生化校准方法分析资料课件.ppt

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1、临床生化定标方法分析,龙岗区中医院姜敬学,K因子法,理论k值：根据摩尔系数（）来计算。通常试剂生产降价给出的k值都属于此。实测k值：是根据仪器当前的实际状态，试剂的稳定性等因子数测得的值。校准k值：通过高质量校准直接校准得到的k值K因数法适用的分析方法有一点终点法，两点终点法，两点速率法，多点速率法。,K=SV/TV & .1*106,线性两点法非线性法：又称非直线性校准法 非线性法包括logit-log法、指数函数法、样条函数法等方法Logit-log3p对数函数法中的一种，适用于浓度升高而吸光度表现为收束的工作曲线。P表示参数之意，由3个参数（S1Abs、k、a）参与计算。S1Abs表示试

2、剂空白，K表示校准所得斜率，a表示近似常数。、logit-log4p对数函数法中的一种，适用于浓度升高而吸光度表现为收束的工作曲线。P表示参数之意，由4个参数（S1Abs、k、a、b）参与计算。S1Abs表示试剂空白，K表示校准所得斜率，a表示近似常数。logit-log5p对数函数法中的一种，适用于浓度升高而吸光度表现为收束较明显的工作曲线。P表示参数之意，由5个参数（S1Abs、k、a、b、c）参与计算。S1Abs表示试剂空白，K表示校准所得斜率，a表示近似常数。而使结果更加精确。指数函数法（exponential）是适用于随标准物质浓度增加，而测定的吸光度值呈现分散状态的趋势。 5个参数

3、（S1Abs、k、a、b、c） 样条函数法（spline）：是将每一标准液测定的标准液测定的吸光度连接起来（点对点），形成一个完整曲线，即为曲线拟合。该曲线拟合优于折线法校准。由4个近似常数a（l），b（l）c（l），d（l）参与计算。折线法（line Graph）：是将标准液1-6的吸光度值多用条直线连接起来的工作曲线。 s1Abs、k1; s2Abs、k2; s2Abs、k2; s3Abs、k3; s4Abs、k4; s5Abs、k5;参与计算。,Logit-log3p适用于一点终点法、两点速率法和两点终点法等分析方法。logit-log4p适用于一点终点法、两点速率法、两点终点法、三点双

4、项目分析法、速率法A、速率法B等分析方法。Logit-log5p适用于一点终点法、两点速率法、两点终点法、速率A等分析方法。,样条函数法是为N个标准品，（N）有多个标准液（N1）之间的范围适应于前后的测定值并使之接近，总体成为一条标准曲线，需用样条函数拟合的校准方法。样条函数法适用于多点定标。,通常，生化分析仪器都设置有样品最小用量和最小体积，如日立7170反应体积为180-380ul，最大体积为570ul，最小吸样量2ul，在不影响结果的准确度，精密度的前提下，可适当调整样品和试剂的用量。样品与试剂的比例（SV/RV），也可表示为样品分数样品体积与反应液总体积。SV/TV是方法学基本参数，在

5、其他参数不变时，直接影响结果的计算。一般情况下以试剂说明为准，不宜轻易改动。,如总胆固醇与甘油三脂的测定，血清样品与试剂的最佳比列为1:100，样本的最低用量不能小于3ul。,测定方法的选择：自动生化仪一般都可选择一点终点法，两点速率法，速率A法等。对于，一种新的实验方法，通常选择高中低尝试样本与标准品观察其它反应进程曲线。若均在5min之内呈直线，可采用速率A测定。如反应进程曲线不呈直线而且需5-10min，甚至更长的时间才能达到终点，可采用两点速率法测定，如反应曲线在2-3min，甚至更短的时间即达到终点，则采用终点法为宜。,同一项目可用不同的方法测定如血清肌酐测定通常的就有氧化酶和苦味酸

6、，两点速率法和酶法的。当前情况下大多以使用，JAFFF法苦味酸法的，由于价格便宜，但苦味酸污染管道及比色杯。酶法测定肌酐价格虽然贵但其测定结果准确，试剂抗干扰力强。标本用量少，污染少，有逐渐被酶法试剂盒取代的趋势。,同一个项目相同的试剂也可用不同的方法进行测定，在血清葡萄糖测定方法中，己糖激酶HK法的特异性高，分析方法中有一点终点法，两点终点法，速率A法，有研究表明，三种分析方法中只有两点终点法能扣除其光谱干扰（溶血、脂浊、黄疸）的影响，到反应终点的第二点间仍能保持相对的与校准曲线基本一致的曲线，其吸光度差值乃能保持原比例，因而检测结果较正确。误差较小，能较好地克服（溶血、脂浊、黄疸）取得较准

7、确的结果。,波长的选择应根据吸收光谱曲线，选择特定反应产物对吸光度吸收的最高峰值时的。波长为测定波长及双单波长测定的主波长。副波长的选择原则是干扰因数在主波长与副波长有相同的吸光度或是越接近越好，但不影响测定的灵敏度及副波长的正确选择有利于提高测定的灵敏度和减少测定误差，单波长测定易受到样品溶血，黄疸，脂血等因素的干扰，双波长测定可以通过副波长加以修正，减少甚至消除干扰因素，提高测定的准确度。,双波长的选择常见：血红蛋白在340nm和380nm波长吸光度相同，以NADH和NADPH作为测定底物或产物的试验常用340nm、380nm 340、405ALP和GGT常用405nm、476nmTRIN

8、DER反应多选取520nm、600nm或550nm、660nm免疫比浊常用340nm、700nm等。,分析时间的选择分析时间主要包括反应时间，监测时间（读点）和读数间隔时间，延迟时间，根据反应类型，仪器和试剂的状况，就遵循有利于抗干扰，有足够灵敏度以及准确度的原则适当调配延迟时间和读数时间的长短。,定血清葡萄糖、胆固醇的试剂盒由于增加了可加快反应速率的工具酶的量3-4min反应完全，设置5min已足够。目前多数自动生化分析仪设置有多个反应时间可选（如日立7170,5min，10min，15min），须预先选定，多数仪器设定在10min左右,监测时间是指该时间内的测定读数要用于结果计算。它的设置与加样点、加试剂点、监测时间（读数点）、读数间隔时间及试剂样品比例有关，要结合方法学，兼顾权衡。读数时间最理想的应选择在反应线性期，终点法反应达到终点。反应监测时间还要考虑延迟时间的长短、测定物质的浓度范围，若监测时间多长则容易发生底物耗尽，使得测定结果偏低。,谢谢,