微生物发酵制药技术ppt课件.ppt

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1、1,第二章 微生物发酵制药工艺,2,第一节 概述,3,发酵：通过微生物培养而获得产物的过程微生物发酵制药：利用微生物技术，通过高度工程化的新型综合技术，以利用微生物反应过程为基础，依赖于微生物机体在反应器内的生长繁殖及代谢过程来合成一定产物，通过分离纯化进行提取精制，并最终制剂成型来实现药物产品的生产,一、发酵,发酵工程的4个阶段,第一阶段1676年制成第一台显微镜 微生物的存在1857年巴斯德证明了酒精是由活的酵母发酵引起的1897年毕希纳发现磨碎的酵母仍使糖发酵形成酒精酶,第二阶段对发酵技术的认识起始于19世纪末，主要来自于厌氧发酵，如利用酵母菌、乳酸菌生产酒精、乳酸和各种发酵食品。,第三

2、阶段20世纪40年代初，第二次世界大战爆发，青霉素迅速工业大规摸生产。深层培养、生产大规模化、多种抗生素、氨基酸、核酸发酵成功。,7,发酵罐发酵,8,立式,卧式,摇床发酵,9,静置发酵,10,二、,初级代谢产物：与菌体生长相伴随的产物、对菌体生长、分化和繁殖是必须的氨基酸、核苷酸、维生素、糖类等菌体对其合成反馈控制严密，一般不过量积累,次级代谢产物：与菌体生长不相伴随，以初级代谢的中间产物为原料而合成抗生素、生物碱、毒素、色素、胞外多糖等结构常较复杂对环境条件敏感,三、常见的制药用微生物,细菌放线菌真菌,细菌之大肠杆菌属(Escherichia coli),生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸等氨基酸

3、类药物基因工程的载体,细菌之短杆菌属(Brevibacterium),维生素B12、氨基酸、核苷酸类药物生产中常用的菌种，也是酶法合成生产辅酶A的菌种。,细菌之棒状杆菌属(Corynebacterium),生产氨基酸、核苷酸类药物，用于甾体转化是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌，如北京棒杆菌AS1.299钝齿棒杆菌AS1.542,细菌之芽孢杆菌属(Bacillus),生产氨基酸、核苷酸、抗生素类、维生素B12、用于甾体转化等。,细菌之假单胞菌属 (Pseudomonas),生产维生素B12、氨基酸、核苷酸类；进行类固醇（甾体）转化；有些菌株可利用烃类生产单细胞蛋白。,细菌之乳酸杆菌属 (Lactob

4、acillus),生产抗癌类药物,放线菌,抗生素12000余种，60%左右来自放线菌，经济价值大。,放线菌之链霉菌属 ( Streptomyces ),灰色链霉菌(Streptomyces griseus) 产链霉素金霉素链霉菌(Streptomyces aureofaciens) 产金霉素红霉素链霉菌(Streptomyces erythreus) 产红霉素龟裂链霉菌 (Streptomyces rimosus) 产土霉素,放线菌之诺卡氏菌属 (Norcadia),生产利福霉素、蚊霉素等,放线菌之小单胞菌属 (Micromonospora),多种可产抗生素，如棘孢小单胞菌(M. echino

5、spora)产庆大霉素。,放线菌之游动放线菌属 （Actinoplanes）,典型代表：济南游动放线菌 (Actinoplanes tsinanesisn) 产创新霉素(creatmycin；1964),真菌之根霉属(Rhizopus),生产甾体激素、延胡索酸及酶制剂等。,真菌之曲霉属(Aspergillus),生产枸橼酸、葡萄糖酸、有机酸类、抗生素，进行甾体转化。,真菌之青霉属(Penicillum),产黄青霉(Penicillum chrysogenum) 生产青霉素，也可用来生产葡萄糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏血酸,真菌之头孢霉菌属(Cephalosporium),产黄头孢霉(Cep

6、halosporium chrysogen)、顶孢头孢霉菌(Cephalosporium acremonium) 都生产头孢菌素C,真菌之酵母菌属(Saccharomyces),啤酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)：生产啤酒、酒精、药用酵母等；核酸、麦角固醇、细胞色素C、凝血质和辅酶A等。红酵母 (Rhodotorula)：-胡萝卜素棉病针孢酵母(Nematspora gossypii)：核黄素,真菌之其它,牛肝菌属：含有人体必需的8种氨基酸，还含有腺膘呤、胆碱和腐胺等生物碱。灵芝属：灵芝多糖、灵芝多肽、三萜类、16种氨基酸(其中含有七种人体必需氨基酸)、蛋白质、甾类

7、、甘露醇、香豆精苷、生物碱、有机酸（主含延胡索酸），以及微量元素Ge、P、Fe、Ca、Mn、Zn等。,30,菌株选育、发酵和分离纯化或提炼是发酵制药的三个主要工段。,四、发酵制药的基本过程,31,发酵制药流程,32,发酵制药工艺,33,菌体生长与产物合成的三个阶段：发酵前期（fermentation prophase) 菌体生长期（cell growth phase)发酵中期(fermentation metphase) 产物合成期（product synthesis phase)发酵后期（ fermentation anahase） 菌体自溶期（cell autolysis phase),五

8、、微生物发酵基本过程特征,34,从接种至菌体达到一定临界浓度的时间，包括延滞期、对数生长期和减速期。代谢特征：碳源、氮源等基质不断消耗生长特征：菌体不断地生长和繁殖，生物量增加。溶氧变化：不断下降，菌体临界值时，浓度最低。pH变化：先升后降以氨基酸为碳源，释放氨，后氨被利用。先降后升以糖为碳源，释放出丙酮酸等有机酸，后被利用。,发酵前期特征,35,以次级代谢产物或目标产物的生物合成为主的一段时间。菌体生长恒定就进入产物合成阶段。呼吸强度：无明显变化，菌体数目不增加。产物量：逐渐增加，生产速率加快，至最高峰后合成能力衰退。对外界变化敏感:容易影响代谢过程，从而影响整个发酵过程。,发酵中期特征,3

9、6,菌体衰老，细胞开始自溶的一段时间合成产物能力衰退，生产速率减慢氨基氮含量增加，pH上升发酵必须结束，否则产物被破坏，菌体自溶给过滤和提取带来困难,发酵后期特征,37,第二节 制药微生物与产物的生物合成,制药微生物的选择制药微生物的选育微生物菌种的保藏微生物代谢产物的生物合成微生物生物合成的调节,38,（1）所需培养基易得，价格低廉；（2）培养和发酵条件温和（糖浓度、温度、pH、溶解氧、渗透压等）（3）生长速度和反应速度较快，发酵周期短（4）单产高（5）抗病毒能力强（6）菌种纯粹，不易变异退化，稳定性好（7）菌体不是病源菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素（包括抗生素、激素和毒素），保证安

10、全,一、制药微生物的选择,39,来源：大陆土壤、海洋水体样品的采集：表层土壤(0-10cm)，海洋（0-100m）预处理：根据分离目的和微生物的特性 1）温度 2）化学：SDS酵母膏，CaCO3，NaOH处理，减少细菌，有利于放线菌分离；乙酸乙酯、氯仿、苯处理，除去真菌。 3）离心、膜分离。,生产菌的自然分离,40,培养基：选择适宜的培养基，营养和pH，添加抑制剂如抗生素，制霉菌素等。分离方法： 1）稀释法：无菌水，生理盐水，缓冲溶液 2）滤膜法：0.220.45um。细菌在膜上，放线菌菌丝可穿透，进入培养基。培养条件：放线菌25-30，32-37，45-50，7-14天至1月。,41,二、制

11、药微生物菌种的选育,1、选育的目的 改善菌种的特性，使产量提高，改进质量、降低成本、改革工艺、方便管理及综合利用等2、选育的方法：A、自然选育；B、诱变育种C、杂交育种,42,定义：不经过人工诱变处理，根据菌种的自然突变而进行的菌种筛选过程。,自然选育,43,菌种分离纯化,1。稀释涂布,2。平板划线纯化,44,斜面传代,45,防止菌株衰退的措施,菌种退化：菌种的发酵能力降低、繁殖能力降低、发酵产品的得率降低.1、衰退的可能原因 （1）、基因突变 （2）、分离现象2、防止菌种衰退的方法A、从菌种选育方面考虑；B、尽量减少传代次数 C、创造良好的培养条件；D、利用不易衰退的细胞传代; E、采用有效

12、的菌种保藏方法,诱变育种,定义：人为创造条件（诱变剂处理），使菌种发生变异，筛选优良个体，淘汰劣质个体。物理类：紫外线，快中子，激光，太空射线。化学类：碱基类似物，嵌合剂，亚硝酸。生物类：噬菌体，转座子。特点：快速，简单，效益大。缺点：无定向性。,诱变育种流程,出发菌种 单孢子悬液 诱变处理 高产菌株 单菌落初筛 稀释涂板复筛 稳定性特性 中试放大 投入生产,杂交育种,概念：两个不同基因型的菌株，通过结合或原生质体融合，使遗传物质发生重新组合，从中分离筛选出具有优良性状的新菌株。特点：有一定的定向性。种类：准性生殖接合原生质体融合,（1）准性生殖育种,概念：准性生殖范围：放线菌，半知菌纲的真菌

13、过程：两条菌丝 相互结合 异核体 二倍体 重组单倍体 产黄青霉：提高青霉素产量 对氟苯丙氨酸灰黄链霉菌：灰黄霉素产量,准性生殖是指异核体（单个生物个体中含有两种或两种以上基因型）细胞中两个遗传物质不同地细胞核可以结合成杂合二倍体地细胞核。这种杂合二倍体的细胞核在有丝分裂过程中可以发生染色体和单倍体化,最后形成遗传物质重组的单倍体的过程。也就是不经过减数分裂就能导致基因重组的生殖过程。,（2）接合育种,范围：细菌、放线菌过程：两种细胞混合培养 基因片段进入另一细胞 合子 重组单倍体虽然有成功报导，但多数效果不显著,（3）原生质体融合育种,概念通过生物学、化学或物理学的方法，使两个不同种类的体细胞

14、融合在一起，从而产生具有两个亲本遗传性状的新细胞.用去壁酶处理将微生物细胞壁除去，制成原生质体，在高渗条件下，用聚乙二醇（PEG）促进原生质体发生融合，再生细胞壁，从而获得异核体或重组子，这一技术叫原生质体融合。,55,原因：菌种经过多次传代，会发生遗传变异，导致退化，从而丧失生产能力甚至菌株死亡。目的：保持菌种原有优良特性，延长生命时限，长期存活、不退化。原理：根据菌种的生物生理、生化特点，人工地创造条件，使菌种的代谢活动处于不活泼状态，生长繁殖处于休眠状态。关键：保藏时首先要挑选优良纯种，最好是它们的休眠体（孢子、芽孢等），其次是要创造一个最有利于休眠的环境，如低温、干燥、缺氧和缺乏营养物

15、质等，以达到降低其代谢活动，延长保存期的目的。,三、微生物菌种的保藏,56,菌种保藏的方法,斜面保藏法、矿物油保藏法、砂土保管保藏法、真空冷冻干燥法、冷冻法、液态真空干燥法、琼脂穿刺封口保藏法、曲法保藏、麦粒保藏法、无水硅胶保藏法。,57,（1）斜面保藏法： 在4左右的冰箱保藏，每隔一定时间进行移植培养后再继续保藏，如此反复。 优点：方法简单、存活率高，具有一定的保藏效果。 缺点：菌种仍有一定的强度的代谢活动条件，保存时间不长（16个月），传代多，菌种容易变异。 适用菌种：细菌、酵母、防线菌、霉菌,58,（2）矿物油保藏法 将生长好的斜面在无菌条件下倒入已灭菌的液体石蜡，油层高于斜面末端1cm

16、，然后放于冰箱中保存。 适用菌种：适用于除细菌外的其它菌种（3）砂土管保藏法 利用土壤颗粒对微生物起保护作用，提高微生物的存活率。其包括砂土制备和真空抽干两步。 适用菌种：产孢子的微生物，对于一些对干燥敏感的细菌（奈氏球菌、弧菌、假单胞杆菌）以及酵母不适用。,59,（4）真空冷冻干燥法 先在菌悬液加入保护剂（如：脱脂牛奶、血清等）然后在较低温度下使成冻结状态，最后减压抽干。 特点： 它是菌种保藏中最有效的一种方法。保存期可达一年至数十年之久，并且存活率高，变异率低。但是手续麻烦，需要一定的设备。 适用菌种：对于不长孢子或长的很少孢子的真菌保藏效果不佳。,60,（5）其他保藏方法冷冻法：分低温冷

17、冻（20 ）与超低温冷冻（196 ）两种。适用于细菌、真菌、病毒等的保藏液态真空干燥法：菌体在恒温液态条件下进行真空干燥。适用于包括细菌、病毒，特别适用于冷冻干燥保藏效果不佳的菌种。琼脂穿刺封口保藏法：适用于不产孢子细菌的保藏,61,曲法保藏：将麸皮与水按比例混合，灭菌后接入菌种，待孢子长成后即为成曲。将试管放入盛有氯化钙的干燥器中，干燥后低温保藏。适用于有大量孢子的霉菌和某些放线菌的保藏。麦粒保藏法：麦粒灭菌后接入菌液，培养有菌丝或孢子时，置通风、避光、干燥处保藏。适用于一些放线菌、芽孢杆菌、酵母的保藏。无水硅胶保藏法：将细胞悬浮液和等体积的脱脂灭菌牛奶混匀，加入装有无水硅胶的试管中，然后将

18、试管放于干燥器内，室温或4 保藏。对于细菌和真菌效果都较好。,62,国内外菌种保藏机构,菌种是一个国家的重要资源，世界各国对菌种的保藏都极为重视。世界上有700多家菌菌种保藏机构，其中国际知识产权组织承认的法定的保藏机构仅有28家。,63,1、我国的微生物菌种保藏机构,1）普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）中科院微生物所，北京，中科院武汉病毒研究所2）农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）中国农业科学院土壤肥料研究所，北京 （ISF）3）工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）中国食品发酵工业科学研究院，北京，（IFFI）4）医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC） 中国医学科学院皮肤病研究

19、所，南京卫生部药品生物制品检定所，北京中国医学科学院病毒研究所5）抗生素菌种保藏管理中心（CACC）中国医学科学学院抗生素研究所，北京四川抗生素工业研究所，成都华北制药厂抗生素研究所，石家庄6）兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC）农业部兽医药品检察所，北京,64,2、国外主要的微生物菌种保藏机构,1）美国标准菌种收藏所（ATCC）2）美国冷泉港研究所（CSH）3）日本东京大学应用微生物研究所（IAM）4）日本东京科研化学有限公司（KCC）5）日本大阪发酵研究所（IFO）6）英国国立标准菌种收藏所（NCTC）7）美国国立卫生研究所（NIH）8）美国农业部北方开发利用研究部（NRRL）,四、代谢

20、产物的生物合成,代谢（metabolism）是生物体内进行的生理生化反应的统称。代谢分为分解代谢(catabolism)和合成代谢(anabolism)，前者是指把大分子降解为小分子的过程，为合成代谢提供能量和原料；而后者是指把小分子合成为复杂大分子的过程，满足细胞生长和分化的需要。初级代谢是营养物质转变为细胞结构物质和对细胞具有生理活性作用的物质，为细胞提供能量、合成中间体及其生物大分子的代谢网络。在初级代谢过程中形成的产物为初级代谢产物（primary metabolite），包括各种小分子前体、单体和多糖、蛋白质、脂肪、核酸等。几乎所有生物的初级代谢基本相同。次级代谢存在于某些生物中，并

21、在一定时期表达。次级代谢对正常的生长可能不必要，但对抵抗逆境、分解毒素、生殖等具有重要意义。,次级代谢产物生物合成的基本特征,（1）次级代谢产物种类繁多，结构特殊，含有不常见的化合物和化学键。如氨基糖、苯醌、香豆素、环氧化合物、生物碱、内酯、核苷、杂环等基团，聚乙烯不饱和键、大环、环肽等键。,（2）具有种属特异性，与种属分类学无关。分类学上相同的菌种能产生不同结构的抗生素，如灰色链霉菌既可以产生氨基环醇类抗生素，又可以产生大环内酯类抗生素。分类学上不同的菌种能产生相同结构的抗生素，如霉菌和链霉菌均可产生头孢菌素C。一种微生物的不同菌株产生结构不同的多种次级代谢物，而同一菌株会产生一组结构类似的

22、化合物。,（3）生长期转向生产期，形态与生理发生变化。次级代谢产物是在细胞生长后期开始形成，当生长受限制时被启动。完成菌体营养生长期（trophophase）之后，出现次级代谢物合成期（idiophase），其生物合成比生长对环境更敏感，要求更高。次级代谢产物是以初级代谢产物为前体，受到初级代谢的调节。可能是缺乏某种营养成分，菌体生长抑制，启动了次级代谢物合成。菌体内中间代谢物积累，抑制了初级代谢酶，使之消失或活性下降，诱导了新酶的出现，转入生产期。芽孢杆菌形成芽孢，放线菌和真菌形成孢子，抗生素合成可能是细胞分化的伴随现象。,（4）次级代谢产物是结构相似的一组混合物，但活性差异较大。参与反应的

23、酶的底物特异性不强。产生菌利用一种或两种以上的初级代谢产物合成一种主要的次级代谢产物，并继续对该产物进行修饰生成多种衍生物。一种次级代谢产物可由两种或两种以上代谢途径合成。,（5）次级代谢产物的合成受多基因控制。往往以基因簇形式存在。除染色体外，还有细胞质遗传物质，可能存在于质粒、线粒体基因。遗传物质的变异和丢失是导致菌种退化和生产不稳定的重要因素，所以具有代谢不稳定性。,次级代谢产物的构建单位,微生物合成的次级代谢产物是由微生物代谢产生的一些中间产物，如由碳水化合物降解生成的五碳（C5）、四碳（C4）、三碳（C3）、二碳（C2）化合物和初级代谢产物合成。把构成次级代谢产物的基本结构单位称为生

24、源（biogen）。生源直接或间接来源于次级代谢过程的中间产物或初级代谢产物。构建单位包括聚酮体、甲羟戊酸、糖类、不常见的氨基酸（如D氨基酸、氨基酸等）、环多醇和氨基环多醇等。,次级代谢产物的生物合成的基本过程,次级代谢产物的合成基本过程包括构建单位的聚合再修饰装配。在此过程中，次级代谢产物的累积受合成途径中某些酶活性的限制，这些关键酶活性大小与产量正相关。,（1）前体聚合,微生物合成生源后，通过缩合反应形成聚酮体、寡肽、聚乙烯等。各种聚酮体的合成过程相似，只是起始单位和延长单位不同。聚酮体是26个二碳单位的聚合反应的结果，酮基被保留，或只是还原为羟基。聚酮体可直接形成环，如四环素类和大环内酯

25、类。进而被修饰，与相应基团如氨基糖、糖胺等结合，形成结构和生理活性不同的化合物。乙酰CoA羧化形成丙二酰CoA，再与8个丙二酰单位缩合形成9酮化合物，再转化为中间体三环化合物。甲基化、还原、脱水、加氢、氧化形成4氧脱水四环素，加氯形成4氧脱水氯四环素，转氨形成4氨基脱水氯四环素，再甲基化形成脱水氯四环素，脱氢氯四环素，最后形成氯四环素。大环内酯是24碳单位缩合而成。,氨基酸的聚合有三种形式：氨基酸活化成磷酸酯，再被酶催化缩合，如谷胱甘肽；蛋白质的核糖体模板合成途径；多酶复合物将氨基酸活化后，按硫模板或非核糖体机理缩合，形成肽链。氨基酸与ATP反应，在羧基上形成腺苷单磷酸酯被激活。氨基酸被转移到

26、酶的巯基上，形成硫酯键。硫酯键断裂，提高能量，使2个氨基酸之间形成肽键（羧基与氨基结合）。依次，形成多肽链。如短杆菌肽S是由2条5肽首尾连接而成。,74,（2）结构修饰,包括糖基化、酰基化、甲基化、羟基化、氨基化、氧化还原等，使抗生素产生了共存的系列类似物。在聚酮体链延长的过程中，伴随许多基团的化学修饰，如引入氧、氯原子、甲基等，再以糖苷键与糖类物质连接，酰胺键与氨基酸连接，形成各种抗生素。如四环素类，先形成聚酮体，在C7位发生氯化则是金霉素，在C5位上先氧化后还原则是土霉素。,（3）装配,合成各个组分后，需要按一定顺序在特异酶作用下组装，才能形成有活性的药物。,77,第三节 发酵工艺条件的确

27、定,培养基及其制备灭菌操作技术微生物发酵的3种主要操作方式发酵工艺条件的确定及主要控制参数,78,培养基（medium)：供微生物生长繁殖和合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物按微生物的主要类群来说，它们所需要的培养基成分也不同。 细菌： 牛肉膏蛋白胨培养基、 LB (Luria-Bertani) 放线菌： 高氏一号培养基 真菌：查氏合成培养基、PDA (Potato-Dextrose-Agar) 酵母菌；麦芽汁培养基的组成和比例是否恰当，直接影响微生物的生长、生产和工艺选择、产品质量和产量。,一 培养基,79,碳源氮源无机盐水生长因子前体与促进剂消泡剂,培养基的成分,

28、80,概念： 构成微生物细胞和代谢产物中碳的营养物质。作用： 为正常生理活动和过程提供能量来源，为细胞物质和代谢产物合成提供碳骨架。,碳源,81,糖类：葡萄糖、淀粉、糊精和糖蜜脂肪：豆油、棉籽油、猪油醇类：甘油、乙醇、甘露醇、山梨醇、肌醇蛋白类：蛋白胨、酵母膏速效碳源：糖类、有机酸迟效碳源: 酪蛋白水解产生的脂肪酸,碳源的种类,82,概念： 构成微生物和代谢产物中氮素的营养物质作用: 为生长和代谢提供氮源种类：无机氮源、有机氮源,氮源,83,几乎所有微生物都能利用有机氮源黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、蛋白胨、酵母粉、尿素,有机氮源,84,氨水、铵盐和硝酸盐等。铵盐比硝酸盐更快利用。工业

29、应用：主要氮源和辅助氮源；调节pH值生理酸性物质：代谢后能产生酸性残留物质，如（NH4)2SO4利用后，产生硫酸生理碱性物质：代谢后能产生碱性残留物质。如NaNO3利用后，产生氢氧化钠。,无机氮源,85,概念：组成生理活性物质或具有生理调节作用的矿物质。作用方式：低浓度起促进作用，高浓度起抑制作用种类：P、S、K、Na、Mg、 Ca 常常添加Fe 、Zn 、Cu 、Mo、Co、Mn、Cl，一般不加,无机盐与微量元素,86,水,营养传递的介质参与细胞内一系列化学反应维持蛋白质、核酸等生物大分子稳定的天然构象良好导体，调节细胞生长环境温度菌体细胞的主要成分微生物通过水合作用与脱水作用控制由多亚基组

30、成的结构。,87,概念： 加入到发酵培养基中的某些化合物，被直接结合到目标产物分子中，而自身的结构无多大变化。使用： 添加前体是提高抗生素产量的重要措施 多次少量添加,前体（precurtsor）,88,概念： 维持微生物生长所必需的微量有机物，不起碳源和氮源作用。种类： 维生素、氨基酸、嘌呤或嘧啶及其衍生物、脂肪酸等。天然成分中含有：一般无需添加。,生长因子（growth factor）,89,概念： 促进产物生成的物质，但不是营养物，也不是前体的一类化合物。种类： 氯化物有利于灰黄霉素、金霉素合成。 表面活性剂吐温、清洗剂，脂溶性小分子化合物等，起诱导作用。,促进剂（accelerant）

31、,90,概念：降低泡沫的液膜强度和表面粘度，使泡沫破裂的化合物。种类：油脂类、酯类、硅油及聚氧乙烯聚氧丙烯甘油醚。天然动植物油脂类、高分子化合物（高碳醇脂肪酸和酯类、聚醚类、硅酮类）作用：消除泡沫，防止逃液和染菌。,消沫剂(defoaming agent),91,按用途：选择性、鉴别性、富营养培养基等按物理性质:固体、半固体、液体培养基按化学组成：合成、半合成、天然培养基按发酵过程中所处位置和作用：斜面或平板固体、种子、发酵和补料培养基。,培养基种类,92,概念： 细菌和酵母的固体斜面或平板培养基，链霉素和丝状真菌的孢子培养基。制备： 液体培养基添加1.0-2.0琼脂粉。作用：提供菌体的生长繁

32、殖，形成孢子,固体培养基,93,单细胞培养基：营养丰富，满足菌体生长迅速，不能引起变异。孢子培养基：基质浓度较低，无机盐浓度适量，以利于孢子形成。营养不宜太丰富，否则不易产生孢子。,固体培养基要求,94,概念： 供孢子发芽和菌体生长繁殖，摇瓶和种子罐培养基，液体。作用： 使种子扩大培养，增加细胞数目，生长形成强壮、健康和高活性的种子,种子培养基（seed medium）,95,培养基成分必需完全，营养丰富。用速效性、容易利用的碳、氮源和无机盐等物质，但浓度不宜高。种子培养基要与发酵培养基相适应，主要成分接近，不能差异太大。缩短发酵的延滞期。,种子培养基要求,96,概念：提供微生物生长、目标产物

33、生成的生产用培养基作用：不仅要满足菌体的生长和繁殖，还要满足菌体合成目标产物，是发酵生产中最关键和最重要的培养基。发酵培养基的要求： 营养物质浓度和粘度适中，组成上丰富完整。 不同菌种和不同产物，对培养基的要求差异很 大，组成和配方需要优化。,发酵培养基（fermentation medium),97,概念：发酵过程中添加补充的培养基。作用：稳定工艺条件，延长发酵周期，提高目标产物产量。组成：各种必要的营养物质，碳源、氮源、前体制备：按单一成分配制，各自独立控制，或按一定比例制成复合补料培养基,补料培养基,98,控制发酵培养基的质量,99,100,101,102,培养基设计一般原则,103,二

34、、灭菌操作工艺,104,由于各种发酵过程所用的微生物菌种、培养基以及发酵的条件、产物的性质不同，染菌造成的危害程度也不同。不管是对于哪种发酵过程，一旦发生染菌，都会由于培养基中的营养成分被消耗或代谢产物被分解，严重影响到产物的生成，使发酵产品的产量大为降低。,一）、染菌对不同发酵过程的影响,105,1）青霉素发酵过程：由于许多杂菌都能产生青霉素酶，因此不管染菌是发生在发酵前期、中期或后期，都会使青霉素迅速分解破坏，使目的产物得率降低，危害十分严重。2）核苷或核苷酸发酵过程：由于所用的生产菌种是多种营养缺陷型微生物，其生长能力差，所需的培养基营养丰富，因此容易受到杂菌的污染，且染菌后，培养基中的

35、营养成分迅速被消耗，严重抑制了生产菌的生长和代谢产物的生成。,106,3）柠檬酸等有机酸发酵过程：一般在产酸后发酵液的pH值比较低，杂菌生长十分困难，在发酵中、后期不太会发生染菌，主要是要预防发酵前期染菌。4）谷氨酸发酵：周期短，生产菌繁殖快，培养基不太丰富，一般较少污染杂菌，但噬菌体污染对谷氨酸发酵的影响较大。,107,种子培养期染菌,染菌发生的不同时间对发酵的影响,种子培养主要是使微生物细胞生长与繁殖，此时，微生物菌体浓度低，培养基营养十分丰富，比较容易染菌。若将污染的种子带入发酵罐，则危害极大，因此应严格控制种子染菌的发生。一旦发现种子受到杂菌的污染，应经灭菌后弃去，并对种子罐、管道等进

36、行仔细检查和彻底灭菌。由于接种量较小，生产菌生长一开始不占优势，因而它防御杂菌能力低，容易污染杂菌。,108,发酵前期染菌,在发酵前期，微生物菌体主要是处于生长、繁殖阶段，此时期代谢的产物很少，相对而言这个时期也容易染菌。染菌后的杂菌将迅速繁殖，与生产菌争夺培养基中的营养物质，严重干扰生产菌的正常生长、繁殖及产物的生成。原因：发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势；且还未合成产物（抗生素）或产生很少，抵御杂菌能力弱。在这个时期要特别警惕以制止染菌的发生。染菌补救措施： 可以用降低培养温度，调整补料量，用酸碱调pH值，缩短培养周期等措施予以补救。如果前期染菌，且培养基养料消耗不多，可以重新灭菌，

37、补加一些营养，重新接种再用。,109,发酵中期染菌,发酵中期染菌将会导致培养基中的营养物质大量消耗，并严重干扰生产菌的代谢，影响产物的生成。有的染菌后杂菌大量繁殖，产生酸性物质，使pH值下降，糖、氮等的消耗加速；菌体自溶，致使发酵液发粘，产生大量的泡沫，有时也会使发酵液发臭，代谢产物的积累减少或停止；有的染菌后会使已生成的产物被利用或破坏。措施 降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情况。如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐，或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐，抑制杂菌。,110,发酵后期染菌,由于发酵后期培养基中的糖等营养物质已接近耗尽，且发酵的产物也已积累较多，如果染菌量

38、不太多，对发酵影响相对来说就要小一些，可继续进行发酵。对发酵产物来说，发酵后期染菌对不同的产物的影响也是不同的，如抗生素、柠檬酸的发酵，染菌对产物的影响不大；肌苷酸、谷氨酸等地发酵，后期染菌也会影响产物的产量、提取和产品的质量。发酵后期发酵液内已积累大量的产物，特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。因此如果染菌不多，对生产影响不大。如果染菌严重，又破坏性较大，可以提前放罐。,111,发酵过程污染杂菌是发酵工业的致命伤。造成大量原材料的浪费，在经济上造成巨大损失扰乱生产秩序，破坏生产计划。遇到连续染菌，特别在找不到染菌原因往往会影响人们的情绪和生产积极性。影响产品外观及内在质量,112,显

39、微镜检查法,二）、染菌的检查和判断,用革兰氏染色法对样品进行涂片染色，显微镜下观察微生物的形态特征，根据生产菌和杂菌的特征进行区别、判断是否染色。如发现了与生产菌形态特征不一样的其他微生物存在，就可判断为发生了染菌。 此法检查杂菌最为简单、直接，也是常用的方法之一。必要时还可进行芽孢染色或鞭毛染色。,113,肉汤培养法,通常用葡萄糖酚红肉汤作为培养基，将待检样品直接接入经完全灭菌后的肉汤培养基中，分别于37C进行培养，随时观察微生物的生长情况，并取样进行镜检，判断是否染菌。 肉汤培养法常用于检查培养基和无菌空气是否带菌，同时此法也用于噬菌体的检查。,114,平板培养,将待检样品在无菌平板上划线

40、，分别于37C、27C进行培养，一般24h后即可进行镜检观察，检查是否染菌。有时为了提高平板培养法的灵敏度，也可以将需要检查的样品先置于37C条件下培养6h，使杂菌迅速增值后再划线培养。,无菌实验时，如果肉汤连续三次发生变色反应（由红色变为黄色）或产生浑浊，或平板培养连续三次发现有异常菌落的出现，即可判断为染菌。,115,抗生素发酵染菌原因分析（日本工业技术院发酵研究所） 项目 百分率%种子带菌或怀疑种子带菌 9.64接种时罐压跌零 0.19培养基灭菌不透 0.79总空气系统有菌 19.96泡沫冒顶 0.48夹套穿孔 12.36盘管穿孔 5.89接种管穿孔 0.39阀门渗漏 1.45搅拌轴密封

41、渗漏 2.09罐盖漏 1.54其它设备渗漏 10.13操作原因 10.15 原因不明 24.94,116,灭菌方法,化学灭菌,117,物理灭菌,118,培养基灭菌的操作方式,119,分批操作的灭菌过程,冷却降温：依次关闭排气、进气阀。罐压低于空气压力后，通入无菌空气，夹套通冷却水降温,通入蒸汽，加热升温：空气管、夹套通入蒸汽，升温至70，取样管、放料管通入蒸汽维持保温：120 ，罐压0.1MPa，排气。调节进气和排气量，维持30min。,120,连续灭菌操作,121,连续灭菌灭菌过程,122,连续灭菌的特点,三、微生物发酵的3种主要操作方式,1、分批发酵2、补料分批发酵3、连续发酵,123,1

42、24,四、发酵工艺条件的确定及主要控制参数,125,检测仪器和主要参数,126,生物学检测的主要参数和控制,127,128,129,物理参数的检测与控制,3.发酵过程的主要控制参数与检测,130,对一种微生物来说：超过它的最高生长温度可杀死它采用它的最适生长温度可培养它低于它的最低生长温度可保存它,131,温度的选择原则,132,温度的控制方式,133,压力的检测与控制,134,搅拌的检测与控制,135,化学参数的检测与控制,基质浓度pH溶解氧尾气,136,基质浓度的检测与控制,137,H的检测与控制,138,环境中微生物可生存的pH值范围在111之间，具体到每种微生物而言：细菌最适pH值在6

43、.57.5之间。放线菌最适pH值在7.58之间。 酵母菌、霉菌适合于pH56的酸性环境。因为微生物在生长过程中的代谢产物可以改变环境中的pH值，所以在培养微生物时，培养基不但要调节pH值，还要选择适合pH值的缓冲。 如磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液等。,139,控制pH的策略,140,通气条件对微生物生长的影响,好氧性微生物，在培养时必须保证通气条件良好。实验室中通常采用震荡培养或摇瓶培养，发酵生产中多采用通入无菌空气和搅拌等方法供氧。 厌氧性微生物，在培养时必须隔绝空气，通常采取的措施有：用焦性没食子酸吸收氧气、抽真空、加盖覆物以及密闭容器等，或采用厌氧培养箱、发酵罐等。,141,溶解氧的检测与

44、控制,标准：不影响呼吸或产物合成的最低溶解氧浓度供氧必需大于或等于溶氧，才能使发酵正常进行,142,影响供氧的因素,增加氧分压：通入富氧空气，增加溶氧浓度， 不经济提高罐压：增加CO2浓度，对设备要求高改变通气速率降低发酵温度改变培养基粘度中间补水添加表面活性剂间接策略：控制菌体浓度,143,废气检测与控制,144,泡沫的检测与控制,145,泡沫形成的原因及其影响,146,泡沫控制,培养基调整与工艺控制： 少加或缓加起沫基质； 改变发酵条件，如pH、升高温度、减少通气、 降低搅拌速率。 改变发酵工艺，如分批投料。加入消泡剂机械消泡,147,化学消泡,148,机械消泡,149,消泡剂的使用,150,发酵终点的判断,151,经济原则,在最大生产率时，终止发酵发酵总生产周期最短,152,产品质量原则,153,生物、物理、化学指标,154,发酵培养的操作方式,155,156,157,158,159,160,微生物发酵制药的应用,抗生素,维生素及辅酶类,其他类,蛋白质、多肽、氨基酸及核酸类,