管碟法测定抗生素效价解答ppt课件.ppt
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1、抗生素微生物测定法,一、概述,1.抗生素的概念及抗生素的生物检定 抗生素是由微生物所产生的极微量便具有选择性地杀死或抑制其他病原微生物生长的一类天然有机化合物。 抗生素的生物检定是以抗生素对微生物的抗菌效力作为效价的衡量标准。,2.抗生素的效价和单位 抗生素的含量用效价和单位表示。该词有时不加区别统称为效价单位。 效价(otency),指检品的实际单位数与其标示量的比值。常表示为效价的百分数。 单位(unit,u)单位是衡量抗生素有效成分的具体尺度。,()重量单位 以抗生素的生物活性部分重量作单位微克()单位,毫克单位。()类似重量单位 以特定的纯粹抗生素盐类的重量作为单位。如纯粹金霉素盐酸盐
2、及四环素盐酸盐(包括无生物活性的盐酸根在内)微克()单位,毫克个单位。这是根据国际使用习惯而来的。()质量折算单位 以特定的纯抗生素盐的质量为单位而加以折算。青霉素0.6ug为1单位()特定单位 以特定的抗生素标准品的某一质量定为一单位。,管碟法浊度法,抗生素微生物检定法,1、管碟法:是利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内呈球面形扩散,形成含有一定浓度抗生素球形区,抑制了试验菌的繁殖而呈现出的透明抑菌圈。此法系根据抗生素在一定浓度范围内,对数剂量与抑菌圈面积呈线性关系,通过比较 标准品与供试品产生抑菌 圈的大小,计算出供试品 的效价。,2、浊度法系利用抗生素在液体培养基中对试验菌生长的抑制
3、作用,通过测定培养后细菌浊度值的大小,比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度,以测定供试品效价的一种方法。,管碟法测定抗生素效价原理和方法,一、 原理 在一定的抗生素浓度范围内,对数剂量(浓度)与抑菌圈的表面积或直径成正比,可以得出一条曲线。 抗生素浓度换算成对数,则抑菌圈直径与抗生素对数成直线关系,2.原理抑菌圈的形成,两种互动作用:一种是抗生素溶液向培养基内呈球面状扩散作用;另一种是试验菌的生长作用。当培养到一定时间,琼脂培养基中的两种互动作用达到动态平衡时,琼脂培养基中便形成透明的抑菌圈。即:在抑菌圈中因抗生素浓度高于抑菌浓度,试验菌生长受到抑制,此处琼脂培养基成透明状;在抑菌圈边缘抗
4、生素浓度恰好等于抗生素最低抑菌浓度。,一、试验前准备,双碟的挑选,内径约90mm,硬质玻璃或塑料培养平皿,水平透明,无色斑气泡,物品的清洗、灭菌,培养皿、钢管、刻度吸管清洗后160干热灭菌2小时或121高压蒸汽灭菌30min,放置室温备用;陶瓷瓦盖要定期清洗干燥。,牛津杯的挑选,内径(6.00.1)mm,高(10.00.1)mm,外径(7.80.1)mm,重量差异不超过0.01g,光洁平坦,缓冲液的制备,磷酸盐缓冲液(pH6.0) 取磷酸氢二钾2g与磷酸二氢钾8g,加水使成1000ml,滤过。磷酸盐缓冲液(pH7.0) 取磷酸氢二钠(Na2HPO4*12H2O)9.39g与磷酸二氢钾3.5g,
5、加水使成1000ml,滤过。磷酸盐缓冲液(pH7.8) 取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g,加水使成1000ml,滤过。,基本要点 : 高剂量抗生素溶液所形成的抑菌圈直径在1822mm; 高、低剂量所形成的抑菌圈之差最好大于2 mm,有些抗生素的差数可较小; 高、低剂量之比一般用2:1,当高、低剂量所致的抑菌圈差别较小时,可用高低剂量之比为4:1的比率。,仪器与用具1 . 操作室2. 双碟 3. 陶瓦盖4. 钢管 5. 钢管放置器6. 恒温培养箱 7. 灭菌刻度吸管 8. 玻璃容器 9. 称量瓶 10.毛细滴管或可调式移液器(11000l) 11.天平12.抑菌圈(直径)测量仪。13
6、.超净工作台用于菌种的接种或传代。超净工作台须置洁净工作室或半无菌室内。,检定菌的来源:检定菌种由中监所所提供的冷冻干燥品。 检定菌的传代和接种: 芽胞杆菌36个月(其他细菌每个月)用普通琼脂斜面传代1次,将新传代的培养物代替原有的菌种,作为工作用(阳性对照)菌种。传代和接种在菌种接种室内按无菌操作要求进行。,冷冻菌种安瓶的接种。 用75%酒精棉擦净菌种安瓿的外壁,稍干。 点燃酒精灯,将安瓿的封口,一端在火焰上烧灼红热用毛细管吸取灭菌水少许在灼热处,使其骤冷而炸裂,另取1支灭菌毛细滴管,在火焰旁吸取少量灭菌水,加至菌种管底部,将冻干菌块搅动促使溶解,随即吸出管内菌液,分别接种至营养琼脂斜面,将
7、营养琼脂斜面琼脂斜面于37恒温培养24小时。,管碟法的操作步骤,预试验试验准备 双碟底层的制备 供试品、标准品溶液的制备菌层的制备滴加抗生素溶液双碟的培养 抑菌圈的测量结果的可靠性检验及效价测定,预试验: 确定最佳的试验条件:调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等,使抑菌圈的大小符合规定:高剂量浓度溶液所致的抑菌圈直径在1822mm。高剂量与低剂量的抑菌圈直径之差最好不小于2mm。高低剂量之比为2:1(如高、低剂量所致的抑菌圈差别较小时,可用4:1的剂量比率)。,试验准备: 双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌;容量瓶、定量吸管的清洗;培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。,
8、供试品、标准品溶液的制备: 估计供试品的效价,根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤,平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液。,1. 称量 称量前,将标准品从冰箱取出,使与温室平衡;供试品应放于干燥器内至少30min方可称取。供试品与标准品应用同一天平;吸湿性较强的抗生素,在称量前12更换天平内干燥剂。标准品与供试品的称量最好一次取样称取,不得将已取出的标准品或供试品倒回原容器内,标准品称量不可少于20mg,取样后立即将称量瓶及被称物盖好,以免吸水。样品的称样量最好不少于50mg。,2. 稀释 稀释操作应遵照容量分析的操作规程。从冰箱中取出的标准溶液,必须先在室温放置,使其温度达到室温后,方
9、可量取。标准品与供试品溶液的稀释应采用容量瓶,每步稀释,取样量不得少于2ml为宜,稀释步骤一般不超过3步。举例:取浓溶液1000u/ml。第一步取5ml(1000U/ml)50ml容量瓶100U/ml;第二步取5ml(100u/ml)50ml容量瓶10U/ml(H);取5ml(100U/ml)100ml容量瓶5U/ml(L)。每次吸取溶液用刻度吸管,量取溶液前要用被量液流洗吸管23次,吸取样品溶液后,用滤纸将外壁多余液体擦去,从起始刻度开始放溶液。稀释标准品与供试品用的缓冲液应同一批和同瓶,以免因pH或浓度不同影响测定结果。稀释时,每次加液至容量瓶近刻度前,稍放置片刻,待瓶壁的液体完全流下,再
10、准确补加至刻度。,3 双碟的制备 在半无菌室内进行,应注意微生物及抗生素的污染,培养基应在水浴中或微波炉中融化,避免直火加热。底层:用灭菌大口吸管(20ml)或其他灭菌分装器,吸取已融化的培养基20ml注入双碟内,等凝固后更换干燥的陶瓦盖,放于3537培养箱中保温,使易于摊布菌层。菌层:取出试验用菌悬液,按已试验妥的菌量按(2.2)法标准品溶液的高浓度所致的抑菌圈直径在1822mm;用灭菌吸管吸取菌悬液加入已融化并保温在水中(一般细菌4850,芽孢可至60)的培养基内,摇匀作为菌层用。用灭菌大口10ml吸管或其他分装器,吸取菌层培养基5ml,使均匀摊布在底层培养基上,置水平台上并用陶瓦圆盖覆盖
11、,放置20 30min,待凝固,备用。,4放置钢管 用钢管放置器,将干热灭菌的镊子或适宜方法将钢管装于玻璃管中,放于钢管放置器上,将双碟打开,放入双碟台上,托起双碟台,使钢管平稳落在培养基上,注意使各个钢管下落的高度基本一致,钢管放妥后,双碟静置510 min,使钢管在琼脂内稍下稳定后,再开始加抗生素溶液。5滴加抗生素溶液每批供试品取610个双碟,滴加溶液可调式移液器,在滴加之前须用滴加液洗23次。滴加溶液的顺序:SHTHSLTL。滴加溶液至钢管口平满,注意滴加溶液间隔不可过长,因溶液的扩散时间不同影响测定结果。,二剂量法(2 2法):用标准品、供试品各两个剂量,根据量反应平行线原理,在相同试
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