重组人B淋巴细胞刺激因子工程菌高密度发酵.docx

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1、High Cell Density Fermentation of Recombinant Human B Lymphocyte StimulatorXue Xiao-Chang, Bao Chun-Jie, Han Wei, Qin Xin, Zhang Cun, Cao Zhu-Rong, Li Wei-Na, Zhao Yu-Hong, Zhang YingqiBiotechnology Center of Fourth Military Medical University , Xian 710032Abstract: In order to reach the goal of hig

2、h cell density fermentation and high level expression of recombinant human B lymphocyte stimulator (E. coli DH5a/ pKKH-BLyS). Pilot test of tube culture and flask shaking culture were done to get optimized culture conditions, including pH value for culture, inducer concentration of IPTG, induction t

3、ime and duration, range of dissolved oxygen and the manner of feeding. Then, we performed a three-time repeated fermentation under the established conditions. The final cell density was about 25 A600 and more than 50 g of wet bacteria per liter could be obtained. The average expression level of reco

4、mbinant protein was about 40% of total bacterial proteins. The results show that the established fermentation procedure is stable, of short cycle and with high expression, which lays the basis for further purification and large-scale production of BLyS.Key Words: B Lymphocyte Stimulator, Recombinant

5、 Escherichia coli, High cell density fermentation 重组人B淋巴细胞刺激因子工程菌高密度发酵薛晓畅 包春杰 韩苇 秦鑫 张存 曹筑荣 李维娜 赵玉红 张英起(第四军医大学药学系生物技术中心, 西安710032)摘要：为实现重组人B淋巴细胞刺激因子工程菌E.coli DH5a/pKKH-BLyS的高密度、高表达发酵, 首先进行了培养条件的摸索, 确定了该工程菌的最佳培养pH值、诱导剂IPTG的浓度、诱导的最佳时间段、溶氧范围以及补料的流加方式等, 根据优化条件，用5 L自控发酵罐进行三批重复发酵, 最终菌体密度均达到25 A600以上，菌体获得量均

6、可达湿重30 g以上，目的蛋白质的表达量占菌体总蛋白的40%左右，保持并超过了该重组蛋白在试管和摇瓶中的表达量。此发酵工艺具有周期短、产量高、重复性稳定性好等特点，为下游的纯化和进一步的大规模生产奠定了基础。关键词：B淋巴细胞刺激因子; 重组大肠杆菌; 高密度发酵中图分类号: Q516; TQ92 文献标识码:A 文章编号：B淋巴细胞刺激因子（B Lymphocyte Stimulator, BLyS）是1999年由瑞士和美国科学家发现的肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor, TNF）家族的一个新成员1。该分子含有285个氨基酸，属于II型跨膜蛋白。BLyS主要由T细胞和树

7、突状细胞等髓系来源的细胞分泌。BLyS以膜结合及可溶性两种方式存在于机体中，两者均具有生物学活性。研究表明BLyS在B细胞的存活和功能调节方面发挥着重要作用，它可以延长B细胞存活时间、促进其增殖，从而导致B细胞增生和自身免疫狼疮样变化的出现。BLyS的过度表达是发生自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、多发性硬化和类风湿性关节炎等的重要因素之一2-4。BLyS已经成为治疗自身免疫性疾病的有效靶点，我们构建了人BLyS疫苗表达重组载体，动物实验表明该重组疫苗对于多发性硬化和类风湿性关节炎动物模型均具有良好的保护作用5。但研究结果仅局限于实验室规模。欲真正实现其价值，必须借助于高密度发酵技术，将生产提高

8、到工业生产的规模。本文对重组人BLyS工程菌E. coliDH5a/pKKH-BLyS表达和生长的特有规律进行了初步研究，并建立了一个适用于工业化的高密度、高表达生产工艺。1 材料和方法1. 1 材料1. 1. 1 宿主菌和质粒宿主大肠杆菌E. coliDH5a supE44 lacU169 (80 lacZM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1 购自Invitrogen公司；原核非融合表达载体pKKH由浙江大学王宪锋博士赠送，重组质粒pKKH-BLyS由第四军医大学生物技术中心构建，基因的表达受Trc启动子控制，IPTG能诱导目的基因的表达，氨苄

9、青霉素抗性。1. 1. 2 培养基LB 培养基用于试管种子培养，2YT培养基用于三角摇瓶培养，半合成培养基用于5 L发酵罐中分批补料培养。LB 培养基中含有(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10；半合成培养基中含有(g/L)：磷酸盐适量( KH2PO4K2HPO4Na2HPO412H2O =247), (NH4) 2SO4 1.8，NH4Cl 0.3，蛋白胨4.5，酵母粉2.25，甘油适量和微量元素(MgSO4 7H2O 0.3)；补料基质中含有(g/L)：甘油适量，酵母粉5，蛋白胨10，MgSO47H2O 0.6。用5 mol/ L NaOH 溶液，将溶液的pH值全部调为7.0。培

10、养基和补料在121高压灭菌20 min，各种培养基中都加入氨苄青霉素。1. 1. 3 仪器Biostat-CT5型5L自动发酵罐，德国B Brown公司；J2-SH型冷冻高速离心机为美国Bechman公司产品；微量蛋白电泳仪为Bio-Rad公司产品；Ultrascan XL灰度扫描仪为LKB产品。1. 2 方法1. 2. 1 试管表达取-70保存甘油菌种，划线接种于含氨苄(100 g/ml)的LB平板，37培养过夜，挑取单克隆菌落于5 ml LB试管中，37，200 r/min振摇培养至A6000.60.8，加入IPTG诱导表达，将表达量最高的克隆作为发酵用种子，分装冷冻保存，每批发酵取出一管

11、，以保证菌种的稳定性。未诱导菌液可作为活化种子保存于4。1.2. 2 摇瓶培养2%活化种子接种于含150 ml 2YT的500 ml摇瓶中，37，200 r/min振摇培养至对数中期，加入IPTG诱导或作为5 L发酵罐的菌种。1. 2. 3 5L自控发酵罐中分批补料培养取三角瓶种子液按3%接种入发酵罐。控制参数为溶氧及转速：溶氧控制在30%50%，达到最大转速800 r/min后, 自动通入纯氧。温度控制为37。pH值设定为7.0，当pH低于该值时，通过流加30%的氨水来保持恒定。补料流加方案为发酵过程中06 h不加补料，68 h补料流速设定为50 ml/ h, 810 h补料流速设定为100

12、 ml/h 。1. 2. 4 重组BLyS表达量测定按常规SDS-PAGE检测，灰度扫描仪分析重组蛋白占菌体总蛋白的百分含量。1. 2. 5 菌体浓度测量采用称重法和浓度法，A600 nm吸收值与细胞干重呈线性。一个单位的A600约为干菌0. 4 g/L。1. 2. 6 菌体总蛋白测定Bradford法测菌体总蛋白，总平均值为0. 525 g/g (蛋白/干菌体) 6。2 结果2. 1 试管培养及条件优化2. 1. 1 试管培养中诱导表达时间的优化试管培养至对数中期(A600 =0.6), 加入0.1 mmol/ L IPTG诱导重组蛋白的表达，每0.5 h取样一次，SDS-PAGE分析表达情

13、况。结果表明诱导1 h后外源蛋白即开始表达，表达水平在3 h内迅速提高，4 h达到高峰，5 h后开始下降，菌体密度也有所降低。由此确定发酵结束时间可以在诱导后45 h，控制在菌体密度开始下降前。 1 2 3 4 5 6Fig.1 工程菌发酵的菌体生长曲线和目的蛋白表达水平。1: 未诱导菌体总蛋白; 2: 诱导1小时菌体总蛋白; 3: 诱导2小时菌体总蛋白; 4: 诱导3小时菌体总蛋白; 5: 诱导4小时菌体总蛋白; 6: 诱导5小时菌体总蛋白.2. 1. 2 IPTG浓度对重组蛋白表达水平的影响试管培养至A600 =0.6时，加入IPTG至0. 01、0. 02、0. 05、0.1、0.2、0

14、.5、1.0、2.0 mmol/L终浓度，诱导表达4 h，最终菌体密度为1.5 A600，取样用SDS-PAGE检测。结果可见0.01 mmol/L IPTG即有诱导外源蛋白表达的能力，在0.012 mmol/L时，IPTG诱导浓度对目的蛋白质的表达水平没有显著性影响。本文发酵中采用0.5 mmol/L IPTG诱导菌体浓度为25 A600左右的菌体表达，取得了良好的结果。1 2 3 4 5 6 7 8 9Fig.2 不同浓度IPTG诱导剂对于TT-BLyS蛋白质表达水平的影响 1: 未诱导菌体总蛋白; 2-9: 0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1和2 mmol/L IP

15、TG诱导后菌体总蛋白.2. 2 三角瓶培养中诱导时机对细菌生长和蛋白表达的影响利用特制的通气良好的三角瓶进行培养，在细菌生长的对数早、中、晚期(分别培养4 h、6 h、8 h)加入0.1 mmol/ L IPTG进行表达4 h，结果表明在中期诱导不仅最终菌体密度较高，重组蛋白的产量也较其它各期更高。如在早期诱导，虽然表达量比较高，但是由于诱导剂的抑制效果收菌量明显下降；在晚期进行诱导，尽管诱导时菌体密度更高，但诱导后细菌生长很快进入衰亡期，并有自溶倾向，因而表达外源基因的能力也随之下降。2. 3 5L发酵罐中工程菌的高密度、高表达培养图3显示DH5a/pKKH-BLyS高密度高表达培养发酵的在

16、线控制图。整个发酵过程中pH控制在7.0左右，温度37，溶解氧35%左右，转速于8 h左右达到800 r/min并开始利用纯氧。发酵开始的06 h，培养基中含有一定的营养物质，故不加补料，6 h后pH逐渐升高，说明培养基中碳源已耗尽，细菌生长分解氮源，结果代谢产生NH4+而使pH升高，此时是补料的最佳时期，同时加入0.5 mmol/ L IPTG，诱导表达BLyS后细菌的生长开始逐渐减缓，于诱导后4 h终止发酵(图3)，最终菌体密度为25 A600， SDS-PAGE(图4)后激光灰度扫描得重组蛋白的表达量约为40%（最高可以达到47%）。Fig.3pKKH-TT-BLyS/DH5a工程菌补料

17、分批培养的菌体生长曲线和TT-BLyS表达曲线 1 2 3 4 5 6 7 A BFig.4 TT-BLyS表达水平的SDS-PAGE及灰度扫描鉴定A：1: 蛋白质分子量Marker; 2,4,6: 未诱导菌体总蛋白; 3,5,7: 诱导后蛋白表达情况.B: 目的蛋白质SDS-PAGE分析的灰度扫描结果.3 讨论基因工程菌的发酵不同于传统发酵工艺，前者带有外源克隆基因的重组表达载体，发酵生产的目的是要获得大量的外源基因产物，尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染。重组大肠杆菌高密度培养受表达系统、培养基、培养方式、发酵条件控制等多种因素的影响7,8，对菌体高密度培养的同时实现高表达的研究报道不多。在

18、实际操作中，需要对各种因素进行优化，建立最佳的发酵工艺。在本研究中，我们对单因素逐个优化，最终达到对整个工艺的优化。我们采用建立的中试发酵工艺，三批重复试验结果，最终菌体密度均超过A 600 nm25，菌体获得量均达湿质量浓度50 g/L 以上，目的蛋白表达量均高于40%，比试管和摇瓶的表达水平略有提高，取得了较佳的结果。试管和摇瓶培养条件的摸索对发酵的成功很关键，其中,碳源的选择至关重要，对于大肠杆菌，高浓度的葡萄糖将造成乙酸盐的堆积，降低工程菌产量和表达量。因此,选用甘油作为碳源较好。由于各种工程菌都有其自身的生长和表达规律，发酵的另一个重要因素就是外源蛋白最佳的诱导时机。诱导后，携带质粒

19、的细胞生长速率显著降低，而不带质粒的细胞则不受影响。因此，提前诱导使菌体和目的蛋白的产量降低，同时也增加了染菌的机会。而诱导较晚虽可以获产量高的菌体量，但细菌已经开始老化，其生长和表达外源蛋白的能力会下降，同时表达外源蛋白消耗的大量能量会促使细菌的生长进入衰亡期，很容易导致溶菌。本文通过对诱导时机的优化，使得整个发酵过程在10 h内完成，既实现了重组蛋白的高表达、高产率，同时也降低了成本。补料的流加方式直接影响着发酵的效果。分批补料培养的特点是，在培养过程中不断补充培养基，使菌体在较长时间里保持稳定的生长速率，从而达到高密度生长。但是在补料流加过程中，既不能加入得过快，也不能加入得过慢。过慢则

20、无法满足逐渐增加的菌体生长需要，同时也使培养过程中产生的抑制性副产物大量积累；而过快则使携带目的蛋白的质粒没有充裕的时间复制，降低目的蛋白的表达量；而且快速的细菌生长还易引发质粒的不稳定性。有报道表明，大肠杆菌通过分批补料发酵，每升培养液最高可得到50 g干菌种，A600 nm可达125左右。在我们实验中，严格控制补料流加的速度，在有效提高菌体产量的同时提高目的蛋白表达量。高密度发酵技术能够减少培养体积,缩短生长周期,减少设备投资并强化下游分离提取,为工业化生产降低成本。本文对重组DH5a/pKKH-BLyS的高密度、高表达发酵研究将可能对其它类型重组蛋白的发酵生产具有一定的借鉴作用。Refe

21、rences: 1 Moore P A, Belvedere O, Orr A, et al. BLyS: member of the tumor necrosis factor family and B lymphocyte stimulatorJ. Science, 1999, 285(5425): 260-263.2 Huntington N D, Tomioka R, Clavarino C, et al. A BAFF antagonist suppresses experimental autoimmune encephalomyelitis by targeting cell-m

22、ediated and humoral immune responsesJ. Int Immunol, 2006, 18(10): 1473-1485.3 Zhang J, Roschke V, Baker K P, et al. Cutting edge: a role for B lymphocyte stimulator in systemic lupus erythematosusJ. J Immunol, 2001, 166(1): 6-10.4 Cheema G S, Roschke V, Hilbert D M, et al. Elevated serum B lymphocyt

23、e stimulator levels in patients with systemic immune-based rheumatic diseasesJ. Arthritis Rheum, 2001, 44 (6):1313-1319.5 Xue X, Feng G, Li M, et al. Amelioration of experimental autoimmune encephalomyelitis by BLyS autovaccineJ. Vaccine, 2008, 26(23): 2873-2881.6 李民,朴勤,陈常庆,等. 利用恒溶氧-补料分批技术高密度培养大肠杆菌生

24、产重组人骨形成蛋白2AJ. Chinese Journal of Biotechnology (生物工程学报),1998 , 14 (3): 270-276.7 刘文波，柴同杰. 大肠杆菌高密度发酵研究J. 动物科学与动物医学, 2001, 18(1):27-29.8 MacDonald H L, Neway J O. Effects of medium quality on the expression of human interleukin-2 at high cell density in fefmentor cultures of Escherichia coli K12J. Appl Environ Microbiol, 1990, 56 (3): 640-645.