第十二章——色谱分析法导论PPT课件.ppt

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1、1,第十二章 色谱分析法,2,第十二章 色谱分析法,第十二章 (1) 色谱分析法导论第十二章 (2) 气相色谱分析法第十二章 (3) 高效液相色谱分析法,kaishi,3,第十二章(1) 色谱分析法导论,Chromatography,4,1、色谱法的产生 色谱法是一种分离技术，它是俄国植物学家茨维特1906年创立的。分离植物叶子中的色素时，将叶片的石油醚（饱和烃混合物）提取液倒入玻璃管中，柱中填充CaCO3粉末(CaCO3 有吸附能力)，用纯石油醚洗脱（淋洗）。,一、色谱分析法简介,12(1)-1 概述,5,Tsweet的实验,6,Tsweet的实验,7,（1）一种是CaCO3 吸附，使色素在

2、柱中停滞下来（2）一种是被石油醚溶解，使色素向下移动 各种色素结构不同，受两种作用力大小不同，经过一段时间洗脱后，色素在柱子上分开，形成了各种颜色的谱带，这种分离方法称为色谱法。,色素受两种作用力影响,8,12-1 概述,色谱法中共使用两相 固定相固定不动的相 CaCO3 流动相推动混合物流动的液体 石油醚色谱法：混合物在流动相的携带下通过色谱柱分离出几种组分的方法。 流动相,液体 流的速度慢，加压，使其流快，1969年HPLC发展，高压液相色谱。,气体 1952年产生气相色谱，是色谱法一项革命性进展。,9,12-1 概述,固定相：（1）固体吸附剂：CaCO3、Al 2O3等（2）液体固定相（

3、载体+固定液高沸点有机化合物，涂在载体上）,色谱分析法一定是先分离，后分析。色谱分离法一定具有两相；固定相和流动相分离：利用组分在两相中分配系数或吸附能力的差异进行分离。,10,随着被分离样品种类的增多，该方法广泛地用于无色物质的分离，“色谱”名称中的“色”失去了原有的意义，但“色谱”这一名称沿用至今。,11,2. 色谱法的发展,1930年代初：R.Kuhn把M.Tswett的方法用于类胡萝卜素的 分离，从此色谱法得以广泛应用。1935年：科学家第一次用苯酚和甲醛合成了有机离子交换剂，能交换阳离子和有机氢离子。后来又合成了阴离子交换剂，既可用于离子交换，又用于色谱分离即现时流行的离子交换色谱法

4、。至1950年此方法已成型。,12,2. 色谱法的发展,1938年：科学家将糊状Al2O3浆液在玻璃板上铺成均匀薄层，用于分离植物中的药用成分，即今日用的薄层色谱。（用于薄层的材料已发展至多种：如硅胶、聚酰胺等）。 1944年：科学家用纤维（滤纸）作固定载体，以吸附在滤纸上的水作溶剂，根据组分在两相中溶解度不同，即渗透率（速率）不同而使各组分彼此分离，称之为纸色谱法。,13,1952年：Martin和Synge又研究成功了在惰性载体表面涂渍一层均匀的有机化合物膜作为固定相，并以气体为流动相，用来分离脂肪酸混合物即今日的气液色谱。1952年获诺贝尔化学奖。,2. 色谱法的发展,14,20世纪60

5、70年代GC-MS，GC-FTIR（傅立叶变换红外光谱）等联用成功，使色谱联用技术成为分离、鉴定、剖析复杂混合物的最有效工具。20世纪60年代末，在经典液相色谱基础上发展成高速、高效的现代液相色谱法。20世纪5060年代是以气相色谱为突破口的大发展时期，70年代进入以高效液相色谱为代表的现代色谱时代。80年代以来，HPLC的应用范围、文献数量已超过GC。,2. 色谱法的发展,15,在较长时期内，色谱法主要应用在有机分析领域。1975年，离子色谱的出现和各种金属螯合物色谱的迅速发展，使色谱法已用于无机阴、阳离子和金属元素的分析。20世纪70年代，计算机技术进入色谱领域，出现了计算机控制的全自动色

6、谱仪。,16,我国情况,我国在色谱分析领域的研究起于1954年，由中国科学院大连化学物理研究所首先开发。经过几十年的努力，我国色谱基础理论研究和应用技术研究方面具有特色。,17,国内外主要色谱杂志,1.色谱（Chinese Journal of Chromatography）中文色谱杂志2. Journal of Chromatography（色谱杂志）1958年创刊，主要以英文发表。3. Journal of Chromatographic Science（色谱科学杂志）1963年创刊4. Chromatographia（色谱法）1968年创刊5. Journal of Liquid Chr

7、omatography（液相色谱杂志）1978年创刊，主要发表液相色谱研究报告6. Journal of High Resolution Chromatography and Communications（高分辨色谱和色谱通讯） 分析化学、分析生物化学、医药、食品、环境科学、石油化工等专业杂志也常发表色谱研究报告。,18,12-1 概述,3、特点：（1）分离效能高（2）灵敏度高（3）分析速度快（4）应用范围广,19,二、色谱分析法分类,1、按两相状态分类气相色谱气体作流动相 （1）气固色谱:气体作流动相，固体吸附剂作固定相。（2）气液色谱: 气体作流动相，固定液作固定相。,20,液相色谱液体作

8、流动相（1）液固色谱：液体作流动相,固体吸附剂作固体相。（2）液液色谱：液体作流动相，固定液作固定相。,超临界液体色谱超临界流体作色谱流动相。,21,2、按操作形式分类（1）柱色谱： 填充柱色谱固定相填充到柱管内 毛细管柱色谱把固定相涂在毛细管内壁上， 中间是空的。（2）纸色谱：滤纸为载体，吸附在滤纸上的水为固定相的色谱法，流动相是含一定比例水的有机溶剂，样品在滤纸上展开进行分离。（3）薄层色谱：把固体固定相压成或涂成薄膜的色谱法。,二、色谱分析法分类,22,3、按分离原理分类 （1）吸附色谱：利用吸附剂表面对被分离的各组分吸附能力不同进行分离。 （2）分配色谱：利用不同组分在两相分配系数或溶

9、解度不同进行分离。 （3）离子交换色谱：利用不同组分对离子交换剂亲和力不同进行分离。 （4）凝胶色谱：利用凝胶对分子的大小和形状不同的组分所产生的阻碍作用不同而进行分离的色谱法。,二、色谱分析法分类,23, 12(1)-2 色谱图及色谱常用术语,一、色谱图 混合物样品（A+B）色谱柱中分离检测器记录下来。组分从色谱柱流出时，各个组分在检测器上所产生的信号随时间变化，所形成的曲线叫色谱图。 记录了各个组分流出色谱柱的情况，又叫色谱流出曲线。,24,25,12-2 概述,26,二、色谱图中的基本术语,27,28,1、基线在实验操作条件下，色谱柱后没有组分流出的曲线叫基线。 稳定情况下，一条直线。

10、基线上下波动称为噪音。,二、色谱图中的基本术语,29,2、色谱峰的高度h（1）峰高h 色谱峰最高点与基线之间的距离，可用mm ,mV， mA表示。峰高低与组分浓度有关，峰越高越窄越好。,二、色谱图中的基本术语,30,3. 色谱峰的宽度标准偏差 峰高0.607倍处的色谱峰宽的一半。,二、色谱图中的基本术语,31,峰底宽Wb色谱峰两侧拐点所作切线在基线上的距离 Wb =4 半峰宽W1/2峰高一半处色谱峰的宽度 W1/2 =2 .354 W1/2 =0.589Wb,Wb,32,4. 色谱峰面积A 色谱峰与峰底所围的面积。 对于对称的色谱峰 A=1.065h W1/2 对于非对称的色谱峰 A=1.06

11、5h(W 0.15+W 0.85)/2,二、色谱图中的基本术语,33,5. 色谱保留值定性的依据,组分在色谱柱中停留的数值，可用时间t 和所消耗流动相的体积来表示。组分在固定相中溶解性能越好，或固定相的吸附性越强，在柱中滞留的时间越长，消耗的流动相体积越大，固定相、流动相固定，条件一定时，组分的保留值是个定值。,二、色谱图中的基本术语,34,5. 色谱保留值定性的依据,t0,（1）死时间t0不被固定相吸附或溶解的组分流经色谱柱所需的时间。 从进样开始到柱后出现峰最大值所需的时间。 气相色谱惰性气体（空气、甲烷等）流出色谱柱所需的时间。,17,35,组分流经色谱柱时所需时间。 进样开始到柱后出现

12、最大值时所需的时间。操作条件不变时，一种组分有一个tR定值，定性参数。,(2)保留时间tR,tR,36,（3）调整保留时间tR扣除了死时间的保留时间。tR=tR-t0又称校正保留时间，实际保留时间。 tR体现的是组分在柱中被吸附或溶解的时间。,二、色谱图中的基本术语,tR,37,（4）死体积V0不被固定相滞留的组分流经色谱柱所消耗的流动相体积称死体积，色谱柱中载气所占的体积。 V0=t 0F0 F0柱后出口处流动相的体积流速mL/min,保留值用体积表示：,38,（5）保留体积VR 组分从进样开始到色谱柱后出现最大值时所需流动相体积，组分通过色谱柱时所需流动相体积 VR =t RF 0（6）调

13、整保留体积VR扣除了死体积的保留体积，真实的将待测组分从固定相中携带出柱子所需的流动相体积。 VR= tRF 0,二、色谱图中的基本术语,t0、V0与被测组分无关，因而tR、VR 更合理地反映了物质在柱中的保留情况。,39,（7）相对保留值2，1或i ,s 在相同操作条件下，组分2或组分i对另一参比组分1或s调整保留值之比,二、色谱图中的基本术语,相对保留值只与柱温及固定相的性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关。广泛使用的定性数据。,40,三、分配平衡,在一定温度下，组分在流动相和固定相之间所达到的平衡叫分配平衡，组分在两相中的分配行为常采用分配系数K和分配比k来表示。,K随T变

14、化，与固定相、流动相的体积无关,1、分配系数 K(浓度分配系数),41,2、分配比k (又叫容量因子，容量比),组分在固定相中的质量 组分在流动相中的质量 = ms/ mm =csvs/ cmvm =K vs/vm,k =,k 随T、固定相、流动相的体积变化而变化k 越大，组分在固定相中质量越多， tR越长,17,42,经实验测得k 与tR之间的关系：*,tR= t0(1+k),43,总结：,（1）由色谱峰的数目，可判断试样中所含组分的最少个数。（2）根据色谱峰的保留值进行定性分析。（3）根据色谱峰的h .A 进行定量分析。（4）根据色谱峰的间距及峰的宽度可评价色谱的柱效及分离情况。,44,

15、12(1)-3 色谱法的基本理论,在50年代，色谱技术发展的初期，Martin等人把色谱分离过程比作分馏过程，并把分馏中的半经验理论塔板理论用于色谱分析法。,45,塔板理论把色谱柱比作一个分馏塔，假设柱内有n块塔板，每块塔板高度称为理论塔板高度，用H表示，在每块塔板内，试样各组分在两相中分配并达到平衡，最后，挥发度大的组分和挥发度小的组分彼此分离，挥发度大的最先从塔顶（即柱后）逸出。尽管这个理论并不完全符合色谱柱的分离过程，色谱分离和一般的分馏塔分离有着重大的差别，但是因为这个比喻形象简明，因此几十年来一直沿用。,一、塔板理论,46,47,一、塔板理论,对一个色谱柱来说，若色谱柱长度固定L，每

16、块塔板高度H越小，塔板数目越多，分离的效果越好，柱效越高。塔板数用n 表示。 n =L/H 或 H=L/n H越小，n越多，分离效果越好，用 H,n 评价柱效。 由塔板理论导出n与Wb ， W 1/2 的关系。,48,有时n 大，分离效果也不好，因用tR 内含t0 ，后来改用有效塔板数。,一、塔板理论,塔板理论的成功之处，提出了计算理论塔板高度、塔板数的公式及评价柱效的方法，具有开创性，但有一定局限性。,H理n 理,H有效n 有效,49,前面已知，用塔板理论来说明色谱柱内各组分的分离过程并不合理，因为色谱柱内并没有塔板。当同一试样进入同一色谱柱，当流动相速度变化时，得到不同的色谱图。测得的 n

17、 和 H 也不同，充分说明塔板理论不足以说明色谱柱的分离过程。,、速率理论范第姆特方程,50,1956年，速率理论是荷兰学者范第姆特（VanDeomter）提出的。 速率理论吸收和保留了塔板理论的有益成果，n、H的概念。提出了影响板高的各种因素。此方程经简化后写为:,该式称为速率方程（范氏方程）。 下面我们将对公式中的各项进行讨论,u为流动相线速度cm.s-1，线速度=柱长/死时间,、速率理论范第姆特方程,51,、速率理论范第姆特方程,（1）提出了影响的三项因素：涡流扩散项，分子扩散项， 传质阻力项。（2）在流动相流速一定时，当、最小时，才小，n 才最高，柱效高。当、最大时，才大，n 才最小，

18、柱效低。,17,52,（1）涡流扩散项A,在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似“涡流”的流动，故称涡流扩散。,53,54,（1）涡流扩散项A,A2dp A与填充物的平均直径dp的大小和填充不规则因子有关。 减小：固定相颗粒应适当细小、均匀； 填充要均匀。,55,（2）分子扩散项B/u（纵向扩散项）,待测组分是以“塞子”的形式被流动相带入色谱柱的，在“塞子”前后存在浓度梯度，由浓稀方向扩散，产生了纵向扩散，使色谱峰展宽。,56,57,B2D 是填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素，也称弯曲因子，它反映了填充物对

19、分子扩散的阻碍程度。通常小于1的常数。 D为组分在流动相中扩散系数(cm2s-1)。 Dg气相扩散系数比液相扩散系数Dm大的多（约105倍），在液相中分子纵向扩散引起峰变宽很小，可忽略不计，在气相中，当载气流速小时分子扩散较大。,（2）分子扩散项B/u（纵向扩散项）,58,减小纵向扩散项u 采取措施： 适当提高流动相流速u，减小保留时间 用相对分子质量较大的气体作流动相。 Dg B2Dg 适当降低柱温c,（2）分子扩散项B/u（纵向扩散项）,B/u2D/u,59,（3）传质阻力项Cu,传质阻力系数包括两部分 m +Cs两项组成 Cm 流动相传质阻力系数 组分从流动相移动到固定相表面进行两相之间

20、的质量交换时所受到的阻力，质量交换慢，引起色谱峰变宽。,60,Cs 固定相传质阻力系数 即组分从两相界面移动到固定相内部，达分配平衡后，又返回到两相界面，在这过程中所受到的阻力为固定相传质阻力。,（3）传质阻力项Cu,组分在固定相中扩散系数,固定液膜厚度,61,62, 采用粒度小的填充物 Cmdp2 相对分子质量小的载气，Dg大。 Cm1/Dg 降低固定液液膜厚度(Csdf2)并且液膜要均匀；若膜厚，扩散，费时；但不能太薄，否则包不住载体。 Ds越大越好，增加柱温是提高Ds的方法之一。,（3）传质阻力项Cu,减小采取措施：,63,*为提高柱效，小，应注意以下几点：）采用适当小而均匀的载体，柱填

21、充应均匀。）固定液液膜薄而均匀，并且不宜流失。）载气流速小的时候，u是影响的主要因素，选r大的载气，； 载气流速大的时候，C u是影响的主要因素，选r小的载气，H2，Ne）采用适当的柱温。,气相色谱,64,液相色谱,Dm比Dg小4-5个数量级，分子扩散项可以忽略不计为提高柱效，小，应注意以下几点：）减小填料粒度dp。）在一定范围内采用低流速流动相）用低黏度溶剂做流动相 4）适当提高柱温,65,H,u,GC（a）,LC（b）,GC（a）u有一最低点u最佳；u小或u大，H都大LC（b）u没有最低点； u大，H增大不多，因此可用较高的流速，提高分析速度。,66,可测三种流速对应的板高H，解三元一次方

22、程，求出A、B、C即可求出u最佳和H最小。 实际工作中，为缩小分析时间，可选略高u最佳的流速，常用u最佳。,GC中最佳流速可通过实验和计算方法求得 将 微分后求得,67,二、色谱基本分离方程,、分离度色谱柱的总分离效能指标 定义：相邻两个峰的保留值之差与两峰宽度平均值之比,式中：分子反映了溶质在两相中分配行为对分离的影响，是色谱分离的热力学因素。分母反映了动态过程溶质区带的扩宽对分离的影响，是色谱分离的动力学因素。从中得到：两溶质保留时间相差越大，色谱峰越窄，分离越好。,68,讨论：,色谱分离中的四种情况的讨论：, 柱效较高，K(分配系数)较大,完全分离； K不是很大，柱效较高，峰较窄，基本上

23、完全分离； 柱效较低，K较大,但分离的不好； K小，柱效低，分离效果更差。,69,两个峰tR相差越大，W越窄，值越大，说明柱分离较能高。 .5 两个组分能完全分开。 .0 两组分能分开，满足分析要求。 .0 两峰有部分重叠。,70,71,例 题,已知物质A和B在一根30.00 cm长的柱上的保留时间分别为16.40 min和17.63 min。不被保留组分通过该柱的时间为1.30 min。峰底宽度分别为1.11 min和1.21 min，计算：（1）柱的分离度；（2）柱的平均塔板数；,72,题 解,（2）柱的平均塔板数 n = 16 (tR/Wb )2 =16 (16.40 /1.11)2 =

24、 3493 n = 16 (tR/Wb )2 =16 (17.63 /1.21)2 = 3397 n平均 = （3493 + 3397）/ 2 = 3445,解 ：（1）柱的分离度,73,、分离度与柱效能，选择性的关系,柱效能指色谱柱在分离过程中的分离效能，常用n，来描述，n 越大，越小，柱效越高，对单个组分而言。 对多个组分的分离来说，无法用n ,H 来描述，n 大，小，几个峰未必分的开。,选择性描述两个相邻组分在同一固定相中热力学分布行为的重要参数，用r2,1相对保留值表示. r2,1越大，保留时间相差大，分离越好（但未考虑峰宽因素）,74,、分离度与柱效能，选择性的关系,75,n = 5

25、.54 (tR /W1/2)2=16 (tR/Wb )2,、分离度与柱效能，选择性的关系,76,r2,1 ，k，N如何控制分辨率?,r2,1,77,a:柱效项：塔板数决定，n 越大，柱效越高分离的越好。若通过增加柱长来增加 n,tR会增大，降低板高才是增大R最好的办法,、分离度与柱效能，选择性的关系,b：选择性项：r2,1的微小变化，使分离度有较大改善， r2,1越大，tR（）与tR（1）相差越大，分的越好。 r2,1=1的两组分无法分离。,C：柱容量项：k大一些对分析有利; 太大，tR长，柱容量合适,分的才好。一般k（2-7),78,以n有效表示，则有：,79,例 题：,在一定条件下,两个组

26、分的调整保留时间分别为85秒和100秒,要达到完全分离，即R=1.5。计算需要多少块有效塔板?若填充柱的塔板高度为0.1 cm, 柱长是多少?,L有效 = n有效H有效 = 15470.1 = 155 cm 即柱长为1.55米时，两组分可以得到完全分离。,解： r2,1= 100 / 85 = 1.18,80,124 色谱定性和定量分析,一、定性分析 定性分析的任务是确定色谱图上各个峰代表什么物质。 1.利用保留值与已知物对照定性（1）利用保留时间定性 在相同色谱条件下，将标准物和样品分别进样，两者保留值相同，可能为同一物质。 此方法要求操作条件稳定、一致，必须严格控制操作条件，尤其是流速。,

27、81,82,（2）利用峰高增量定性若样品复杂，流出峰距离太近，或操作条件不易控制，可将已知物加到样品中，混合进样，若被测组分峰高增加了，则可能含该已知物。（3）利用双色谱系统定性 通过改变色谱条件来改变分离选择性，使不同物质显示不同保留值。例：选用极性差别较大的两种不同固定液来制备色谱柱，不同物质具有不同保留值。2. 利用保留值经验规律定性（气相）3. 根据文献保留值数据定性（气相）,83,4.与其它分析仪器联用的定性方法,小型化的台式色质联用仪（GC-MS；LC-MS）色谱-红外光谱仪联用仪；组分的结构鉴定,84,二、定量分析,气相色谱定量分析是根据检测器对溶质产生的响应信号与溶质的量成正比

28、的原理，通过色谱图上的峰面积或峰高，计算样品中溶质的含量。,mi=fi Ai mi=fihi mi被测组分i的质量，fi比例系数Ai、hi被测组分的峰面积及峰高,A=1. 065hW12 A=1.065h （W0.15W0.85）/2,85,1、定量校正因子,色谱定量分析是基于峰面积与组分的量成正比关系。 但由于同一检测器对不同物质具有不同的响应值，即不同物质检测器的灵敏度不同，相同的峰面积并不意味着有相等的量。 定量校正因子：单位峰面积对应组分的质量。 fi=mi/Ai fi绝对校正因子,(1)绝对校正因子 绝对校正因子受操作条件影响较大，要严格控制色谱条件，不易准确测定，没有统一标准，无法

29、直接引用，定量分析中采用相对较正因子。,mi=fi Ai,86,（2）相对校正因子*,用一个标准，把所有组分的A较正到标准物的A上，在同一标准上进行比较计算，热导检测器常用苯作标准。 相对定量校正因子fi定义：样品中某组分的绝对校正因子与基准物的绝对校正因子之比。,fi (m)表示相对质量校正因子,87,也可用相对摩尔校正因子fi(M),（2）相对校正因子,凡文献查得的校正因子都是指相对校正因子，可用fM,fm分别表示摩尔校正因子和质量校正因子,88,2、定量方法,（1）归一化法 试样各组分都出峰，可用归一化法定量。 把所有出峰组分的含量之和当作100%的定量分析方法称为归一化法。 若样品中有

30、n个组分，每个组分的量分解为m1 m2mn 各组分含量总和为m，则组分的质量为mi,质量分数Wi为,18,89,优点：简便、准确、不需标准物，不必准确称量和准确进样，操作条件稍有变化对结果影响较少。缺点：所有组分都出峰，并测所有组分的A和fi,90,（2）内标法,准称样品m（含mi被测组分）+准称纯物质作内标物ms,混合物进样,被测组分,标样（内标物）,91,（2）内标法,92,对内标物的要求：1）内标物应是样品中不存在的纯物质。2）内标物与被测物的峰尽量靠近，但又能完全分开，tR相差少。 为简便起见，求定量校正因子时，常以内标物本身作标准。 fs =1.0优点：定量准确，操作条件不必严格控制

31、，与进样量无关，被测组分和内标物出峰即可，适用于微量组分的测定，应用广泛。缺点：每次测定都要准确称量样品和内标物。增加了一个内标物，给分离带来一定困难。,（2）内标法,93,（3）外标法标准曲线法,当样品中各组分不能完全流出，又没有合适内标时，可采用此法。 将待测组分的纯物质配制不同浓度的标准系列，在相同操作条件下，定量进样，测各个峰的A或h ，绘制Ac曲线或h c曲线。,94,在完全相同条件下，测待测样品，根据A待或h待，从曲线上查出待测组分含量。优点：操作简单，计算方便，不用fi。缺点：要求准确进样，操作条件稳定。,（3）外标法标准曲线法,A(h),c,A待,cx,95,气相色谱法常用定量方法：归一化法与内标法（或内标对比法）高效液相色谱法常用外标法定量。因为HPLC进样量较GC大得多，而且六通阀进样重现性较好。,96,作 业,P24010，12，14，17，18，19，20,97,h、W1/2、Wb、A、 K、k,有关术语 t0、tR、tR、 V0、VR、VR 、r2.1,色谱分析法导论,tR= t0(1+k),98,速率理论,H理n 理,色谱法基本理论,塔板理论,H有效n 有效,99,分离度,定量方法: 归一化法, 内标法, 外标法,100,在选择操作条件时，首先应确定欲达到的分离度，然后用以下公式进行有关计算，求得所需的塔板数和分析时间。,