基因工程第三章基因工程的载体ppt课件.ppt
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1、第三章 基因工程的载体,Chapter 3 Gene Cloning Vector,载体 (Vector) 基因克隆载体(gene cloning vector): 能承载外源基因,将其带入受体细胞得以稳定维持的DNA 分子。,载体的功能(Function of Vector)运送外源基因高效转入受体细胞。为外源基因提供复制能力或整合能力。为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。,克隆载体的结构特征(Character of Vector),(1) 针对受体细胞的可转移性;(2) 自主复制功能;(3)显著的筛选标记;(4)特定的多克隆位点;(5)安全性;,克隆载体具备的条件:,载体分类:1)根据
2、构建克隆载体所用的DNA 来源分为:质粒载体病毒或噬菌体载体质粒DNA与病毒或噬菌体DNA 组成的载体质粒DNA与染色体DNA 片段组成的载体等。,2)根据应用对象分:原核生物克隆载体植物克隆载体动物克隆载体3)按照功能分:克隆载体:克隆一个基因或DNA片断表达载体:用于一个基因的蛋白表达整合载体:把一个基因插入到染色体组中,1 质粒克隆载体2 病毒(噬菌体)克隆载体3 染色体定位整合克隆载体4 人工染色体克隆载体5 特殊用途克隆载体,1 质粒克隆载体,1.1 与构建克隆载体相关的质粒性质1.2 质粒载体必须具备的基本条件1.3 质粒克隆载体的构建,质粒载体以质粒DNA 分子为基础构建的克隆载
3、体,含有质粒的复制起始位点,能够按质粒复制的形式进行复制。 1.1.1 质粒组成与构型1.1.2 质粒DNA大小1.1.3 质粒DNA的复制1.1.4 质粒的不亲和型1.1.5 质粒迁移1.1.6 显性质粒和隐蔽质粒,1.1 与构建克隆载体相关的质粒性质,1.1.1 质粒组成与构型质粒(plasmid)是一种寓于宿主细胞中染色体外的裸露DNA 分子,一个质粒就是一个DNA分子。数量:每种质粒在相应的宿主细胞内保持相对稳定的拷贝数,少者几个,多者上百个。存在广泛:许多细菌、乳酸杆菌、蓝藻、酵母等生物中均发现含有质粒。,DNA构型:在宿主细胞内,质粒一般以ccc-DNA 的形式存在。体外在理化因子
4、作用下,质粒可能成为开环 DNA和线形DNA 分子。,1.1.2 质粒DNA大小质粒DNA 分子小的不足2kb,大的可达100 kb以上,多数在10kb 左右。,1.1.3 质粒DNA的复制质粒含有复制起始位点,能在宿主细胞内进行自我复制。,COP因子:决定质粒的拷贝数,指挥细胞合成阻遏物,当质粒复制到一定的拷贝时,阻遏物的量也积累到足以阻止质粒的复制。Rep基因:指挥宿主细胞合成一种调节蛋白,促进质粒的复制。Par基因:保证细胞分裂时质粒正确分配到子细胞。,“严紧型” 质粒(Stringent Plasmid):低拷贝数,每个宿主细胞仅含1-3份的拷贝。“松弛型” 质粒(Relaxed Pl
5、asmid) :高拷贝数的,每个宿主细胞可达到10-60份拷贝。,1.1.4 质粒的不亲和性(plasmid incompatibility)质粒的不亲和性,也称不相容性: 在没有选择压力的情况下,两种亲缘关系密切的不同质粒,不能在同一宿主细胞中稳定地共存。,大肠杆菌质粒现已鉴别出25个以上的不亲和群。它们之间是相容的,而同一个不亲和群内的质粒是不相容的。,1.1.5 质粒迁移(Plasmid Mobilization)通过接合作用,质粒可以转移到新的宿主细胞中。Tra基因:指令宿主细胞合成菌毛和细胞表面物,促使宿主细胞与受体细胞表面结合,实现遗传物质的转移。,分为两种: 接合型质粒(Conj
6、ugative Plasmid):含有自我复制基因、接合转移Tra基因,拷贝数少,分子大。非接合型质粒(non-Conjugative Plasmid):能够自我复制,但不含Tra基因,这类质粒不能从一个细胞自我转移到另一个细胞;较安全,且拷贝数多,分子小,适于构建克隆载体。,1.1.6 显性质粒和隐蔽质粒显性质粒:也称表达型质粒,质粒携带一些除与自身复制和转移相关的基因外,还有别的基因使得宿主细胞出现新性状。隐蔽质粒:宿主细胞含有某种质粒,但无异样性状表现。,显性质粒的相关基因:抗性基因:抗菌素抗性基因,Apr,Tcr,产毒素基因:大肠杆菌素基因(Col-质粒)。降解基因:降解重金属、有机物
7、和农药等。致瘤基因:诱导某些组织形成肿瘤,如Ti质粒,Ri质粒。,1 质粒克隆载体,1.1 与构建克隆载体相关的质粒性质1.2 质粒载体必须具备的基本条件1.3 质粒克隆载体的构建,(1) 能自主复制,即本身是复制子(2) 具有多种限制酶的单一切割位点,即多克隆位点,并在此位点中插入外源基因片段,不影响本身的复制功能; (3) 在基因组中有1-2个筛选标记,为寄主细胞提供易于检测的表型特征。 (4) 分子量要小,多拷贝,易于操作。;(5)构建不同用途的质粒载体时,可以根据特殊需要组装各种元件(小DNA片段)。,1.2 质粒载体必须具备的基本条件,天然质粒:没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造
8、的质粒。,局限性:分子量高、拷贝数低、合适的单一酶切位点少、选择标记不合适,如何识别载体上的各种元件及其功能:,1.3.1 大肠杆菌质粒载体pBR322及其衍生载体的构1.3.3 农杆菌Ti质粒载体的构建1.3.5 酵母2um质粒克隆载体,1.3 质粒克隆载体的构建,1.3.1 大肠杆菌质粒克隆载体pBR322及其衍生载体的构建,(1)pBR322: p-plsmid,B R分别为该质粒的两位主要构建者F.Bolivar和R.L.Rodriguez姓氏的头一个字母,“322”为实验编号。含有双抗基因(Apr,Tcr)和Col E1复制起始子。,优点: 具有较小的分子量,4363bp。 具有两种
9、抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。含有24种单一的限制性内切酶识别位点,且BamHI、SalI和PstI等几个酶切位点分别处于四环素和氨苄青霉素抗性基因上,当将外源DNA片段插入到这些位点时,可用抗生素基因的失活来筛选重组体。 具较高的拷贝数,经过扩增之后,每个细胞中可累积1000-3000个拷贝。,BR322质粒载体的筛选,插入失活筛选法,(2) 衍生pUC质粒载体,由美国加利福尼亚大学(University of California)J.Messing和J.Vieria于1987年构建。包括如下四个组成部分:i) 来自pBR322质粒的复制起点(ori);ii) 氨苄青霉素抗性基因(
10、ampr) ;,iii) 大肠杆菌-半乳糖酶基因(lacZ)的启动子及其编码-肽链的DNA序列,此结构特称为lacZ基因;iiii) 位于lacZ基因中的靠近5-端的一段多克隆位点(multiple cloning sites, MCS)区段。,UC 18-19多克隆位点,表达性载体(Expression Vector):,根据宿主细胞的不同,表达蛋白质的载体大致可分为:原核生物表达载体和真核生物表达载体。由于真核生物种类繁多,又分为酵母表达载体,植物表达载体,昆虫类表达载体和哺乳类表达载体等等。,原核生物表达性载体(Prokaryotic Expression Vector):,pGEX V
11、ector (GST tag Expressoin Vector):,pGEX Vector MCS region:,pET Vector (S tag Expressoin Vector):,pET Vector MCS region:,真核核生物表达性载体(Eukaryotic Expression Vector):,pcDNA3.1 mammalian Expression Vector:,pcDNA3.1 Vector MCS region:,pEGFP-C1 mammalian Expression Vector:,GFP and REP Expression Vector:,pMS
12、C puro Retroviral Vector Map:,Retroviral Vector:,1.3.1 大肠杆菌质粒载体pBR322及其衍生载体的构建1.3.3 农杆菌Ti质粒载体的构建1.3.5 酵母2um质粒克隆载体,1.3 质粒克隆载体的构建(Construction of Plasmid Vector):,致癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)含一种内源质粒,当农杆菌同植物接触时,这种质粒会引发植物在创伤部位组织增生而形成植物肿瘤 (冠瘿瘤),称此质粒为Ti 质粒(tumor inducing plasmid)。,1.3.3 农杆菌Ti质粒载体的构建,上
13、: 电镜下的根癌农杆菌下: 冠瘿瘤,Ti质粒是双链环状DNA 分子,约200kb,分四个区:1) T-DNA(transfer DNA): 25kb,进入植物细胞区域含有多种基因,其表达产物破坏植物细胞内源激素的平衡,干扰细胞分裂从而引发植物肿瘤。,T-DNA 左右两边界(LB,RB)各有一个25bp长的正向重复序列(LTS 和RTS),对T-DNA 的转移和整合是不可缺少的。,2) Vir区:位于T-DNA 上游的一组基因,表达产物能激活T-DNA 向植物细胞转移,引发植物肿瘤,显示细菌的致病性。3) Con区:含有tra基因,农杆菌之间转移接合4) Oir区:调控质粒的自主复制,农杆菌Ti
14、质粒载体的构建,与大肠杆菌的质粒载体不同,构建的Ti质粒载体不真正用于细菌,而是用于植物细胞,农杆菌只起着中间介导的作用。构建共整合质粒载体和双元载体,共整合质粒载体,将外源基因克隆在大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒的T-DNA区内;,双元整合载体,1.3.1 大肠杆菌质粒载体pBR322及其衍生载体的构建1.3.3 农杆菌Ti质粒载体的构建1.3.5 酵母2um质粒克隆载体,1.3 质粒克隆载体的构建(Construction of Plasmid Vector),1.3.5 酵母2m 质粒载体酵母是一种最简单的单细胞异养真核生物,可以像细菌一样进行基因操作,能够在廉价的培养基上生长,可高密度发酵。
15、酵母又具有真核生物的特性,具有对外源基因翻译后进行蛋白质加工和修饰的功能。几乎所有的酿酒酵母菌中都存在2m质粒。利用2m质粒和其染色体组分与细菌质粒pBR322构建酵母质粒载体,能分别在细菌和酵母菌中进行复制,又称为穿梭载体。,2m复制起点,YEP载体(游离型),质粒克隆载体的用途,用于保存和扩增片段小于2kb的目的基因。构建基因组文库和cDNA文库。可用于目的基因的测序。作为核酸杂交时探针的来源。,回顾,plasmid,质粒载体必须具备的基本条件,UC18/19质粒载体,BR322质粒载体,Ti质粒,UC18/19质粒载体的组成特点、结构图。,插入失活,-互补,T-DNA,1 质粒克隆载体2
16、 病毒(噬菌体)克隆载体3 染色体定位整合克隆载体4 人工染色体克隆载体5 特殊用途克隆载体,病毒由DNA(或RNA)和外壳蛋白组成,经包装后成为病毒颗粒。通过感染,病毒颗粒进入宿主细胞,利用宿主细胞的合成系统进行DNA(或RNA)复制和壳蛋白的合成,实现病毒颗粒的增殖。,2 病毒(噬菌体)克隆载体,噬菌体克隆载体M13克隆载体Cosmid 克隆载体CaMV克隆载体TMV克隆载体SV40克隆载体反转录病毒克隆载体腺病毒克隆载体痘苗病毒克隆载体杆状病毒表达克隆载体,2.1.1 噬菌体性质噬菌体由DNA和外壳蛋白组成,分为头部和尾部。,2.1 噬菌体克隆载体,(1) DNA :DNA 在噬菌体中以
17、线状双链DNA 分子存在,全长48 502bp。 COS 位点(cohesive end site):左右两端各有12 个核苷酸组成的5凸出黏性末端,而且两者的核苷酸序列互补。,(2)基因组DNA的结构,含50个以上的基因,各司其职。,A W B C D E F Z U V G H M L K I J b2,cI cro cII O P Q S R,att int xis gam red cIII N,COS,COS,头部基因 尾部基因 功能不明区,溶源化 重组 早期控制 阻遏 DNA合成 晚期 溶菌,约有20kb生长非必须区段,cI基因:溶源过程控制基因。,噬菌体的基因组结构,(1)噬菌体是
18、一种温和噬菌体,对大肠杆菌具有很高的感染能力,以溶源状态可保存在大肠杆菌中。(2)能承载比较大外源DNA:DNA 上约有20kb 的区域对噬菌体的生长不是绝对需要的,可以缺失或被外源DNA 片段取代。( 3) DNA上有56种限制酶识别位点(见附录3-1),便于多种外源DNA片段的克隆。,2.1.2 选用噬菌体作为克隆载体的依据, 限制性内切核酸酶切位点的改造点突变或甲基化酶处理等方法使必需区内的酶的识别序列失效,避免外源DNA 片段插入必需区;,2.1.3 构建噬菌体克隆载体, 在非必需区插入选择标记基因;, 建立重组DNA分子体外包装系统。重组DNA分子经过体外包装称噬菌体颗粒后才能有效转
19、导受体细胞。,置换型载体,可被外源DNA置换的噬菌体非必需区两侧有一对限制性酶切位点的载体,称为置换型载体。,2.1.4 噬菌体载体的类型,只有DNA的长度大于野生型噬菌体DNA长度的75而不超过其105时,才能被包装成噬菌体颗粒,当DNA的长度短于野生型的75%或超过105%时,噬菌体的活性就急剧下降,因此要求载体DNA和外源DNA长度之和在3953kb之间。,插入型载体:,有一类只含一个限制性位点可供插入外源DNA的载体,这类噬菌体载体称插入型载体。仅保留了EcoR的单一切点可插入长度为10kb的外源DNA.切点又位于报告基因上,故在切开DNA并插入外源基因后,报告基因失活,即可依此进行重
20、组体的筛选,主要用于建立cDNA文库。也用于克隆外源目的基因。,2.1.5 噬菌体克隆载体的应用,2) 组装,1)连接,3) 侵染,置换载体,2 病毒(噬菌体)克隆载体,噬菌体克隆载体单链DNA噬菌体载体M13 Cosmid 克隆载体噬菌质粒载体CaMV克隆载体TMV克隆载体SV40克隆载体反转录病毒克隆载体腺病毒克隆载体痘苗病毒克隆载体杆状病毒表达克隆载体,2.2 单链DNA噬菌体载体M13、f1、fd。2.2.1 优越性:1) 单链DNA噬菌体的复制,是以双链环形的DNA为媒介的,这种复制形式 的 DNA简称RFDNA;2) 不论是RFDNA还是ssDNA都能感染大肠杆菌;3) 单链DNA
21、噬菌体颗粒的大小,是受其DNA制约,不存在包装限制问题;4) 容易测定外源DNA片断的插入取向;5) 可产生含外源片断的单链DNA分子。,2.2.2 M13噬菌体的特点外型丝状,环状单链DNA (6407bp),M13至少11个编码基因,M13 DNA不插入到宿主基因组中, 不裂解细菌,但抑制宿主生长。,+,+,-,+,-,+,-,+,-,+,-,+,-,单链结合蛋白,RF型DNA,复制约200copy,+,+,+,+,+,以-链DNA为模板合成+链DNA,滚环方式复制,M13的侵染循环,2.2.3 构建M13噬菌体载体,插入选择标记基因在选择标记基因区内组装合适的多克隆位点。,M13克隆载体
22、分子结构图,2.2.4 M13 克隆载体的应用,适合用于制备克隆基因的单链DNA。用于制备测序用单链DNA模板、特异的单链DNA探针,定位诱变等。,2 病毒(噬菌体)克隆载体,噬菌体克隆载体M13克隆载体Cosmid 克隆载体噬菌质粒载体CaMV克隆载体TMV克隆载体SV40克隆载体反转录病毒克隆载体腺病毒克隆载体痘苗病毒克隆载体杆状病毒表达克隆载体,cosmid载体:也称粘粒、柯斯载体。这是一类用于克隆大片段DNA的载体,它是由噬菌体的cos 末端及质粒重组而成的载体。该载体在体外重组后,可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装,利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬
23、菌体,而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。,2.3 Cosmid(考/柯斯)克隆载体,Cosmid(考/柯斯)克隆载体,特征:1) 具有质粒的性质,含有大肠杆菌内源质粒复制起始位点、克隆位点和选择标记基因等基本构件,可在细菌中保存和大量复制。2)含有Cosmid 位点,可进行体外包装;3) Cosmid载体一般在10kb 以下,能承载比较大的外源DNA 片段。,2.4 噬菌质粒载体,简称噬菌粒1)组成:噬菌粒是由单链噬菌体和质粒载体DNA融合而成。质粒ColE1的ori抗生素抗性标记M13或f1噬菌体复制起点如pUC118噬菌粒载体就是将野生型M13的基因间隔区插入质粒载体pUC18构建而成的
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