《生化大实验》课件.ppt
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1、生化大实验,实验课程简介,生化大实验是一门综合性的实验课程,教学的目的在于通过对生命物质的分离制备,纯化,分析等综合性实验,在已掌握的基础生物化学理论知识和生化实验常用方法的基本原理、基本操作技术(如滴定、比色、层析、电泳等)的基础上,训练学生的综合实践动手能力,掌握蛋白质、酶、核酸等重要物质的分离、纯化等的测定技术。,目 录,实验一 蛋白质含量的测定实验二 离子交换法血清纯化实验三 离子交换层析法分离血清白蛋白实验四 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量实验五 等电聚焦法测定样品的等电点实验六 质粒的分离与纯化实验七 扩增目的基因片段实验八 酶联免疫吸附实验,实验一 蛋白质含量的测定,(一)考马斯亮
2、蓝法,【实验目的】 学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理和方法。【实验原理】 考马斯亮蓝测定蛋白质含量是利用蛋白质染料结合法的原理,定量测定微量蛋白质浓度快速、灵敏的方法。,考马斯亮蓝存在着两种不同样色形式,红色棕黑色和蓝色。染料与蛋白质结合后有红色棕黑色和蓝色形式,最大光吸收由变成,测定 吸光的增加量,可以测定与其结合的蛋白质的量。 蛋白质与染料结合速度很快,就可以反应完全,并可以稳定,蛋白质染料复合物有很大的消光系数,使得测定蛋白质浓度是灵敏度很高。测定范围为蛋白质,微量测定时达到蛋白质。此反应反复性好精度高,线性关系好。,【实验仪器及用品】,. 标准蛋白液()结晶牛血清白蛋白用 稀释到。
3、 . . 考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝溶于 乙醇中,加磷酸,蒸馏水稀释,滤纸过滤。 . 待测蛋白:人血清,用前用稀释倍。 . 漩涡混合器,. 移液管(),(), (). 分光光度计. 试管 (). 量筒(). 电子分析天平. 试管架(),【实验内容及步骤】,一、标准曲线线的绘制 取支干净试管,按下表进行编号并加入试剂。 以为纵坐标,标准蛋白质年浓度为横坐标,绘制标准曲线。,. 未知样液的测定 另取一干净试管,加入样品及考马斯亮蓝染液,混匀,室温静置,于波长处比色,读取吸光度。在标准曲线上查找蛋白质浓度。【注意事项】 、如果测定的要求很严格,可以在试剂加入内测定吸光度,在这段时间内样色很稳定。 、
4、测定中,蛋白质染料复合物会吸附在比色皿上,实验证明可以忽视。测定完后可以用乙醇洗干净。,【思考题】,、根据一下要求选择一种或者几种蛋白质定量测定蛋白质浓度。 ()样品不容易溶解,但要求结果很准确。 ()要求在半天内测定个样品。 ()要求很迅速的测定一系列试管(只)中溶液的蛋白质浓度。 、试着比较该法与其他几种方法的优缺点。,二、紫外分光光度法测定蛋白质含量,【实验目的】 . 学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。 . 掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术和使用方法。【实验原理】 蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,所以蛋白质溶液在具有一个吸收紫外吸收高峰。在一定浓度范围内,蛋
5、白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比,因此可作蛋白质定量分析。,利用紫外分光光度法测定蛋白质浓度的优点是迅速,简便,不消耗样品,低浓度盐类不干扰测定,因此广泛应用与蛋白质和酶的生化制备。此法的缺点是:对酪氨酸和苯丙氨酸含量差异大的蛋白质测定有一定误差。若样品种含有嘌呤嘧啶等会出现比较大的干扰,此时必须同时测定和吸光度,通过公式校正测定,以消除核酸的影响,而推算处蛋白质浓度。 不同蛋白质和核酸吸收是不同的,即使校正也存在误差,但是可以做为初步测定。该法测定蛋白质的浓度范围为。,【仪器与试剂】 . 紫外分光光度计,比色管(的个),吸量管。 . 标准蛋白质溶液:溶液溶解结晶牛血清白蛋白,稀
6、释到。 . 待测蛋白溶液:用酪蛋白配制,浓度在 . 溶液 . 试管() . 移液管(),(),()。,【实验步骤】 、标准曲线法 ()标准曲线的制作:取只试管按表加入试剂,摇匀。选择光程 石英比色皿,在波长测定,以值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标,绘制标准曲线。,表 紫外分光光度法测定蛋白质浓度标准曲线的绘制,()样品测定: 配制待测蛋白质溶液,加入蒸馏水,摇匀,测定,从标准曲线中查出蛋白质浓度。 . 直接测定法 在紫外分光光度计上,将待测蛋白质溶液加入比色皿,以生理盐水为对照,测定和波长吸光度。按一下公式计算蛋白质浓度: 蛋白质浓度() (为蛋白质浓度,和分别为蛋白质溶液在和处测得的吸光度值)
7、。,本法适用于微量蛋白质浓度测定,对盐类混杂的情况比较合适,为简便起见,对混合蛋白质溶液,可用来表示蛋白质大概浓度。【注意事项】 由于各种蛋白质的酪氨酸和苯丙氨酸含量不同,显色深浅随不同蛋白质改变,因而本法只适用于蛋白质相对浓度的测定,核酸对结果也有影响,尽管进行了公式校正,但是不同样品干扰成分差异较大,致使紫外吸收法检测的准确性较差。【思考题】 .紫外分光光度法测定蛋白质浓度的原理是什么? . 影响紫外分光光度法测定准确性的因素有那些?,三、酚法测定蛋白质浓度,【实验目的】 熟悉酚法测定蛋白质浓度的方法。【实验原理】 酚法又称法。首先在碱性溶液中形成铜蛋白质复合物,后与磷钼酸磷钨酸作用,产生
8、深蓝色的钼蓝和钨蓝复合物,这中复合物在和处有最大吸收峰,颜色与蛋白质浓度成正比,进而可以计算蛋白质浓度。,【材料、试剂、与器具】,. 酚(碱性铜试剂):碳酸氢钠和氢氧化钠双蒸水定容为储备液;五水硫酸铜 ,定容,为储备液。 将储备液和储备液混合为溶液,混合后一日有效。 . 酚:钨酸钠、钼酸钠、 蒸馏水、磷酸、浓硫酸在磨口圆底小瓶中混匀后接上磨口冷凝管,回流再加入硫酸锂、蒸馏水及液溴数滴,开口煮沸,冷却,稀释至过滤,至微绿,储存于棕色瓶。临用前氢氧化钠滴定,用酚酞做指示剂,据滴定结果,将试剂稀释至的酸,冰箱保存。,、标准浓度牛血清蛋白溶液 、分光光度计、刻度吸管(),(),()、试管只、恒温水浴【
9、操作步骤】、标准曲线的绘制,取只试管,按下表加入试剂:,加入试剂后,混匀,室温,在加酚 ,混匀后,再第二次加,混匀放置。于比色,做标准曲线。 、样品测定 取样品按上表加试剂,处比色,对照标准曲线求出蛋白质浓度。【思考题】 、酚法测定蛋白质浓度的原理是什么? 、影响酚法测定蛋白质浓度的准确性的因素有那些?,四、双缩脲法,【实验目的】 了解双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和方法。 【原理】 蛋白质含有两个以上的肽键,因此有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与 形成紫红色络合物,在波长处有最大吸收。在一定浓度范围内,其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比,可以用比色法定量测定 双缩脲法通常用于需要快速但不十分精确
10、的测定。,【试 剂 和 器 材】 . 牛血清白蛋白溶液 . 容量瓶() . 试管() . 双缩脲试剂:溶解硫酸铜( )溶于水中,在容量瓶中加入 浓氨水、冷蒸馏水和饱和氢氧化钠,摇匀,室温定容,摇匀备用。在搅拌下加入氢氧化钠溶液,用水稀释到,贮存在内壁涂以石腊的瓶中。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现,则需要重新配制。,. 吸量管(,) . 型分光光度计【操作步骤】 . 绘制标准曲线 取只试管编号,按下表加入试剂,即得种不同浓度的蛋白质溶液。 另取试管只,按、编号,号分别加上述蛋白质溶液号为对照,加 蒸馏水分别加入,各试管中加双缩脲试剂 混匀,紫色出现后,与测定吸光度,闭塞测定法务必在内
11、完成,绘制蛋白质浓度吸光度曲线。,. 未知样品蛋白质浓度的测定 取样品于试管中,加双缩脲试剂混匀,于处测定其吸光度,对照标准曲线,求出蛋白质浓度。【思考题】 . 本法与其他测定蛋白质浓度的方法比较,有那些优点? . 若样品中有干扰测定的杂质,应该如何校正实验结果?,实验二 离子交换法血清纯化,【实验原理】 (二乙氨基 乙基 葡萄糖凝胶 )为弱碱性阴离子交换剂。用 将 型转变为 型后,可吸附酸性蛋白。血清中的 球蛋白属于中性蛋白(等电点为 ),其余均属酸性蛋白。 的环境中。酸性蛋白均被 吸附,只有 球蛋白便可在洗脱液中先流出,而其他蛋白则被吸附在柱上,从而便可分离获得纯化的 。,【试剂与器材】,
12、. . 和 . . () . . . 无水乙醇 . 紫外分光光度计 . 玻璃层析柱 . 自动部分收集器,【操作步骤】, 预处理 称 (下称 ) ,悬于 蒸馏水内, 后倾去上层细粒。按每克 加 的比例,将浸泡于 液中,搅匀,静置 ,装入布氏漏斗(垫有 层滤纸)中抽滤,并反复用蒸馏水抽洗至 呈中性;再以 同上操作过程处理,最后以 再处理一次,处理完后,将 浸泡于 中过夜。,装柱,( )将层析柱垂直固定于滴定架上,柱底垫一圆形尼龙纱,出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。 ( )将 () 沿玻璃棒倒入柱中至 高度,再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的 。待 凝胶沉降 高时,开启出水口螺旋夹,控制流速
13、 ,同时连续倒入糊状 凝胶至所需高度。 ( )关闭出水口,待 凝胶完全沉降后,柱面放一圆形滤纸片,以橡皮塞塞紧柱上口,通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。,平衡 启开出水口螺旋夹,控制流速 滴 ,使约 倍床体积的洗脱液流出。并以 计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之 值与离子强度,两者达到一致时关闭出水口,停止平衡。 加样及洗脱 启开上口橡皮塞及下口螺旋夹,使柱中液体缓慢滴出,当柱面液体与柱面相切时,立即关闭出水口,以毛细滴管沿柱壁加入样品( 血清,体积应小于床体积的 ,蛋白浓度以 为宜)。松开出水口螺旋夹使面样品缓慢进入柱内,至与柱面相切时,立即关闭下口,以少量洗脱液洗
14、柱壁 次;再放开出水口,使洗液进入床柱,随后立即于柱面上加入数毫升洗脱液,紧塞柱上口,使整个洗脱过程成一密闭系统。并控制流速, 滴 .,收集 开始洗脱的同时就以试管进行收集;每管收集 . 共收集 管。 测蛋白 以 型紫外分光光度计分别测定每管 ,按公式计算各管蛋白含量。并以 为纵坐标,绘制洗脱曲线。 合并、浓缩 将洗脱峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并,以 ( )浓缩至所需体积,加入 防腐,于 保存备用。长期保存时应贮于 冰箱。 凝胶的再生 在柱上先以 洗脱杂蛋白至流出液的 ,再以蒸馏水洗去柱中盐。然后按预处理过程将 再处理一遍即达再生。近期用时泡于洗脱缓冲液中 保存;近期不用时,以无水
15、酒精洗 次,再置 温箱烘干,装瓶内保存。,实验三 离子交换层析法分离血清白蛋白,【实验目的】 通过对白蛋白纯化的实验,培养学生综合运用离子交换层析手段分离蛋白质纯品的技能。,【基本原理】 离子交换是指液相中的离子与固定相上可解离基团的可逆交换反应。利用这个反应先将要分离的混合物在一定 的溶液中解离,而后流经固定相,使之与固定相上的可解离基团进行离子交换,吸附于固定相上,凡不能进行交换吸附的成分,则流出层析柱外。,再根据交换吸附于固定相的各组分解离力度的差别,运用不同的值或不同盐浓度的溶液作流动相,流过层析柱将各组分分别再交换洗脱下来,这样混合物的各组分即被分开,达到分离的目的,此即为离子交换层
16、析。,【试剂与器材】,. 磺酰水杨酸. . ( ):取 、 混合,用酸度计检查值应为。取该混合液用蒸馏水稀释至。. . 和 . 试剂. 层析柱. 黑、白比色板,【操作步骤】,. 纤维素的活化处理: ()取纤维素(纤维素的量(干重),一般按样品的蛋白质量计算,大约是蛋白质量的倍)悬于 溶液中,浸泡过夜,用锥形瓶盛装; ()次日,在布氏漏斗上轻吸过滤,用蒸馏水洗,直至左右,抽干;()用 浸泡,用蒸馏水洗净,直至左右,抽干;,()( )浸泡; ()倾去微细颗粒(浮悬),加入( )使容积为沉淀体积的倍; . 关闭柱的出口,向柱内加入体积的 ( ),将悬浮液 用玻棒引流连续倒入柱内,当交换剂沉积到底部时
17、,打开流出口,让缓冲液缓慢流出,再倒入更多的悬液,直至整个用量加完为止; . 将柱与储液瓶(内盛同样)连接,流洗几个柱体积的缓冲液,使柱床稳定,并使得流出液为;,. 纯化球蛋白:取实验所保存溶液(球蛋白),再对( )透析,更换数次,使蛋白质溶液中为; . 将透析后的粗提样品缓缓加在柱床顶部,打开出水口,待样品全部进入柱床后,缓慢流入( ),调整流速至,开始用管收集洗脱液,每管,先用磺酰水杨酸检测有无蛋白质流出(蛋白质遇磺酰水杨酸显白色,故用黑色比色板),待蛋白质流出后,迅速收集蛋白液(视收集量和蛋白质的浓度可选择用浓缩)。此不被吸附的即为纯化的球蛋白;,. 将收集到的蛋白液合并,紫外分光光度计
18、法(见实验)测定蛋白质的含量,取部分溶液进行纯度鉴定、分子量和等电点的测定实验; . 用完的凝胶柱用 流洗干净,再用 缓冲液()流洗平衡后可重复使用,但应将顶部吸去并新添,暂不用时可将其倒出,浸于正丁醇的缓冲液中,以防霉变。,. 纯化白蛋白 取上一实验所保存溶液(白蛋白), 再对( )透析,更换数次,使蛋白质溶液中为;透析后白蛋白样品上柱后,改用 缓冲液()洗涤,流出约 (其中含及球蛋白)后,将柱上的缓冲液面降至与纤维素床表面平齐。然后改用 缓冲液 ()洗脱,并用磺基水杨酸检查流出液是否含有蛋白质。由于纯化的白蛋白仍然结合有少量胆色素等物质,故肉眼可,见一层浅黄色的成分被 缓冲液洗脱下来,大约
19、改用 洗脱约 时,即可试出有蛋白质白色混浊,立即连续收集管,每管滴,此即为纯化的白蛋白液,取其中蛋白质浓度高的两管留作含量测定和纯度鉴定用(视收集量和蛋白质的浓度可选择用浓缩)。用过的层析柱,应重新再生平衡,方法如下,先用 流洗,再用 ()流洗平衡即可。暂不用时可将其倒出,浸于正丁醇的缓冲液中,以防霉变。,【注意事项】 . 装柱时柱子一定要垂直; . 装柱时应注意,柱床内不得产生界面、气泡,表面要平整; . 柱子用完后一定要用高浓度的盐溶液洗净。,实验四 聚丙烯酰胺()凝胶电泳测定蛋白质分子量,【实验目的】.学习测定蛋白质分子量的原理。.掌握垂直板电泳的操作方法。.运用测定蛋白质分子量及染色鉴
20、定。,【基本原理】,聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的分辨率,用它分离、检测蛋白质混合样品,主要是根据各蛋白组分的分子大小和形状以及所带电荷多少等因素所造成的电泳迁移率的差别。将已知相对分子质量的标准蛋白的迁移率对分子量的对数作图,可得到一条标准曲线。将未知相对分子量的蛋白质样品,在相同的条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率可在标准曲线上查得它的相对分子量。也可以用相关分析软件得出回归方程并计算出结果。,【仪器、材料与试剂】(一)仪器 . 电泳仪 垂直平板电泳槽 微量进样器(二)材料 . : .血清,(三)试剂 . 凝胶贮液:丙稀酰胺()、双丙稀酰胺(),溶解,定容至。 . 缓冲液: 加入 使之溶解,
21、再加入 溶液,混匀后在计上调至,最后加定容至。 . 分离胶缓冲液: 加入 溶液,再加到,。,. 电极缓冲液: 、 甘氨酸、 ,定容至。 . 样品缓冲液:甘油、巯基乙醇、溴酚蓝、 () 缓冲液,定容至。 . 过硫酸铵()溶液:溶于 中(要求现用现配)。 . 四甲基乙二铵()。,. 染色液: 考马斯亮兰 ,溶于固定液中,混匀。 . 脱染液:冰醋酸、甲醇、水,混匀。 . 标准蛋白(次高分子量)。 . 浓缩胶缓冲液: 加 溶液,加到,。 . 固定液:取甲醇,冰醋酸混匀。,【实验步骤】 . 将电泳槽玻璃板洗净,吹干,安装好;用的琼脂糖电泳缓冲液(琼脂糖溶于电泳缓冲液)封严玻璃板的边和底(保证不漏胶新式电
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