真核基因表达调控讲座讲义课件.ppt

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1、真核基因表达调控讲座,基本概念,管家基因：执行重要生物功能，在生物体几乎全体细胞中持续表达的基因。如 rRNA、通用转录因子、代谢酶系、细胞骨架蛋白等。组成性表达：基因表达不受外界因素影响，在各生长阶段、各种组织里持续表达或变化很小。,奢侈基因（luxury gene）：仅在特定细胞内选择表达的基因，决定分化细胞的独特性状。诱导/阻遏表达：在特定环境信号的刺激下，基因的表达开放或增强 / 关闭或下降的现象。,第 一 节真核基因表达调控的特征Features of Eukaryotic Gene Regulation,一、顺式作用元件是决定真核基因转录活性的关键因素之一,（一） 启动子是RNA聚

2、合酶结合并启动 基因转录的特异DNA序列,真核基因的启动子指的是RNA聚合酶（RNA polymerase，RNA Pol）识别、结合的基因转录调控区中启动基因转录的一段特异DNA序列。,1. 近起始点的TATA盒/起始子及CpG岛 是真核生物启动子的核心序列,有一些编码蛋白质基因的转录可有多个起始点，可产生含不同5末端的mRNA。,它们不含TATA盒或起始子，多在起始位点上游约100 bp内含有2050个核苷酸的CG序列，被称做CpG岛（CpG island）。,这些基因大多为低转录基因，编码中间代谢酶的管家基因。,(二）增强子决定基因的时空特异性表达,增强子（enhancer）,是能够结合

3、特异基因调节蛋白，促进邻近或远隔特定基因表达的DNA序列；在酵母中，被称为上游活化序列（upstream activator sequences, UASs）。,增强子的作用通常与其所处的位置和方向无关。,增强子距转录起始位点的距离变化很大，从100 nt到50,000nt，甚至更大。但总是作用于最近的启动子。,增强子所处位置,在所调控基因的上游或下游，但主要位于上游。下游内含子当中，乃至下游最后外显子以外的序列也可含有增强子。,很多哺乳动物基因受一个以上的增强子调控。,（三）沉默子阻遏基因转录,沉默子(silencer)是指某些真核基因转录调控区中抑制或阻遏基因转录的一段（数百bp）DNA序

4、列。沉默序列促进局部DNA的染色质形成致密结构，从而阻止转录激活因子结合DNA，是基因转录的负性调节因素。,二、反式作用因子 是真核基因的转录调节蛋白,在真核细胞核中，有许多蛋白质能够帮助RNA聚合酶转录RNA。这类蛋白质统称转录因子（transcription factors，TF），转录调节蛋白（transcription regulatory proteins）或反式作用因子（trans-acting factors）。,（一）Pol转录需要通用转录因子和特异 转录因子,* 通用转录因子(general transcription factors),是RNA聚合酶结合启动子所必需的一组蛋

5、白因子，决定三种RNA(mRNA、tRNA及rRNA)转录的类别。,* 特异转录因子(special transcription factors),为个别基因转录所必需，决定该基因的时间、空间特异性表达。,转录激活因子,转录抑制因子,转录调节因子结构,（二）转录因子含有不同的DNA结合域,螺旋-转角-螺旋是转录因子中的常见的DNA结合域 同源异型域结构与HTH结构域类似 锌指结构是一类含锌离子转录因子的DNA结合域 亮氨酸拉链结构域既可介导结合DNA又可介导蛋白质二聚体化 碱性螺旋-环-螺旋结构域也可同时介导结合DNA和蛋白质二聚体化,1. 螺旋-转角-螺旋是常见的DNA结合模体,同源异形结构

6、域,2. 锌指结构是一类含锌的蛋白质结合模体,3. 亮氨酸拉链同时调节DNA结合与蛋白质二聚化,4. 碱性螺旋-环-螺旋结构也可调节DNA结合及蛋白质二聚体化,（三）转录因子含有不同的转录激活域,富含谷氨酰胺的转录激活域 富含脯氨酸的转录激活域 酸性氨基酸转录激活域,三、正性调节占主导的真核基因表达调控机制更加复杂,*不同的DNA元件组合可产生多种类型的转录调节方式；* 多种转录因子又可结合相同或不同的DNA元件；* 转录因子与DNA元件结合后，对转录激活过程所产生的效果各异，有正性调节或负性调节之分。,第 二 节真核基因表达的染色质水平调控Chromosomal Regulation ofE

7、ukaryotic Gene Expression,基因活化蛋白质改变局部染色质结构,异染色质（heterochromatin）是转录非活性的。,常染色质（euchromatin）中的转录活性区域对核酸酶敏感，特别是转录基因的5-侧翼区1000 nt以内是高敏感位点(hypersensitive sites)。这些区域核小体的相对缺少也使得转录因子易于与之结合。,转录活化染色质与非活化染色质在结构上有很大不同。,染色质重塑（chromatin remodeling）,基因活化蛋白质可以通过改变基因的启动子和调节序列区域的染色质结构来促进转录开始。这种改变局部染色质结构的过程被称为染色质重塑 。

8、,最主要的两种方式：,染色质重塑,组蛋白乙酰化,位点：组蛋白乙酰化转移酶（histone acetyl transferases, HATs），也称组蛋白乙酰化酶（histone acetylase）主要作用于核小体的核心组蛋白所富含的赖氨酸残基，降低整个核小体对DNA的亲和性。,时间：基因活化蛋白质结合在转录调节区域后。,作用：使染色质进入转录活性状态乙；还可能促进或防止与其他转录或调节相关蛋白的相互作用。,逆转：组蛋白脱乙酰化酶(histone deacetylase)减少核小体的乙酰化，使染色质恢复转录非活性状态。,第 三 节真核基因表达的转录水平调控Transcriptional Re

9、gulation of Eukaryotic Gene Expression,基因转录激活调节基本要素:,基因的结构、性质,细胞内所存在的转录调节蛋白,生物个体或细胞所处的内、外环境,真核细胞基因开关的分子机制比原核复杂,基本共同点：转录起始的调节是关键点,根本不同点：,原核生物：启动子在缺少转录因子情况下就具有天然活性 真核生物：启动子在缺少调节蛋白的情况下往往没有活性,一、转录起始调控发生在转录起始复合物的组装过程,转录活化蛋白与增强子的结合；通用转录因子在启动子处的组装；辅助激活子(coactivator)和/或中介子（medicator）在通用转录因子/RNA聚合酶II复合物与转录活化

10、蛋白之间的辅助和中介作用。,启动转录需要多种蛋白质因子的协同作用。 包括：,反式因子的激活方式多种多样,表达式调节：当需要时合成反式因子，不需要时则将之降解；共价修饰调节蛋白的活性：磷酸化去磷酸化；糖基化；与配体结合引起功能变化；蛋白质蛋白质相互作用：二聚体形成。,基因活化蛋白与增强子结合后如何影响到远距离的RNA聚合酶结合位点，有以下几种模式：,通过扭曲作用使DNA链发生构型变化，更适合于通用转录因子与RNA聚合酶结合, 并通过直接接触或通过辅活化子/中介子而影响通用转录因子和RNA聚合酶的组装。,扭曲（twisting）,沿DNA滑动，直到接触另一个特异DNA序列结合的转录因子，发挥作用。

11、,利用DNA分子的柔曲性弯曲成环，使增强子区域与RNA聚合酶结合位点靠近，直接接触或通过辅活化子/中介子而发挥作用。,滑动（sliding）,成环（looping）,反式因子与顺式元件的作用，促使另一种反式因子与邻近的顺式元件作用。,反式因子的协同效应,（一）mRNA 5端加帽和3端加尾修饰利于mRNA稳定性和转运,除组蛋白外，所有真核细胞mRNA都有5端的“帽”和3端的Poly(A)尾结构 。,5端的“帽”和3端的Poly(A)尾均有其特有的作用。,二、转录后调控涉及修饰、剪接、编辑、定向转运多个环节,5加帽的作用在于：,有助于保护mRNA免于被核糖核酸酶降解；,5帽结合蛋白复合体参与mRN

12、A和核糖体的结合来起始翻译 。,促进mRNA从细胞核运输到细胞浆；,协助mRNA的剪接。在剪接第一个外显子时，剪接体的形成需要帽结合蛋白的参与；,oly(A)尾可结合一种或多种特殊蛋白，避免mRNA被酶降解，并在翻译过程中具有重要作用。许多原核mRNA也含有Poly(A)尾，但是此尾的功能是促进mRNA降解，而不是保护mRNA免于被降解。,oly(A)尾的作用：,（二）可变性剪接可使初始转录本产生不同的成熟mRNA,许多初始转录本可以通过一种以上的选择性剪接（alternative RNA splicing）方式，去除不同的内含子而被加工形成不同的mRNAs，因而形成不同的多肽。,人视黄醛还原

13、酶mRNA的选择性剪接,mRNA,Pre-mRNA,同种异型mRNA,通过选择性剪接决定果蝇的性别,（三）编辑加工可增加mRNA分子信息的内涵,某些mRNAs在翻译前被编辑(editing)。,（四）成熟mRNA的核外输出也会影响基因表达,现象：估计有1/5的核内成熟mRNAs能进入细胞浆。留在核内的mRNAs约在1小时内降解。mRNA通过核膜的过程是一个主动运输过程，常常需要借助于核输出受体(nuclear export receptors)才可穿过9nm的核孔通道。,（五）某些mRNA定位于细胞质的特殊区域,现象：一些mRNA分子携带有信息，可以在翻译开始前自我导向定位于细胞内的特定位置。

14、,作用：在细胞的特定部位集中产生所需要的大量蛋白质。,mRNA分子的3种不同定位过程,（六）通过改变mRNA分子的稳定性 调控基因表达,意义：降解途径保证mRNA不在细胞中累积并避免合成过多的蛋白质。,不同真核基因的mRNA的降解速率大不相同。,暂时需要的基因产物：半衰期可能仅为几分钟、甚至几秒钟。,经常需要的基因产物：其mRNA 可在多代细胞中稳定存在。,真核细胞mRNA降解有两种途径，是由每种mRNA分子的序列所决定。,Poly(A)的逐渐短缩：最常见的途径,mRNA分子一旦进入细胞浆中，核酸外切酶会使Poly(A)末端逐步短缩，当剩下约30个A时，5端发生脱帽，mRNA分子被迅速降解。,

15、一些mRNA分子的3UTR的特殊序列有助于特殊蛋白质的结合，增加或降低Poly(A)短缩的速度。,可将Poly(A)直接从mRNA分子上切除。这种切除也有赖于mRNA分子的3UTR特殊序列可以被内切酶识别。,另一个途径始于特殊内切酶的作用,转铁蛋白受体(transferrin receptor, TfR) mRNA分子 3UTR柄环（stem-loop）结构铁反应元件(iron-response element，IRE)。,例如：,IRE-BP对转铁蛋白受体mRNA稳定性的调节,（七）mRNA分子细胞质中添加Poly(A) 控制蛋白翻译,在一些情况下，特殊的Poly(A)尾端可以在细胞浆得以延

16、伸。,例：正在成熟中的卵母细胞与卵细胞,一些存在于细胞浆的mRNA分子的3末端只有1030个腺苷酸（A），它们并不翻译。在卵母细胞成熟和受精后的一个特定时段，当需要这些mRNA所编码的蛋白质时，Poly(A)被添加到这些选定的mRNA分子，大大促进它们翻译的开始。,（八）无义变化介导的mRNA降解是真核mRNA的监视系统,无义变化介导的mRNA降解 (Nonsense-mediated mRNA decay, NMD）,当在同一阅读框架内的翻译终止密码子UAA、UAG或UGA提前出现在最后两个外显子交界处上游约50 nt处时，mRNA被迅速降解。这些错位终止密码子被称为成熟前终止密码子（pre

17、mature termination codons, PTC），可以来自突变、重组、不完全或不正确剪接。,无义变化介导的mRNA的降解,（九）RNA干扰是一种基因转录后沉默机制,RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是由双链RNA（double-strandedRNA，dsRNA）引发的转录后基因静默机制。是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制.,萌芽阶段：植物的基因共抑制,1990年，为了使矮牵牛花的颜色更鲜艳，Napoli等把与紫色相关的chalcone synthase基因转染到牵牛花中。结果发现，花的颜色不但没有变得更鲜艳，而且连内源

18、性的chalcone synthase基因都被抑制，花瓣褪色了。这种现象被称为基因共抑制。,正义RNA也能引起基因沉默？,1995年，在研究线虫 par-1 基因功能时，康奈尔大学的博士研究生郭苏用反义（antisense）RNA方法来看其功能，发现基因被抑制。但她用正义RNA来作对照时，发现基因也被抑制。这种结果出乎意料之外，也对实验结果和论文没有帮助。但Guo和Kemphues仍然诚实地发表了这个结果。,RNA干扰理论的诞生,1998年，Fire与Mello对上述现象以合理的解释，即：以往制备的RNA单链分子不纯，无论正义或反义RNA都混杂了少量的双链RNA（dsRNA），而真正的基因沉默

19、效应来自dsRNA，而非正义或反义RNA。2006年，Fire和Mello获得Nobel生理学与医学奖。,人们曾认为哺乳动物细胞不存在RNAi机制，原因是：如果直接向哺乳动物细胞注射dsRNA，将引起干扰素样反应（PKR或OAS激活，抑制翻译，导致细胞死亡）。解释：随着生物进化，高等动物免疫系统取代了低等物种中RNAi所承担的抵抗病毒的功能。因此RNAi在高等动物中不存在。（错误的观点）,哺乳动物细胞的RNAi,最早认为哺乳动物也有RNA干扰机制的，是MIT肿瘤研究所的Sharp（因内含子剪接理论获1993年Nobel奖）。2001年，Sharp的学生Tuchl证实哺乳动物体内也存在RNAi机

20、制。Tuchl发现，长度为21-25 nt的siRNA（小分子干扰RNA）瞬时转染体外培养的哺乳动物细胞能诱导RNAi，但并不启动细胞的程序性死亡而且不导致干扰素样反应。,经典RNAi途径：siRNA介导的RNAi,在siRNA介导的RNA干扰过程中，dsRNA被Dicer降解为siRNA分子，然后结合胞浆中的RISC复合物，导向到mRNA相应的位点，切割并降解mRNA，使基因表达终止。,Novina and Sharp Nature 430:161 2004,防止转座子引起的基因组不稳定性。防御病毒的感染。,生物学意义,microRNA（miRNA）,miRNA干扰途径的发现是RNAi机制提

21、出后的又一个重大的生物学突破。目前共发现600多种miRNA，且在继续发现中。miRNA是内源性的小RNA，广泛分布于植物、线虫、果蝇和哺乳动物中，在胚胎发育、疾病等许多生理、病理过程中发挥重要作用。,The structure of human pri-miRNAs,第 四 节真核基因表达的翻译水平调控Translational Regulation of Eukaryotic Gene Expression,一、翻译起始因子-2的磷酸化调节 蛋白质翻译,条件变化活化了特殊的蛋白质激酶，使翻译起始因子eIF-2（eukaryotic initiation factor，eIF-2）磷酸化所致

22、。,二、5端或3端非翻译区特异RNA 结合蛋白介导蛋白质翻译负调控,一些转录抑制蛋白质结合到mRNA的5端抑制转录起始，而另一些抑制蛋白质则识别特殊mRNA分子的3UTR，通过干扰3Poly(A)尾与5端帽的联络而减少翻译的启动。,IRE-BP对铁蛋白mRNA翻译的调节,低铁状态,三、真核mRNA不同翻译起始点的调控,易遗漏扫描：当不利于识别时，扫描的核糖体小亚基有时可以无视第一个AUG而滑向第二个，甚至第三个AUG，这种现象被称为易遗漏扫描（leaky scanning），可以使一个mRNA分子产生两个或更多仅氨基末端不同的相关的蛋白质。在一些情况下，细胞可以通过易遗漏扫描调节这些不同长度蛋白质的相对丰度。,上游开放阅读框架（upstream open reading frames , uORFs）：在有些mRNA 分子中，起始密码子AUG的上游（5UTR）有一个或几个AUG，这些上游开放阅读框架与正常的开放阅读框架多不一致，翻译后很快会遇到终止密码子而释出无功能的多肽。,意义: 在于其调节功能，它们的AUG可以与正常起始密码子AUG竞争扫描核糖体起始复合物，翻译无功能的多肽而使正常翻译维持在较低水平。,