第七章基因诊断与基因治疗课件.ppt

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1、,第七章,基因诊断与基因治疗,第 一 节 基 因 诊 断Genetic Diagnosis,基因诊断,基因,蛋白质,性状,生化诊断,基因诊断,临床诊断,特点针对性强 特异性强灵敏度高 适应性强,一、基因诊断特点,定义利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。,基因诊断过程：,关键要素：探针DNA、目的DNA、信号检测,基因诊断过程： 制备基因探针 提取目的基因，获得单链DNA PCR扩增DNA 目的DNA与尼龙膜结合 探针与目的DNA互补配对 冲洗尼龙膜 检测杂合分子,基因诊断常用技术方法,核酸分子杂交技术限制性内切酶谱分析法(

2、restriction fragment length polymorphism, RLFP)等位基因特异寡核苷酸探针(allele specific oligonucleotide, ASO)聚合酶链反应（PCR）技术SSCP（PCR-SSCP）生物芯片基因测序,RLFP分析法,举例： 镰刀状红细胞贫血 珠蛋白基因的第六个密码子AT 表达产物：谷氨酸缬氨酸 一个碱基突变缺失1个Mst内切酶位点 正常人： 1.1kb 患者： 1.3kb,Mst酶切位点(GCTNAGG),5,3,正常基因,突变基因,1.15kb,1.35kb,镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析,0.2kb,1.15kb,

3、1.35kb,正常人,突变携带者,患者,镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析,甲型血友病的基因诊断（连锁分析1）,5,3,引物1,引物2,99 bp,43 bp,Bcl I,因子VIII 基因142 bp 片段,甲型血友病的基因诊断（连锁分析2）,142 bp99 bp43 bp,异常带,先证者,胎儿,点突变（C to T）,5,3,3,5,G,探针1,探针2,A,等位基因特异寡核苷酸探针（ASO）,聚合酶链反应（PCR）,PCR/单链构象多态性分析(single strand conformation polymorphism, SSCP)PCR产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因

4、和变异基因的迁移位置不同，借此可分析确定致病基因的存在。,正常人,纯合突变,杂合突变,Leber 病患者 PCR/SSCP分析,+,DNA链末端合成终止法,基因测序,（四）基因芯片,阅读课本，思考：基因芯片与基因诊断有什么关系？ 基因芯片有什么优点？ 基因芯片有哪些应用？,基因芯片技术,三、基因诊断的应用,遗传疾病肿瘤感染性疾病，传染性流行病判断个体疾病易感性器官移植组织配型法医学中个体识别、亲子鉴定,肿瘤基因诊断的策略,检测肿瘤相关基因癌基因、抑癌基因、肿瘤转移基因检测肿瘤相关病毒的基因鼻咽癌EB，宫颈癌HPV检测肿瘤标志物基因或mRNA 肝癌甲胎蛋白（AFP）结肠癌癌胚抗原（CEA）,肿瘤

5、相关基因的检测,ras癌基因的检测ras基因中最常见的点突变是第12，13或61密码子突变检测方法：PCR/ASOPCR-SSCP, p53的检测p53基因突变主要为点突变，热点区域位于密码子130290检测方法：PCRSSCPPCR测序PCRRFLP,第 二 节 基 因 治 疗Gene Therapy,基因修正(gene correction)：定点导入外源正常基因，代替有缺陷的基因，对靶细胞基因组无任何改变。属于直接治疗。(外源基因干扰、抑制有害基因的表达),基因治疗(gene therapy)：运用DNA重组技术设法修复患者细胞中有缺陷的基因，使细胞恢复正常功能而达到治疗遗传病的目的。,

6、基因添加(gene augmentation)：非定点导入外源正常基因，而没有去除或修复有缺陷的基因。属于间接治疗。,如腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症、膀胱纤维症和家族性血胆脂醇过多症（血清胆固醇高）；血友病等遗传病；恶性黑素瘤、神经细胞瘤、白血病、肾癌、卵巢癌和脑癌等癌症；以及肝功能衰竭和艾滋病等。,几种常见的基因失活技术,反义核酸技术核酶技术三链技术干扰RNA技术,基因治疗的其他方法：如“自杀基因”的应用，基因疫苗等,靶细胞（基因治疗的对象）：,体细胞 & 性细胞 （美国政府1985年规定，目前治疗仅限于体细胞）, 体细胞基因治疗：使患者症状消失或得到缓解，但有害基因仍能传给后代。, 生殖细胞

7、基因治疗：可根治遗传病，使有害基因不再在人群中散布。, 已克隆正常基因，且明确该基因表达与调控机制,条件： 疾病的发病机制及相应基因的结构功能清楚, 导入基因具有合适的受体细胞，并能有效表达, 具有安全有效的转运载体和方法,基因治疗的关键/条件,关键： 外源基因的安全导入； 外源基因高效正确的表达。,基因治疗的步骤：,1正常基因的制备： 即分离、提取外源基因（目的基因）2、靶细胞的选择3、外源基因（目的基因）的转移4、表达的检测5、回收到患者体内。,1. 物理方法,目的基因的转移,基因治疗的步骤, 直接注射法,1. 物理方法,（一）、目的基因的转移, 直接注射法, 电穿孔法, 微粒子轰击法,1

8、. 物理方法,（一）、目的基因的转移,2. 化学法：,3. 膜融合法,1. 物理方法,（一）、目的基因的转移,2. 化学法,3. 膜融合法,4. 受体载体转移法:重组质粒+特异性多肽内吞,5. 同源重组法(homologous recombination),Bst I,同源重组法,将外源性目的基因定位导入受体细胞的染色体上，通过与该座位的同源序列重组交换，使外源DNA取代原位点上有缺陷的基因，达到基因修正的目的。,1. 物理方法,（一）、目的基因的转移,第四节 基因治疗,2. 化学法,3. 膜融合法,4. 受体载体转移法,5. 同源重组法(homologous recombination),6

9、. 病毒介导转移法,病毒介导转移法,病毒介导基因转移(virus mediated gene transfer) 以病毒为载体，将外源性目的基因通过基因重组技术，组装到病毒载体上，并使重组病毒感染受体宿主细胞，完成基因转移。,反转录病毒载体：反转录病毒虽是RNA病毒，但有反转录酶，可使RNA转录为DNA，再整合到宿主细胞基因组。小鼠白血病病毒 DNA病毒介导载体：DNA病毒包括腺病毒、SV40、牛乳头瘤病毒、疱疹病毒等。,近几年临床的基因治疗实例：,复合免疫缺陷综合征的基因治疗黑色素瘤的基因治疗血友病 其它遗传病的基因治疗其它遗传病诸如白种人中常见的囊性纤维化的进展很快。,腺苷酸脱氨酶(ADA

10、)缺乏症是AR致死性疾病，患者由于ADA缺乏，脱氨腺苷酸增多，改变甲基化能力，产生毒性效应，使T淋巴细胞受损，导致严重的联合免疫缺陷症，引起反复感染，以致死亡。,1. ADA缺乏症,基因治疗的临床应用,1990年，Anderson小组 1% -25%,1. ADA缺乏症,基因治疗的临床应用,患者的缺陷基因是否被被切除？,1991年复旦大学首次进行乙型血友病的基因治疗，利用逆转录病毒转移因子的cDNA到体外培养的患者皮肤成纤维细胞中，再回植入患者皮下。患者体内可检测因子的基因表达产物，浓度约为正常人的 5 。,2、乙型血友病,3、癌症的治疗,抑制癌细胞增生基因 导入癌细胞 抑制癌细胞转录 DNA

11、片断导入癌细胞 提高机体免疫力基因导入免疫系统,阻断癌细胞繁殖,提高免疫力,例：细胞因子基因治疗和肿瘤坏死因子基因治疗,IL-2 Gene TNF-Gene （白介2） （肿瘤坏死因子） 逆转录病毒载体 导入 TIL（体外培养的自体细胞） 回植患者体内 TIL进入自体肿瘤部位，提高细胞因子杀伤肿瘤细胞 的作用。,如：自杀基因 + 病毒载体 转染 重组载体,药物前体 无毒Gene酶 药物复合物 有毒,细胞死亡,例如： 单纯疱疹病毒 哺乳动物细胞 HSV Gene-TK （在肿瘤细胞中表达，正常细胞中不表达） GeneTK GCV（胸苷类似物） TdR P p GCV-p 抑制DNA合成 脱氧胸苷

12、酸 肿瘤细胞死亡 邻近细胞死亡/凋亡（旁观者效应）,基因治疗的应用与展望,应用,展望,遗传性疾病、心血管疾病、肿瘤、感染性疾病、神经系统疾病,进一步寻找切实有效的基因精密调控外源基因在人体内的表达体细胞移植和重建的生物学研究减少外源基因对机体的不利影响,基因治疗有待解决的问题 1、难以获得真正有治疗作用的基因。 2、外源基因的表达难以在体内精确调控。 3、体细胞经体外培养后，其生物学特性会有 改变。 4、过多的外源蛋白对机体带来可能的影响。 5、随机整合潜在的威胁。,1999年9月，Arizona的Jesse Gelsinger因患鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)部分缺乏症在Pennsylvan

13、ia大学接受基因治疗，4天后出现发热、凝血而死亡，成为死于基因治疗实验的第一个病人。,1. 导入基因的持续表达,基因治疗中存在的问题及解决方法,2. 导入基因的高效表达3. 安全性问题-2002年法国,基因治疗存在问题与伦理学,1导入基因的稳定/高效表达外源基因转移入病人体内细胞表达。2导入基因的安全性基因治疗的安全性应确保。不因导入外源目的基因而产生新的有害遗传变异。,3试图纠正生殖细胞遗传缺陷或通过遗传工程手段来改变正常人的遗传特征则是引起争议的领域(伦理）,1999年9月，Arizona的Jesse Gelsinger因患鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)部分缺乏症在Pennsylvania

14、大学接受基因治疗，4天后出现发热、凝血而死亡，成为死于基因治疗实验的第一个病人。,基因诊断与基因治疗（课堂练习）1. 核酸分子杂交主要内容有 制备核酸样本 B. 制备与标记特异探针C. 核酸样本的分离、变性、转移和固定 预杂交、杂交和漂洗 E. 检测杂交信号下列是常用核酸杂交方法的用途，错误的是Southern 印迹杂交法可用于检测特异RNA序列片断 Southern 印迹杂交法可用于检测特异DNA序列片断Northern印迹杂交法可用于检测DNA或RNANorthern印迹杂交法可用于检测RNA原位杂交法可用于检测组织细胞中的DNA或RNA,3. 以下是关于PCR技术的叙述，错误是 PCR技术进行体外DNA扩增，其过程不同于体内DNA复制过程 需要目的DNA两条链为模板 需Taq 酶代替DNA聚合酶 需RNA引物代替DNA引物 PCR需要DNA变性、复性和延伸3个步骤的反复循环 基因诊断常用技术有 核酸分子杂交 B. 聚合酶链反应 基因芯片 D. 基因测序E. 以上都可以,