成酶类 * 每一种酶有一个编号,如乙醇脱氢酶 EC 1. 1. 1. 27 大类 亚类 亚亚类 序号,第二节 酶的分子结构与功能,酶,简单酶：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等。,结合酶,酶蛋白,辅助因子,（简单蛋白质）,（结合蛋白质）,（apoenzyme）,（cofacter),辅酶（coenzyme),辅基(prosthetic group),全酶(holoenzyme）= 酶蛋白 + 辅助因子,一、酶的组成,*各部分成分在催化反应中的作用,酶蛋白决定反应的专一性辅

5、助因子决定反应的种类与性质,金属酶(metalloenzyme)金属离子与酶结合紧密，提取过程中不易丢失。 金属激活酶(metal-activated enzyme) 金属离子为酶的活性所必需，但与酶的结合不甚紧密。,辅助因子分类（按其与酶蛋白结合的紧密程度）,辅酶 (coenzyme):与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去。,辅基 (prosthetic group):与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超滤的方法除去。,或称活性部位，酶分子中直接和底物结合并起催化反应的空间局限（部位）。,1. 酶的活性中心（结合部位和催化部位）,二、酶分子的结构特征,结合部位 酶分子中与底物结合的部位或区

6、域一般称为结合部位，结合部位决定酶的专一性。,催化部位 酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催化部位，催化部位决定酶所催化反应的性质。,活性中心的特点,活性部位只占酶整个分子很小部分。通常只有几个aa残基组成。 酶的活性中心是个三维实体，是在酶的高级结构中形成的，酶的活 性中心的aa残基在一级结构可能相距很远，但在空间结构上十分靠 近。 酶与底物的结合是活性部分与底物的形状发生诱导锲合的过程。 酶的活性部位位于酶分子表面的一个裂缝内，底物分子就结合到这 个裂缝内，裂缝内含较多疏水基团，有利于结合催化。 酶活性中心是可运动性的，酶活性中心与底物的结合通过次级键。,Asp,His,Ser,胰凝乳

7、蛋白酶的活性中心,活性中心重要基团: His57 , Asp102 , Ser195,2. 必需基团,指酶表现催化活性不可缺少的基团，指在活性中心之外的某些区域，不与底物直接作用。,底 物,活性中心以外的必需基团,结合基团,催化基团,活性中心,三、与酶的高效率有关的主要因素（策略）,1、 邻近与定向效应 2、 诱导契合与底物扭曲变形 3、 共价催化 4、 酸碱催化 5、微环境影响,酶分子中可作为亲核基团和酸碱催化的功能基团,胰凝乳蛋白酶反应的详细机制（1）,结合底物,His57 质子供体,形成共价ES复合物,C-N键断裂,底物,胰凝乳蛋白酶反应的详细机制（2）,羰基产物释放,四面体中间物的瓦解

8、,水亲核攻击,羧基产物释放,第三节酶促反应的动力学,本节需要解决的问题,底物浓度与酶促反应速度的影响酶浓度对酶促反应速度的影响pH对酶促反应速度的影响温度对酶促反应速度的影响激活剂对酶促反应速度的影响抑制剂对酶促反应速度的影响,一、底物浓度对反应速度的影响（一）、曲线的基本含义,单底物、单产物反应酶促反应速度一般在规定的反应条件下，用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示反应速度取其初速度，即底物的消耗量很小（一般在5以内）时的反应速度底物浓度远远大于酶浓度,在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速 度的影响呈矩形双曲线关系。,当底物浓度较低时,反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。,

9、随着底物浓度的增高,反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。,当底物浓度高达一定程度,反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应。,（二）米氏方程式,中间产物,1.快速平衡理论与稳态平衡理论,快速平衡理论 1913年 Michaelis和Meuten 提出，当底物浓度远远大于酶浓度时，假定ES分解成产物的逆反应可忽略不计，因此在“快速平衡”理论的基础上推倒出一个数学方程式，以表示底物浓度与酶反应速率之间的定量关系，称为米氏方程。稳态平衡理论 1925年Briggs和Haldane提出，反应进行一段时间后，ES浓度增加到一定值时，ES也在不断分解，只有当ES的生成速度与分解速度相等时，ES

10、的浓度才保持不变，并对米化方程进行了修正，但为纪念仍称米氏方程。,2. 什么是米氏方程式？ 1913年Michaelis和Menten在快速平衡理论的基础上提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，简称米氏方程式(Michaelis equation)，1925年Briggs和Haldane在稳态平衡理论的基础上并对米化方程进行了修正，但为纪念仍称米氏方程,S：底物浓度 V ：反应速度 Vmax：最大反应速度m：米氏常数,米氏方程的推导,令：,将（4）代入（3），则：,ES生成速度：,，ES分解速度：,即：,则：,由于酶促反应速度由ES决定，即,将（2）代入（1）得：,(3),当酶反应体系处于稳

11、态时：,当Et=ES时，,当反应速度为最大反应速度一半时,Km值的推导,KmS,* Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。,Km的意义,Km值 Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。 意义：a) Km是酶的特征性常数之一；b) Km可表示酶对底物的亲和力；c) 同一酶对于不同底物有不同的Km值。,Vmax的意义定义：Vmax是酶完全被底物饱和时的反应速度， 与酶浓度成正比。,意义：Vmax=K3 E 如果酶的总浓度已知，可从Vmax计算 酶 的转换数，即动力学常数K3。,LineweaverBurk的作图法 双倒数作图法。,1 Km 1 1 =

12、+ V Vmax S Vmax,取米氏方程式的倒数形式：,1/Vmax,斜率=Km/Vmax,-1/Km,3.米氏常数Km的测定,二、酶浓度对酶促反应速度的影响,当SE，酶可被底物饱和的情况下，反应速度与酶浓度成正比关系式为：V = K3 E,三、温度对酶促反应速度的影响,(1)、一方面是温度升高,酶促 反应速度加快；(2)、另一方面,温度升高,酶的 高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失； (3)、因此大多数酶都有一个最 适温度。 在最适温度条件 下,酶促反应速度最大。,四、pH对酶促反应速度的影响,五、激活剂对酶作用的影响,金属离子：K+、Na+、 Mg2+、Cu2+、Mn2+、

13、Zn2+、Se3+ 、 Co2+、Fe2+ 阴离子： Cl-、Br- 有机分子 还原剂：抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽 金属螯合剂：EDTA,定义：凡是能提高酶活性的物质，称为酶的激活剂。,类别：,六、抑制剂对酶反应的影响酶的抑制作用 有些物质能与酶分子上某些必须基团结合（作用),使酶的活性中心的化学性质发生改变，导致酶活力下降或丧失。失活作用 凡可使酶变性而引起酶活力丧失的作用。 抑制剂 能够引起酶的抑制作用的化合物。抑制剂的特点 a.在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相似。 b.能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体或结合物。,两者的区别：,抑制剂对酶的抑制作

14、用有选择性，一种抑制剂只能引起一种酶或一类酶的活性丧失活降低，而蛋白质变性剂可使所有的酶变性失活。在抑制剂与酶的结合而导致的抑制作用中，抑制剂一般都具有以下特点：一方面在化学结构上与被抑制酶的底物分子或底物的过渡态相似（结构上）。另一方面能够与酶的活性中心以非共价键或共价的方式形成比较稳定的复合体或结合物，而变性剂则作用方式较多。,抑制作用的类型,非专一性不可逆抑制 不可逆抑制作用 专一性不可逆抑制 抑制作用 竞争性抑制 可逆抑制作用 非竞争性抑制 反竞争性抑制,(1)不可逆抑制作用 抑制剂与酶反应中心的活性基团以共价形式结合，引起酶的永久性失活。,非专一性不可逆抑制剂,抑制剂作用于酶分子中的

15、一类或几类基团，这些基团中包含了必需基团，因而引起酶失活。,类型：,专一性不可逆抑制剂,这类抑制剂选择性很强，它只能专一性地与酶活性中心的某些基团不可逆结合，引起酶的活性丧失。 实例：有机磷杀虫剂,-Ser-OH,（2）可逆性抑制作用,抑制剂通常以非共价键与酶或酶-底物复合物可逆性结合，使酶的活性降低或丧失；抑制剂可用透析、超滤等方法除去。,竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制,竞争性可逆抑制,某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。动力学：Vmax不变；Km值增加，酶与底物的亲和力降低。磺胺类药物的设计,

16、竞争性抑制曲线,磺胺类药物的抑菌机制与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶,非竞争性可逆抑制,定义： 酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降。由于这类物质并不是与底物竞争与活性中心的结合，所以称为非竞争性抑制剂。动力学：Vmax减小，Km不变，酶与底物亲和力不变。金属离子，EDTA等,非竞争性抑制曲线,定义：抑制剂不与酶结合，只与ES复合物结合，引 、 起酶活性下降。动力学：km减少，酶对底物亲和力增加，最大反应 速度减少，也无法通过改变底物浓度而改 变反应抑制剂的影响。 举例：多底物反应中,反竞争性抑制作用,反竞争性抑制曲线,（一）、酶分离纯化的一般原则与蛋白质相似 1、

17、材料的预处理； 2、破碎细胞； 3、蛋白质的粗提（与杂质分开）； 4、将蛋白质沉淀出来（等电点、盐析法、有机溶剂法）； 5、粗制品纯化（凝胶过滤法、纤维素柱色谱法、亲和层系法）。,七、酶的分离纯化和活力测定,1. 酶活力（enzyme activity, 也称酶活性）,（二）、酶的活力与测定,酶催化一定化学反应的能力，用在一定条件下酶所催化反应的反应速度来表示。 酶活力的大小用酶活力单位来表示，简称酶单位（unit, U），就是表示酶量多少的单位。其表示方法与所有的测定方法有关。,习惯上沿用的单位如 :,乳酸脱氢酶的活力可用丙酮酸的增加量表示，也可用340nm光吸收的增加量来表示。,2. 酶活

18、力单位的表示方法,国际单位(IU)：1961年 在最适条件下，每分钟催化1mol底物的减少或产物的生产所需的酶量为一个国际单位。,催量单位(katal)：1972年 指在最适条件下，每秒钟使mol底物转化为产物所需的酶量。 1Kat6107IU ，可以以纳Kat、微Kat来进行换算。,3测定酶活力时应注意几点,（1）应测反应的初速度,（2）酶的反应速度一般用单位时间 内产物的增加量来表示。,（3）测酶活力时应使反应温度、pH、离子 强度和底物浓度等因素保持恒定。,（4）测定酶反应速度时，应使SE。,4. 酶活力的测定方法,（1）分光光度法（spectrophotometry）,该法要求酶的底物

19、和产物在紫外或可见光部分光吸收不同。 如氧化还原酶类。,简便、迅速、准确。,一个样品可多次测定，有利于动力学研究。,可检测到10-9mol/L水平的变化。,优点：,习惯上沿用的单位如 :,乳酸脱氢酶的活力可用丙酮酸的增加量表示，也可用340nm光吸收的增加量来表示。,（2）荧光法（fluorometry）,该法要求酶反应的底物或产物有荧光变化。,主要的优点：灵敏度很高，可以检测10-12mol/L的样品。,酶蛋白分子中的Tyr、Trp、Phe残基以及一些辅酶、辅基，如NADH NADPH、FMN、FAD等都能发出荧光。,（3）酶偶联分析法(enzyme coupling assay),第一个酶

20、的产物为第二个酶的底物，这两个酶系统在一起反应。,P1无光吸收或荧光变化，偶联后, P2有光吸收或荧光变化。,例：测己糖激酶的活性,5. 酶的比活力（specific activity，也称比活性）,比活力：指每mg蛋白质所具有的酶活力，一般用U/mg蛋白 质来表示。,比活力有时也可用每g或每ml酶含多少个活力单位来表示。,比活力总活力单位数蛋白质总毫克数 活力单位数mg蛋白质 (杂蛋白:包括酶蛋白及含非酶蛋白） 比活力是酶纯度衡量的重要指标之一,终点法（终止法）：测定完成一定量反应所需要的时间，一般 测产物的生成量比较好。动力学方法（连续法）：测定一定时间内所起的化学变化量， 灵敏度较高。,

21、6、测定酶活力的一般方法,1. 纯化倍数 2. 比活力 3. 回收率,（三）、如何衡量纯化的酶的质量,第 四 节 酶的调节,一 、酶原与酶原的激活,酶原 有些酶在细胞内合成或初分泌时只是酶的无活性前体，此前体物质称为酶原。,酶原的激活 在一定条件下，酶原向有活性酶转化的过程。,酶原激活的机理,胰蛋白酶原的激活过程,酶原激活的生理意义,避免细胞产生的酶对细胞进行自身消化，并使酶在特定的部位和环境中发挥作用，保证体内代谢正常进行。有的酶原可以视为酶的储存形式。在需要时，酶原适时地转变成有活性的酶，发挥其催化作用。,二、变构酶,变构酶（别构酶） 有些酶可以与某些化合物（称为变构剂）发生非共价结合，引

22、起酶分子构象的改变，对酶起到激活或抑制的作用，这类酶通常称为。 结构特点 活性中心（结合部位和催化部位）和变构中心（特殊的调控部位）。 注意：变构中心不是酶活性中心的组成部分。,酶的别构（变构）效应示意图,调节物：也称效应物，一般指的是酶的底物或底物类似物 或代谢的终产物。别构效应： 调节物与别构中心结合后，诱导出或稳定住酶分子的某种构象，使酶活性中心对底物的结合和催化作用受到影响，从而调节酶的反应速度代谢过程，这种效应称为别构效应。 正效应物：指效应物的结合使酶活性升高，也称别构激活剂。 负效应物: 指效应物的结合使酶活性降低，也称别构抑制剂。,（1）常为多个亚基构成的寡聚体；（2）具有别构

23、效应；（3）动力学曲线不符合米曼方程双曲线；（4）酶分子上含两个中心或部位：活性中心 （活性部位）和别构中心（别构部位）。,1963年，Monod等首次提出别构酶的概念。他认为别构酶应具备以下特征：,同促效应：配体相同。当一个效应物与酶结合后， 影响另一相同的效应物与酶的结合。 异促效应：配体不同。当一个效应物与酶结合后， 影响另一不同效应物与酶另一部分结合。,别构效应的种类,1、根据配体性质分,2、协同效应,一个效应物分子与变构酶的结合，对第二个效应 物分子的结合产生影响，这种效应为协同效应。正协同效应：指效应物分子与变构酶的结合后，本身构 象发生变化，有利于后续底物分子或调节 物分子的结合

24、。负协同效应：指效应物分子与变构酶的结合后，本身构 象发生变化，不利于后续底物分子或调节 物分子的结合。,别构酶调节的两种模型,序变模型（KNW）：1966年由Koshland、Nemethy和Filmer 提出。,齐变模型（MWC）： 1965年由Monod、Wyman和Changeux提出。,别构酶与非调节酶动力学曲线的比较,别构酶举例：天冬氨酸转氨甲酰酶，简称ATCase,ATCase活性调节的机理,有催化活性的构象,无催化活性的构象,三、 同工酶,* 定义指同一种属中由不同基因或等位基因编码的多肽链组成的单体、纯聚体或杂交体，能催化相同的化学反应，而其分子结构、理化性质乃至免疫学性质不

25、同的一组酶。,举例：乳酸脱氢酶(LDH1 LDH5),乳酸脱氢酶同工酶形成示意图,多肽,亚基,mRNA,四聚体,结构基因,a b,问答题,1、影响酶促反应的因素有哪些？它们是如何影响的？2、试比较酶的竞争性抑制作用与非竞争性抑制作用的异同。3、什么是米氏方程，米氏常数Km的意义是什么？试求酶反应速度达到最大反应速度的99时，所需求的底物浓度（用Km表示）4、什麽是同工酶？为什麽可以用电泳法对同工酶进行分离？同工酶在科学研究和实践中有何应用？5、举例说明酶的结构和功能之间的相互关系。6、称取25毫克某蛋白酶制剂配成25毫升溶液，取出1毫升该酶液以酪蛋白为底物,用Folin-酚比色法测定酶活力,得知每小时产生1500微克酪氨酸。另取2毫升酶液，用凯式定氮法测得蛋白氮为0.2毫克。若以每分钟产生1微克酪氨酸的酶量为一个活力单位计算，根据以上数据，求出（1）1毫升酶液中含有的蛋白质和酶活力单位数；（2）该酶制剂的比活力；（3）1克酶制剂的总蛋白含量和酶活力单位数。名词解释活性中心 全酶 酶原 活力单位 比活力 米氏方程 Km 诱导契合变构效应 ribozyme 辅酶和辅基 固定化酶,