第9章糖类化合物课件.ppt

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1、2022/12/20,1,第9章 糖类化合物,1.概述与分类2.性质3.作用与用途4.制备方法5.提取分离实例 植酸钙镁、肌醇、猪苓多糖、肝素、肝素钙、 硫酸软骨素、冠心舒、甲壳素和壳多糖、透明质酸,思考题,课堂设问,2022/12/20,2,一、概述与分类,人体与外界环境所交换的物质是多种多样的，其中就量来说，除水之外，以糖为最多。一个人平均每天进食约500g，其中80%以上属于糖类物质，主要供给机体所需能量（靠糖供给占总量的70%以上）。 糖是机体的组成成分之一。如葡萄糖存在于一切组织中；糖原（又叫动物淀粉）在肝及肌肉中含量最多，如肝糖，约占肝质量的18%；核糖及脱氧核糖是核酸及核蛋白不可

2、缺少的组成成分；细胞间质及结缔组织中含有大量的粘多糖类物质。 糖与蛋白质结合成糖蛋白，是一些组织器官的结构物质。 常见的糖基有半乳糖、甘露糖、乙酰氨基葡萄糖、乙酰氨基半乳糖、岩藻糖和唾液酸等。糖基在糖蛋白中的作用有的与活性有关，有的与抗原性有关，如绒毛膜,2022/12/20,3,促性激素是一种糖蛋白，当分子中的唾液酸糖基除去后，就失去了激素的活性。现在知道细胞的“识别”功能，常与膜上糖脂或糖蛋白的糖链有关。 研究较多的、具有一定的生物活性的多糖是来源于植物的有黄芪多糖、人参多糖、刺五加多糖、麦麸多糖、黄精多糖、昆布多糖、菊糖、褐藻多糖、茶叶脂多糖、葡萄皮酯多糖、猪苓多糖、箬叶多糖、麦秸半纤维

3、素B、针裂蹄多糖、亮菌多糖、酸模多糖、地农多糖、海藻多糖、侧耳菌多糖、薛荔果多糖和当归多糖等。 来源于微生物的有银耳多糖、香菇多糖、灵芝多糖、黑木耳多糖、芸芝多糖、茯苓多糖、竹黄多糖、木蹄多糖、泽蘑菇多糖、蘑菇多糖、裂褶多糖、酵母多糖、细菌脂多糖、大肠杆菌（脂）多糖、变形杆菌（脂）多糖、伤寒杆菌（脂）多糖、变形杆菌热源多糖等。,2022/12/20,4,从化学结构看，糖是一大类多羟基醛或酮的化合物，依据其结构特点分为（单糖、聚糖、糖的衍生物）： 1. 单糖 单糖是简单的多羟基醛或酮的化合物，主要是六碳糖如葡萄糖、果糖和半乳糖等。五碳糖重要的是核糖和脱氧核糖，均为核酸的组成部分。 氨基糖有2-脱

4、氧氨基葡萄糖、 2-脱氧氨基半乳糖、胞壁（糖）酸（Muramic acid）、唾液酸等。 糖酸有葡萄糖酸及特殊的糖酸-维生素C等。 糖醇是单糖的还原产物，具有重要药用价值的有甘露醇和山梨醇。肌醇是环己六醇，通常以游离形式存在于动物肌肉、心、肝、肺等组织中。,2022/12/20,5,2. 聚糖 聚糖是各种单糖的缩聚物。一般由20个以下单糖基组成的称为低聚糖，20个以上的称为多糖。依据单糖种类的不同，由1种单糖构成的多糖称纳多糖或同质多糖，由2种以上单糖构成的多糖称杂多糖。 低聚糖主要有蔗糖、麦芽糖、乳糖、棉籽糖等。 纯多糖主要有右旋糖酐、甘露聚糖（酵母）、果聚糖、香菇多糖、茯苓多糖、淀粉等。

5、杂多糖主要有肝素、硫酸软骨素、透明质酸等。 3. 糖的衍生物 单糖的磷酸酯有葡萄糖-6-磷酸、果糖-1,6-二磷酸、核糖-5-磷酸、磷酸肌醇等。 糖苷是单糖的半缩醛上羟基与非糖物质缩合形成的化合物，糖苷的非糖物质称配基或非糖体。自然界中配基以氧原子与糖基连结的为O-糖苷，如-甲基葡萄糖苷；配基以氮原子与糖基连结的为N-糖苷，主要是核糖的糖苷，如腺嘌呤核苷。,2022/12/20,6,二、性质,单糖分子中的醛基具有还原性，其酮基由于相邻的2个碳上有羟基也具有还原性，能使碱性的Cu2+还原成氧化亚铜，与银氨溶液产生银镜反应，糖氧化变成糖酸。 单糖与苯肼反应产生沉淀，常温时，糖与1分子苯肼缩合成糖的

6、苯腙，在过量苯肼中加热反应，糖与2分子苯肼缩合物称糖脎。 单糖在稀酸溶液中稳定，但在稀酸中加热时或在强酸作用下颜色变深，发生脱水环化，形成呋喃甲醛类化合物，它们能与多酚等试剂形成有色物质。不同的单糖在反应后颜色亦不同。常用糖的显色剂和特点，见下页表。 单糖在浓碱溶液中很不稳定，能发生裂解、聚合、异构化反应，在稀碱溶液中常温下产生差向异构体。,2022/12/20,7,糖的显色试剂表,2022/12/20,8,葡萄糖在氨水中，37时，可以分离出果糖、山梨糖、甘露糖和D-阿拉伯糖，若延长反应时间，可以产生氨基糖及吡嗪、咪唑杂环等50多种化合物。 低聚糖如二糖的单糖基有两种状态，一种是单糖基以它的半

7、缩醛羟基结成糖苷键，另一种保留了半缩醛羟基而以其他位置的羟基参与糖苷键，它们像游离的葡萄糖一样有还原性、变旋性、与苯肼成脎等性质。缺乏游离半缩醛羟基的低聚糖称非还原糖，没有还原糖的上述反应性质。 多糖的相对分子质量很大，分为直链和支链两种，多带有负电荷，水合度较大，水溶液具有一定的粘度。能被酸或酶水解变成单糖和低聚糖或其他组成多糖的成分。 近年来研究含糖醛酸和氨基糖基的多糖，发现均具有酸性，其酸性强弱是： 肝素硫酸乙酰肝素硫酸软骨素A和C透明质酸。,2022/12/20,9,三、 作用与用途,粘多糖类生化药物很引人注目，尤其在抗凝、降血脂、提高机体免疫力和抗癌等方面，都发现有很强的生理作用和治

8、疗效果。 如：肝素是天然抗凝血物质，其机制是抑制凝血酶原变成有活性的凝血酶，能阻止血小板的凝集和破坏，抗肿瘤转移的作用机制是肝素分子中带有大量的负电荷，在血液中与癌细胞结合后，增加了细胞的负电荷，因而和带负电荷的血管内膜相斥，使癌细胞不易在血管内膜上附着，也不易穿过细胞间隙，不利于肿瘤的转移。临床应用预防和治疗血栓、周围血管病、心绞痛、充血性心力衰竭、手术后的血栓形成和肿瘤的辅助治疗，对肝素的结构进行某些改造（降解、砜化、酯化），能降低抗凝性，提高降血脂作用，可以口服给药。 又如：硫酸软骨素商品名康得灵，具有利尿、解毒、镇痛作用，对链霉素引起的听觉障碍有一定的疗效，还用于动脉硬化。肾病、神经痛

9、、偏头痛、各种中毒、眼疲劳、手术后粘连等疾病的治疗。,2022/12/20,10,四、 制备方法,制取糖类生化药物的原料，在自然界中是丰富的，有动物的组织器官，有植物如海带、海藻等。利用微生物发酵也是很早被人类发现并应用于生产实践中的，如葡萄球菌、肠膜状明串珠菌、酵母菌等。微生物在生长时，都能分泌一种酶到细胞外面，可以把单糖和多糖连接起来制造多葡聚糖，还是细胞壁的重要组成成分。 由于原料来源的不同，各种药物性质的不同，没有一个统一规范的提取和纯化工艺。 本节只介绍多糖和粘多糖一般分离纯化方法（非降解法、降解法和分级分离法）。,2022/12/20,11,1. 粘多糖存在形式,在动物组织中，粘多

10、糖常以一定方式与蛋白质相结合。这些糖蛋白具有相当大的糖链，此糖链以含有重复性的双糖单位为特点，经常由糖醛酸和氨基乙糖组成。 在组织中，糖与蛋白质连接的方式有3种： 第一种是在木糖和丝氨酸羟基之间的一个O-糖苷键； 第二种是在N-乙酰氨基半乳糖和丝氨酸或苏氨酸羟基之间的一个O-糖苷键； 第三种是在N-乙酰氨葡萄糖和天门冬酰胺的酰胺基之间的一个N-氨基糖残基的键。 第一种联结类型存在于硫酸软骨素、硫酸皮肤素、肝素和硫酸乙酰肝素中；第二种类型存在于骨骼硫酸角质素中；第三种存在于角膜硫酸角质素中。,2022/12/20,12,2. 提取分离粘多糖总的原则,在提取粘多糖时，常用新鲜组织或经丙酮脱脂脱水的

11、组织为原料，采用水或盐溶液进行提取分离。 对于仅含一种粘多糖、而且又容易分离的组织，用水或盐溶液就可提取出产品。但对于同蛋白质相结合的粘多糖来讲，必须首先用酶降解蛋白质部分或用碱使蛋白质同多糖之间的键断裂开以促进粘多糖在提取时溶解在提取液中。 一般来讲用碱性液提取效果要好，其主要原因是可防止粘多糖的硫酸基因水解而被破坏，而且在碱性提取时又可用蛋白水解酶处理原料。水解下来的蛋白质可用普通的蛋白质沉淀剂如硫酸铝等使之沉淀，也可调pH值和加热促使蛋白质沉淀，这样大大简化了工艺。在生产中用三氯乙酸、酚或乙酸提取粘多糖，也可获得好的效果。,2022/12/20,13,在生产中常利用粘多糖在乙醇中的溶解度

12、的不同，分级分离粘多糖混合物。 有时也根据粘多糖阴离子电荷密度的不同，利用季按盐络合物的生成，通过离子交换层析和电泳进行分级分离。 糖醛酸和硫酸基都和粘多糖酸性的强弱有关，也与阴离子的电荷密度有关。对脑和皮组织，在提取前，应减少脂肪含量。通常在生产中将绞碎的组织在室温经数次丙酮提取除去脂肪。干燥后，再用常规分级分离的方法提取粘多糖。 下面分别介绍几种常见常用的提取、分离方法。,2022/12/20,14,（一） 非降解法 此法适用于含有一种粘多糖的动物组织，采用水或盐溶液提取，再分离、纯化，可得到满意的收率，如玻璃体、脐带、关节滑液等。 （二） 降解法 （1） 碱处理法 应用碱处理的方法，对组

13、织中粘多糖进行完全提取。如从软骨中分离提取硫酸软骨素时，在4，用稀碱液提取，过夜，乙酸中和并透析，所含蛋白质用白陶土或其他吸附剂除去，乙醇沉淀，得硫酸软骨素。缺点是一些糖苷键可能发生断裂，制备工艺不宜使用。 （2） 酶处理法 自然界的多糖除以游离状态存在外，多以与蛋白质结合的形式存在，可用专一性比较低的蛋白酶，进行大范围地分解消化蛋白质，然后提取分离组织中的多糖。,2022/12/20,15,常用的有木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶。优点是只降解蛋白部分，不会分解和破坏多糖，可取代碱提取法。 （三） 分级分离法 在分级分离粘多糖之前，需除去低相对分子质量消化产物和残存的蛋白质，先用三

14、氯乙酸沉淀，最终达50gL（5%），低温保存数小时或过夜，使其沉淀完全，离心除去沉淀，清液调至中性进行透析。 大规模生产时消化液体积很大，透析实际上不可能进行，可以使用根据分子大小分级阻留的膜进行超滤，代替透析或直接沉淀粘多糖。通常使用乙醇和季铵盐作沉淀剂。,2022/12/20,16,（1） 乙醇沉淀及其分级分离 用乙醇从溶液中沉淀多糖是一种简易的方法，也用于不同粘多糖的分级分离，粘多糖以1020gL（12%）为宜，最小至1g/L（0.1%），也可以得到完全沉淀。 较高浓度，沉淀趋向于呈糖浆状而难以操作，分级分离也难以完全。为了使其沉淀完全，需加适量的乙酸钠、乙酸钾或乙酸铵，最终小于50gL

15、（5%）足够，乙酸盐的优点是乙醇中溶解度高，使用过量乙醇不会夹杂盐沉淀。一般有足够的盐浓度，45倍体积的乙酸可以使任何结缔组织中的粘多糖完全沉淀。 乙醇分级分离是分离粘多糖混合物的经典方法，是某些粘多糖大规模分离的最适用工序，若有两价金属离子Ca2+、Ba2+和Zn2+存在时，乙醇分级分离最有效。,2022/12/20,17,Meyer等人推荐的工序曾在许多情况下使用并得到良好的效果，其方法：在搅拌下，缓慢将乙醇加入以 50g/L(5%)乙酸钙-0.5molL乙酸为溶剂的1020g/L(12%)粘多糖溶液中， 4过夜，离心收集沉淀，用同样方式以高浓度乙醇进行再沉淀，用80%乙醇洗涤，用无水乙醇

16、和乙醚洗涤，干燥。 如果需要将粘多糖转为钠盐，可通过钠型阳离子交换树脂，或溶于氯化钠液中再用乙醇沉淀。对于每次加入乙醇的体积分数的递增情况，取决于分级分离混合物的本性，如果增长的体积分数小于5%，其结果不会产生明显改进，一般采用大幅度提高浓度的办法。 乙醇分级分离方法的缺点是，对于很相似的多种成分，不能达到完全分级分离的目的。,2022/12/20,18,（2） 季铵化合物沉淀粘多糖及其分级分离 粘多糖的聚阴离子能与某些表面活性物质如十六烷基吡啶盐（CP）、十六烷基三甲基铵盐（CTA）的阳离子生成不溶于水的盐，但可溶解于某种浓度的无机盐溶液中（临界电解质浓度），利用这种性质可达到纯化的目的。

17、这是对于复杂粘多糖混合物最有用的分级分离方法之一，在某种情况下，用季铵化合物进行分级分离是对一混合物中各个组分达到完全纯化的唯一方法。 除此工序外，尚用在消化液和其他溶液中回收粘多糖的总体。由于生成的络合物溶解度低，就有可能从稀至 0.01%或更稀的溶液中沉淀粘多糖。,2022/12/20,19,（3） 离子交换层析 应用不同的离子交换剂如 D-254、Dowex IX2、DEAE-C、DEAE-Sephadex、Deacidite FF都取得了良好的分离纯化效果。通常以粘多糖的水溶液上柱，但其中明显存在一些不能被吸附的部分，这样使用低浓度的盐溶液，如 0.030.05molL氯化钠液最适当。

18、既可于上柱开始时使用，也可对未被吸附部分使用。 洗脱用逐步提高盐浓度或分步提高盐浓度的办法来进行。如，以Dowex I柱进行分离时，分别用0.5、1.25、1.5、2和3molLNaCl洗脱，可以分离透明质酸、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、肝素和硫酸角质素等；以 DEAE-Sephadex A-25柱进行层折时，分别用 0.5、1.25、1.5和 2mol/L氯化钠洗脱，可依次分离透明质酸、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和肝素等。,2022/12/20,20,五、 糖类化合物提取分离应用实例,1. 植酸钙镁 2. 肌醇 3. 猪苓多糖 4. 肝素 5. 肝素钙 6. 硫酸软骨素

19、7. 冠心舒 8. 甲壳质及脱乙酰壳多糖 9. 透明质酸,2022/12/20,21,（一）植酸钙镁,化学结构和性质1. 以玉米浸泡液为原料的提取法2. 以植酸钙为原料的提取法3. 以麸曲渣为原料的提取法,2022/12/20,22,植酸钙镁又称非汀，是一种良好的营养药，具有促进新陈代谢、增进食欲和营养、助发育等作用。适用于治疗神经系统各种疾病、血管张力减退、癔病、神经衰弱、佝偻病、软骨病、贫血和结核病等。 化学结构和性质 化学名称为肌醇六磷酸酯钙镁盐，呈白色粉末，无臭，溶于盐酸、硝酸和硫酸，不溶于水和碱。,2022/12/20,23,1. 以玉米浸泡液为原料的提取法 （1）工艺路线,（2）工

20、艺过程 取净化玉米投入浸泡罐内，用0.3%亚硫酸溶液在5253浸泡70h，放出浸泡液，搅拌下加入8oBe的石灰乳，中和至pH5.45.8，静置1h，除去上层清液，混浊液压滤，滤饼在6080干烘，得植酸钙镁。以玉米质量计，总收率0.2%0.3%。,问题1,2022/12/20,24,2. 以植酸钙为原料的提取法 （1）工艺路线,（2）工艺过程 按m（工业植酸钙）：V（浓盐酸）：V（NaOH）：m（活性炭）：V（水）1：1：0.625：0.04：8的配料比投料。取工业植酸钙溶于等量的浓盐酸中，加热使溶解，加入活性炭，加水稀释，过滤。滤液在搅拌下，加入120g/L（12%NaOH）溶液中和至pH5.

21、1，析出沉淀，静置，检查pH，过滤，收集滤饼用水洗至氯离子合格为止，甩干，搓成小条状，通风干燥，得植酸钙镁。以植酸钙质量计，总收率50%以上。,2022/12/20,25,3. 以麸曲渣为原料的提取法 （1）工艺路线,（2）工艺过程 取麸曲渣加入4倍量水和0.02倍量的工业硝酸（相对密度1.41.42），搅匀浸泡2h，每小时搅拌1次，放出植酸水溶液，麸曲渣再加3倍量水和 0.01倍量工业硝酸，浸泡 5h，每 lh搅拌 1次，放出植酸水溶液，合并，pH应为4。加入石灰乳调节pH7，静置分层，弃去上层清液，过滤，甩干，干燥，得植酸钙镁粗品。以麸曲渣计，总收率33.5%。,2022/12/20,26

22、,（二） 肌 醇,肌醇通常以游离形式存在于动物的肌肉、心、肝、肺等组织中，也可与磷酸结合形成磷酸肌醇。在低等植物中主要形式是磷酸肌醇，高等植物中则是肌醇六磷酸和肌醇六磷酸的钙镁盐。 肌醇对脂质类和糖类代谢有调节作用。临床用于治疗肝硬化、脂肪过多症和血管硬化症。 1. 化学结构和性质 肌醇又称肌糖，化学名称环己六醇，呈白色结晶性粉末，无臭，味甜，在空气中稳定，在强酸强碱中不易水解。水溶液对石蕊试纸呈中性，无旋光性。易溶于水，微溶于乙酸，不溶于乙醚和氯仿。熔点224227。 原料用植酸钙镁，经高压水解后得到肌醇。,2022/12/20,27,2. 制造工艺 （1）技术路线,2022/12/20,2

23、8,（2）工艺过程 按m（植酸钙镁）：V（水）1：3.2的配料比投料。取植酸钙镁置于高压釜内，加水搅拌，密闭，保持内压490.5kPa（5kg/cm2），温度在160以上，水解20h，得高压水解液，再加适量的石灰乳中和，不断搅拌，pH控制在78，过滤，滤液进行浓缩，冷却后结晶析出，过滤，收集肌醇粗品。再将粗品用3倍量的蒸馏水溶解，在 90加入粗品的50g/L（5%）活性炭脱色，过滤，冷却，干燥，即得肌醇精制品。以植酸钙镁的质量计，总收率5%。,2022/12/20,29,（三） 猪苓多糖,猪苓多糖，药理实验证明，能显著提高荷瘤小鼠腹腔巨噬活力，促进抗体形成，是良好的免疫调节剂，具有抗肿瘤转移和

24、调节机体细胞免疫功能的作用。临床用治疗原发性肺癌、鳞癌，有效率达80%。此外，发现对慢性肝炎有较好的疗效，双盲法用于389例慢性乙型肝炎患者进行治疗，E抗原阴转率达4060%，肝功能复常率达95.9%。疗效与干扰素相类似，可费用要比干扰素低得多，适宜推广使用。 1. 化学结构和性质 猪苓多糖是从真菌猪苓 Polyporus umbellatus（Pers）Fr中经水提取的，是以-（13）。（l4）、（16）键结合的葡聚糖。呈白色无晶形粉末，遇湿或露置空气中易氧化，由无色变棕黄色，易溶于水、20%热乙醇中，不溶于70%的乙醇。,2022/12/20,30,2. 生产工艺 （1）工艺路线,（2）工

25、艺过程 提取 将50kg猪苓去泥土制成碎块，加入5倍量蒸馏水热压115.5提取3次，每次时间分别为1.5h、1h、0.5h，合并3次滤液，除去不溶性杂质，得提取液。 浓缩、沉淀 上述提取液减压浓缩至5L，在搅拌下加入乙醇，使醇含量达80%，静置12h，过滤，收集沉淀，低温干燥。,2022/12/20,31,再将干燥物溶于3L蒸馏水中，加热煮沸后，趁热滤除不溶物，滤液在搅拌下加入乙醇达80%，静置24h，过滤，收集沉淀，用乙醇洗涤3次，低温干燥，得粗制品，收率0.65%左右。 去杂蛋白、脱色、沉淀 将粗品溶于3L蒸馏水中，准确量取30ml，在搅拌下滴加10g/L （1%）鞣酸（药用规格）溶液，边

26、加边升温，煮沸后离心弃去沉淀，至取上清液加入1滴鞣酸液不混浊止，换算出粗品液需加鞣酸液的量。先将粗品液加热煮沸，在搅拌下缓缓加入 10g/L（10%）鞣酸液，待反应完全后，继续煮沸15min，加入20g/L（2%）的活性炭搅拌10min，用布氏漏斗过滤，滤液加入乙醇达70%，静置24h后，过滤，沉淀用70%乙醇反复洗涤，至洗液无鞣酸为止，得沉淀物湿品。 吸附、洗脱、沉淀、干燥 将湿品溶于2L20%的热乙醇中，通过置于布氏漏斗中的2kg中性氧化铝层，微微减压，缓缓流出，继续加入60的热蒸馏水洗脱，,2022/12/20,32,收集流出液减压浓缩成2.5L，加入体积分数达到70%的乙醇，放置即析出

27、白色絮状沉淀，过滤，收集沉淀，低温或冷冻干燥，即得猪苓多糖纯品。 3. 注解 用纸层析和硅胶板层析可鉴别猪苓多糖。 纸层析的展开剂V（正丁醇）：V（无水乙醇）：V（水）3.5：3：3 硅胶板层析的展开剂V（正丁醇）：V（吡啶）：V（水）5：4：1.5 显色剂：氨制硝酸银液和水合茚三酮试剂 粗制猪苓多糖含有蛋白质类杂质，用10gL（10%）鞣酸沉淀除去，注意勿使鞣酸过 量带入纯品中，影响产品质量。 野生猪苓隐生地下，是不规则的瘤状物，零星分散，采集困难。但长猪苓的地面草少，可见露面，夏季雨后偶见长出蘑菇样小伞。,2022/12/20,33,（四）肝素,概述、化学结构、性质1. 酶解-树脂法2.

28、盐解-树脂法3. CTAB提取法4. 以牛肺为原料的提取法5. 以猪肺为原料的提取法 注解,2022/12/20,34,在自然界中，肝素广泛分布在哺乳动物的肝、肺、心、脾、肾、胸腺、肠粘膜、肌肉和血液里，多与蛋白质结合成复合体存在，这种复合物无抗凝血活性，随着蛋白质除去而活性增加。与变性蛋白质结合较为紧密。各种组织肝素的含量与肥大细胞的数目有关，肥大细胞内的颗粒含肝素或肝素前体，当物理或化学刺激使肥大细胞脱颗粒时，肝素被释出来，在体内被肝脏产生的肝素酶灭活而从尿排泄出去。 肝素是天然抗凝药，10mg肝素在4h内能抑制500ml血浆凝固。抗凝机制是抗凝血酶起作用，在血液-球蛋白（肝素辅因子）共同

29、参与下，抑制凝血酶原转变成凝血酶。静脉注射10min见效，作用维持2-4h，效果较为恒定，对已形成的血栓无效。此外，还具有澄清血浆脂质、降低血胆固醇和增强抗癌药物疗效等作用。临床广泛用作各种外科手术前后防治血栓形成和栓塞，输血时预防。,2022/12/20,35,血液凝固和保存鲜血时的抗凝剂。小剂量时用于防治高血脂症和动脉粥样硬化。国外用于预防血栓疾病，已形成了一种肝素疗法。 化学结构和性质 肝素是一种含有硫酸酯的粘多糖，属于不均一的多糖分子。它的组分是氨基葡萄糖和两种糖醛酸，其中以艾杜糖醛酸为主，其次是葡萄糖醛酸。分子结构用一个四糖重复单位表示如下：,2022/12/20,36,在4个糖单位

30、中，有2个氨基葡萄糖含4个硫酸基，氨基葡萄糖若是-型的，糖醛酸糖苷是-型的。肝素的含硫量在912.9%之间，硫酸基在氨基葡萄糖的2位氨基和6位羟基上，分别成磺酰胺和酯。艾杜糖醛酸的2位羟基成硫酸酯，带有负电荷。分子呈螺旋形纤维状。 性质：肝素为白色或灰白色粉末，无臭无味，有吸湿性，钠盐易溶于水，不溶乙醇、丙酮、二氧六环等有机溶剂。分子结构“单元”中含有5个硫酸基和2个羧基，呈强酸性，为聚阴离子，能与阳离子反应生成盐。游离酸在乙醚中有一定溶解性。比旋度D20数据为游离酸（牛、猪） 5356o，中性钠盐（牛）42o，酸性钡盐（牛）45o。在紫外185220nm波长处有特征吸收峰，在230300nm

31、无光吸收。如不纯有杂蛋白存在时，则最大吸收在265292nm，最小吸收在240260nm。在红外890、940cm1有特征吸收峰，测定12101150cm1吸收强度，可用于快速测定。,2022/12/20,37,肝素的糖苷键不易被酸水解，O-硫酸基对酸水解相当稳定，N-硫酸基对酸水解敏感，在温热的稀酸中会失活，温度越高，pH越低，失活越快。 在碱性条件下，N-硫酸基相当稳定。与氧化剂反应，可能被降解成酸性产物，使用氧化剂精制肝素时，一般收率能达到80%左右。还原剂存在时，基本上不影响肝素的活性。N-硫酸基遭到破坏，则抗凝活性降低。分子中的游离羟基被酯化，如硫酸化，抗凝血活性下降，乙酰化不影响抗

32、凝血活性。 肝素失活产物能被过量乙酸和乙醇沉淀。失活过程中，其分子组分损失和相对分子质量变化不大，但形状变化很大，使原来螺旋形的纤维状分子结构发生改变，分子变为短而粗。 有人用肝素酶把肝素降解成双糖单位，分析结果表明，抑制凝血酶活性高的肝素片段，含有较多的三硫酸双糖单位和二硫酸双糖单位，而一硫酸双糖单位较少。,2022/12/20,38,1. 酶解-树脂法 （1）工艺路线,2022/12/20,39,（2）工艺过程 酶解 取100kg新鲜肠粘膜（总固体57%）加苯酚200ml（0.2%），如气温低时可不加。在搅拌下加入绞碎胰0.51kg（0.51%），用300400g/L（3040%）氢氧化钠

33、液调节pH8.59，升温至4045，保温 23h。pH8，再加5kg粗食盐（5%）升温至90左右，用 6mol/L盐酸调节pH6.5左右，停止搅拌，保温20min，以布袋过滤，得酶解滤液。 吸附、洗涤、洗脱 取滤液冷至50以下，用 6mol/L氢氧化钠调节pH7，加入5kg D-254强碱性阴离子交换树脂，搅拌5h左右，交换完毕，弃去液体，用自来水漂洗树脂至水清，用与树脂等体积的2mol/L氯化钠，搅拌洗涤 15min，弃去洗涤液，再加 2倍树脂体积的1.2mol/L氯化钠洗涤2次。用约树脂体积一半的5mol/L氯化钠洗脱1h，收集洗脱液，然后用约为树脂体积的1/3的3mol/L氯化钠洗脱2次

34、，合并洗脱液。,2022/12/20,40, 沉淀、脱水、干燥 将洗脱液用滤纸浆助滤，过滤1次，澄清滤液以体积计加入用活性炭处理过的0.9倍的95%乙醇，冷处沉淀 812h。虹吸上清液弃去，按100kg粘膜加300ml的比例向沉淀中补加蒸馏水，再加入 4倍量95%乙醇，冷处放置6h，收集沉淀，用无水乙醇脱水1次，丙酮脱水2次，置五氧化二磷干燥器中真空干燥，得肝素钠粗制品。 脱色、沉淀、干燥 用20g/L（2%）氯化钠液配成100g/L（10%）的肝素钠溶液，以40g/L（4%）高锰酸钾液进行氧化脱色，每亿单位估计加入0.65mol高锰酸钾。先将药液调至pH8，预热80，在搅拌下加入高锰酸钾液，

35、保温2.5h，以滑石粉作助滤剂，过滤，收集滤液。将滤液调节pH至6.4，用0.9倍的95%乙醇置于冷处沉淀6h以上，收集沉淀，溶于10g/L（1%）氯化钠液中，用量按肝素钠粗品质量收率6070%计，配成50g/L（5%）肝素钠溶液，再用4倍量的95%乙醇，冷处放置6h以上，收集沉淀物，用无水乙醇、丙酮脱水，乙醚洗涤1次，置五氧化二磷干燥器中干燥，得肝素钠精品。肠粘膜换算成总固体7%计，收率20000Ukg，最高效价141.6Umg。,2022/12/20,41,2. 盐解-树脂法 （1）工艺路线,2022/12/20,42,（2）工艺过程 提取 取新鲜猪肠粘膜投入反应锅内，按30g/L（3%）

36、加入氯化钠，氢氧化钠液调节 pH9，逐步升温至5055，保温2h，继续升温至95，维持10min，冷却50以下用30目双层纱布过滤，收集滤液。 吸附、洗涤、洗脱、沉淀 取冷却50以下的滤液，加入714型（强碱性）Cl型树脂（新树脂用量为2%），搅拌8h后静置过夜。 次日虹吸除去上层液，收集树脂，用水冲洗至洗液澄清，滤干，用2倍量1.4mol/L氯化钠搅拌2h，滤干，再用1倍量1.4mol/L氯化钠搅拌2h，滤干，继用2倍树脂量的3mol/L氯化钠搅拌洗脱8h，滤干，再用1倍量3mol/L氯化钠搅拌洗脱2h，滤干，合并滤液，加入等量95%乙醇沉淀，过夜，虹吸除去上清液，收集沉淀，丙酮脱水干燥，得

37、粗品。,2022/12/20,43, 溶解、脱色、沉淀、干燥 粗品溶于15倍 10g/L（1%）氯化钠中，加6mol/L盐酸调pH1.5左右，过滤至清，随即用5mol/L氢氧化钠调pH11，按3%加入过氧化氢（浓度为30%）25放置，开始不断调整 pH至11，第2天再按1%加入过氧化氢，调整 pH11，继续放置，共48h。 过滤，用 6mol/L盐酸调pH6.5，加入等量的95%乙醇沉淀，过夜，次日虹吸除去上层清液，沉淀用丙酮洗涤脱水，干燥，即得肝素钠精品。 总收率20000Ukg肠粘膜（按肠粘膜的固体量为57%计算）。,2022/12/20,44,3. CTAB提取法 （CTAB为十六烷基三

38、甲基溴化胺为长链季铵盐） （1）工艺路线,2022/12/20,45,（2）工艺过程 提取、络合 按V（猪肠粘膜液）：V（硫酸钠）：V（硫酸铝）：V（CTAB）1：0.15：0.04：0.001的配料比投料。取新鲜猪小肠粘液投入反应罐内，搅拌下加入硫酸钠，溶解后，用碱液调节pH1111.5，升温至50，保温搅拌2h，再加硫酸铝，溶解后，用氢氧化钠调节pH7.58，搅拌吸附1h，静置过夜，滤饼用40热蒸馏水洗至无色，抽干，得络合物。 解离、沉淀 取络合物用适量氯化钠溶液溶解，以冰醋酸调节pH4，升温60，保温30min，静置过夜，次日吸取上层清液，离心，收集清液，加入95%乙醇沉淀，放置过夜，沉

39、淀用丙酮洗涤，干燥，即得粗品 。,2022/12/20,46, 脱色、沉淀、去钾离子、干燥 将粗品用25倍新鲜配制的氯化钠溶液溶解，用氢氧化钠液调节pH至8，升温80后，加入适量的高锰酸钾溶液脱色，至颜色不退为止。过滤，滤液冷却后，加0.9倍95%乙醇沉淀，静置过夜，离心，沉淀加蒸馏水溶解，加强酸性苯乙烯系阳离子树脂 0018，搅拌30min，过滤，滤液加10g/L（1%）的氯化钠，调节pH至10.511，按体积再加1%过氧化氢液，保持25，静置 2天。过滤，滤液加等量的 95%乙醇沉淀，静置24h，沉淀用乙醇、丙酮洗涤，真空干燥或冰冻干燥得肝素成品。 按肠粘液计，收率1100015000Uk

40、g。,2022/12/20,47,4. 以牛肺为原料的提取法 （l）工艺路线,（2）工艺过程 原料处理 取冰冻牛肺融化后，剪去主气管和较大气管，然后剪成长条，置绞碎机中用3mm绞板绞磨成肉糜状，所得净肺糜量为毛肺的7080%。,问题2,2022/12/20,48, 自溶、提取、沉淀 自溶：取牛肺糜300kg，加水150kg，搅拌均匀，加温45，加入甲苯6L，在3941保温自溶20h，每半小时搅拌1次。 提取：再取27kg硫酸铵溶于90kg水中，加入自溶液里，用400g/L（40%）氢氧化钠液调节pH8.89.2，水浴加温至50，保温搅拌1h，继续加热，在3h内升温至90，保温20min，冷却至

41、50以下，布袋过滤，滤渣压滤，滤饼加100kg水和硫酸铵6kg再提取1次，弃去滤渣，合并2次提取液，约得提取液1.51.6kgkg净肺重。 沉淀：将提取液用20%硫酸调节pH至2.5，放置过夜，沉淀肝素蛋白络合物，虹吸弃去清液，绸布过滤，沉淀用5倍量乙醇搅拌浸泡1h，过滤，滤渣再用5倍量乙醇搅拌洗涤2次，除去脂肪，滤干，得粗制湿品，收率1.21.4%。,2022/12/20,49, 解离 将粗品加入 5倍量水和少量 400g/L（40%）氢氧化钠， pH达 910，球磨半小时，使之成浆糊状，续加水至粗品量的20倍，滴加 40%氢氧化钠至全溶，最终 pH为10。加入氯化钠达100g/L（10%）

42、，用20%硫酸调节pH至2.5，静置过夜，吸取上层清液，过滤，沉淀用2倍量的pH2.5、10%氯化钠液洗涤1次，合并上层清液和洗涤液，得黄色透明肝素液。 提纯、干燥 上述肝素液中加入等量水，用2mol/L氢氧化钠调节 pH至7。按总体积计算称取溴化十五烷吡啶（PPB）25g，加水溶解成5%溶液，置分液漏斗中，用乙醚振摇34次，直至醚层完全无色为止，分出水层。在搅拌下将红色清液滴加于肝素溶液中，静置冰箱中过夜，收集沉淀，用蒸馏水洗涤23次，至洗液对1mol/L硫氰化钾液无反应为止。,2022/12/20,50,沉淀用2mol/L氯化钠液溶解，0.1mol/L氢氧化钠调节pH至7，2500rmin

43、离心10min，去油状物，离心液布氏漏斗滤清，清液加入0.8倍量的丙酮，置冰箱中过夜，离心，收集沉淀，丙酮洗涤23次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥，得灰白色粉末肝素精制品。 按净肺质量计，收率 0.11g/kg，效价90100Umg。 脱色、除热原、干燥 将精品溶于15倍量的蒸馏水中，滴加1mol/L氢氧化钠至pH8.59，滤去不溶物。按溶液体积以2%、0.5%、0.5%和1%分 4次加入30%过氧化氢，保持pH8.59，20h脱色完毕，过滤除去氧化物，得肝素脱色液。,2022/12/20,51,再滴加5mol/L氢氧化钠调节pH达1213，室温放置24h，按无热原操作法过滤，清液用5mol/

44、L盐酸调节pH至7左右，再按溶液体积加入10g/L（1%）经250烘干1h的无热原氯化钠，搅拌下加入0.8倍的丙酮，置冰箱45h，离心，收集沉淀。 用50%丙酮洗涤2次，无水丙酮洗涤2次，乙醚洗涤1次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥，即得白色粉末状的肝素成品。按净肺质量计，收率9000Ukg，效价130140Umg。,2022/12/20,52,5. 以猪肺为原料的提取法 取猪肺45kg绞碎，加入908.4kg水，搅匀加热到65， 30min，冷却至37，加22.7kg的胰浆，在pH7.5，3740水解48h，用2mol/L盐酸调节pH55.5，加热到90，30min，离心除去杂质，冷却至37时

45、用2mol/L氢氧化钠液调节 pH10，离心去杂质。离心清液在搅拌下加入 50g/L（5%）十六烷基氯化吡啶（CPC）溶液，以每1kg猪肺加入4ml 5%CPC液，沉淀肝素，37静置 2h，离心收集肝素CPC沉淀，沉淀装柱，分别用0.03、0.30.5、11.4、1.92.3mol/L氯化钠洗脱，收集1.92.3mol/L氯化钠液洗脱的流出液，用3倍量的甲醇沉淀，收集沉淀以无水乙醇洗涤2次，乙醚洗涤2次，在氯化钙干燥器中干燥，得粗制品。再将粗制品重新溶解，在65时，加入适量的10%乙酸钡溶液，使其生成肝素钡盐结晶，再转型为肝素钠盐，用3倍甲醇沉淀，无水乙醇洗涤2次，乙醚洗涤2次，置于25氯化钙

46、干燥器中干燥，即得肝素钠成品，效价8085Umg。,2022/12/20,53,7. 注解 国内外肝素生产工艺大致有盐解-季铵盐沉淀法、盐解-离子交换法、酶解-离子交换法三种。 D-254离子交换法为酶解-离子交换法，D-254为聚苯乙烯二乙烯苯三甲胺季铵型强碱性阴离子交换树脂的简称，此树脂机械强度和耐磨性能差，易破碎，细碎粒易漂浮而流失。解决办法采用负压吸气气泡翻滚搅拌法代替机械搅拌法，利用减压和虹吸将液体吸入或排出反应罐，使树脂始终在罐内，减少破碎和流失，提高收率。 肝素是聚阴离子（He），肝素蛋白质用HePr表示，为可溶性。酸性蛋白质，pI以6计，如果pH选择8.59，Pr浓度比Pr浓度

47、大很多，Pr浓度小到可忽略不计，则酸性蛋白与肝素的复合物完全可离解；若碱性蛋白质，pI为10，选择pH8.59不能促进蛋白与肝素复合物的离解，必须选择pH11.512，才能完全离解。,2022/12/20,54, 强碱性阴离子交换树脂，pH7.5以上，利于肝素的吸附和交换，其反应为： HeRCl（树脂）RHeCl 碱性越强，越有利于 RHe的生成，即肝素的吸附； RCl浓度越大，越有利于生成RHe。对同一质量的树脂，粒度越小或数目越大越好。因He的相对分子质量很大，RCl的交联度应低，使与He一反应的RCl有效量高。HePr浓度大时，离解后He浓度也大，则对生成RHe有利，故碱盐水宜少量多次提

48、取为佳。带有负电的Pr也与树脂反应，Pr的浓度低有利于RHe的生成，故用热变性或凝结剂先除蛋白，降低 Pr浓度，提高吸附树脂的效率。 Cl浓度低有利于 RHe的生成，故氯化钠的量，限制在最佳提取的最低用量，一般氯化钠质量浓度为30g/L（3%）。pH值越大，越有利于He Pr的离解，He浓度大些，有利于RHe的生成。,2022/12/20,55, 洗脱肝素要控制盐的阳离子，其反应： RHe NaClRClHeNa 氯化钠的浓度越大，RCl的浓度越小，有利于HeNa的生成，宜用动态洗脱。因RHe结合较牢，交换需要相当高的盐浓度，氯化钠常用 2mol/L、3mol/L，能使He近100%地洗脱下来

49、。 氧化作用能除去热原、脱色，配合调pH和加热，除去杂质，提高肝素的效价。 若应用高锰酸钾，有机杂质少时，氧化时间短，有机杂质多，则时间长。采用滤纸分层法检查氧化完全程度。由于高锰酸钾氧化作用较强，能破坏肝素和增加 K的含量，故改用加入总量 4%的过氧化氢，分两次加，好于单用高锰酸钾，不增加水溶液的新成分。,2022/12/20,56,（五）肝素钙,肝素钠具有很强的抗凝作用，由于肝素对Ca2+的亲和力比对Na+的亲和力强，在使用肝素钠时，往往会在各个不同的组织，特别是在血管和毛细血管壁等部位引起钙的沉积，尤其是大剂量皮下注射，钙的螫合作用破坏邻近毛细血管的渗透力，因而产生瘀点和血肿现象。 肝素

50、钙可避免由钠盐转变为钙盐过程，可能引起的血中电解质平衡紊乱，具有稳定、速效、安全、减少瘀点和血肿硬结等优点。 国外采用肝素钙代替肝素钠，日本、西欧、美国、意大利等国家均生产并广泛将其用于临床。,2022/12/20,57,1. 化学组成和性质 肝素钙是由肝素钠转变而成的。呈无定形粉末，溶于水为黄褐色，不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂。10g/L（1%）的水溶液 pH为 67.5。 制备上，目前均采用将精品肝素钠转变为精品肝素钙的方法，一种是离子交换法，把肝素钠吸附在阳离子交换剂上，洗去残留的Na+，用氯化钙洗脱肝素，乙醇沉淀，收取肝素钙。其缺点是交换容量低，洗脱时体积大，后处理麻烦。 另一种是离子平