医学分子生物学实验技术课件.ppt

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1、医学分子生物学实验技术,2022/12/19,2,第一章蛋白质的分离纯化,生命大分子物质的特点：1、生命大分子是动物、植物和微生物在进行新陈代谢时所产生的活性物质2、生命大分子的特殊性和复杂性3、生命大分子都是由简单的小分子构成的物4、具有特殊的结构和功能5、生命大分子不稳定,2022/12/19,3,材料的选择与处理,材料的选择,有效成分：欲纯化的某种单一的生命大分子物质。相对于有效成分以外的物质称杂质。,材料来源,动物,植物 根、茎、叶,微生物,组织、器官,血液、分泌物,2022/12/19,4,选材原则：,含有效成分丰富、稳定性好；,来源丰富、保持新鲜；,材料适合加工提取；,具有经济利用

2、价值。,组织差异性,时间差异性,生理状态差异性,研究对象的选择,2022/12/19,5,蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质。蛋白质的分离(separation，isolation)和纯化(purification)工作是生物化学中一项艰巨而繁重的任务。,2022/12/19,6,蛋白质纯化的总目标是增加制品的纯度(purity)或比活(specific activity)，以增加单位蛋白质重量中所要蛋白质的含量或生物活性(比活常以活力单位数毫克蛋白质表示)。分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为前处理、粗分级分离和细分级分离3步,202

3、2/12/19,7,(1) 前处理 (pretreatment),分离纯化某一蛋白质，首先要求把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织。,2022/12/19,8,种子材料应先去壳甚至去种皮以免受杂质的污染，油料种子最好先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。,2022/12/19,9,机械破碎法,捣碎法,研磨法,匀浆法,物理破碎法,温度差破碎法,压力差破碎法,超声破碎法,化学破碎法 利用化学渗透的方法，通过有机溶剂、抗生素、表面活性剂、金属熬合剂、变性剂等，使细胞

4、膜破碎的方法。,酶促破碎法 利用酶的活性破坏细胞膜的化学结构使细胞膜破碎的方法。,2022/12/19,10,如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、核糖体或可溶性的细胞质等，则可利用差速离心方法将它们分开,在不同离心力场下沉降的细胞器,2022/12/19,11,如果碰上所要蛋白质是与细胞膜或膜质细胞器结合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适当的介质提取。,2022/12/19,12,(2) 粗分级分离 (rough fractionation),当蛋白质提取液(有时还杂有核酸、多糖之类)获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白质与其他杂蛋白分离开来。一般这一

5、步的分级分离用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质(包括脱盐)，又能浓缩蛋白质溶液。有些蛋白质提取液体积较大，又不适于用沉淀或盐析法浓缩，则可采用超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方法(如聚乙二醇浓缩法)进行浓缩。,2022/12/19,13,(3) 细分级分离 (fine fractionation),进一步纯化，一般使用层析法包括凝胶过滤，离子交换层析，吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳法，包括区带电泳、等电聚焦等作为最后的纯化步骤。用于细分级分离的方法一般规模较小，但分辨率很高。,2022/12/19,14,(4) 结晶,结

6、晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，蛋白质纯度愈高，溶液愈浓就愈容易结晶。尽管结晶并不能保证蛋白质一定是均一的，但只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。结晶也是进行X射线晶体学分析所要求的，结晶的最佳条件是使溶液略处于过饱和状态，此时较易得到结晶。接入晶种常能加速结晶过程。,2022/12/19,15,第二节 确立测定方法,寻找哪些生物材料中含有有效成分,监测有效成分提纯程度,光谱法,吸收光谱,荧光光谱,浊度分析,电化学法,生物活性检测法,免疫分析法,2022/12/19,16,

7、吸收光谱,根据有效成分的颜色、对紫外吸收能力进行测定；,利用有效成分与生色基团所进行的特殊的呈色反应进行测定。,荧光法：利用有效成分所进行的特殊的化学反应并偶联NAD或NADP的还原反应产生NADH或NADPH。还原型尼克酰胺发荧光。也可利用NAD和NADP的光谱变化进行测定,2022/12/19,17,2022/12/19,18,比色法,葡萄糖O2 H2O 葡萄糖酸H2O2,葡萄糖氧化酶,H2O2酚4AAP 醌亚胺H2O,浊度法：测定悬浮液在不被吸收的波长下表观的消光值。,电化学法：测定反应过程中H的浓度变化从而计算出有效成分含量。,生物活性检测,免疫分析法,2022/12/19,19,纯化

8、方案的设计与评价,纯化方案：在纯化某一物质过程中，根据被分离物质的理化性质、分离方法的优劣，将几种分离方法有机地结合并灵活应用，实现提取被分离物质的技术路线，称纯化方案。,2022/12/19,20,初分离,精细分离,盐析法,有机溶剂沉淀法,电泳法,层析法,离心法,离子交换层析,排阻层析,亲和层析,纯化方案的设计与评价,2022/12/19,21,纯化方案的设计与评价,纯化方案的评价：是对组成纯化方案的每一种分离方法的评价。,有效成分的含量测定,比活力测定( ),活力单位数,毫克蛋白,纯化倍数( ),每步的比活力,粗提液比活力,收得率( 100 ),每步的总活力,粗提液总活力,评价指标,202

9、2/12/19,22,蛋白质纯度和性质的分析,纯度分析,性质分析,比活性,电泳分析,高压液相或气相色谱,免疫分析,分子质量测定,分子结构测定,2022/12/19,23,几种常用的蛋白质纯化方法：,根据蛋白质在溶液中的性质分离纯化蛋白质的方法：分子大小；溶解度；电荷；吸附性质；对配体分子的生物学亲和力等。,2022/12/19,24,根据分子大小不同的纯化方法,1透析和超过滤透析(dialysis)是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开。常用的半透膜是玻璃纸和其他改型的纤维素材料。,2022/12/19,25,超滤是利用压力或离心力，强行使水和其他小

10、分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的。,2022/12/19,26,2密度梯度(区带)离心,蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成独立的区带，,2022/12/19,27,密度梯度,常用的密度梯度有蔗糖梯度，聚蔗糖梯度。蔗糖便宜，纯度高，浓溶液(60，WW)密度可达1.28 gcm3。聚蔗糖的商品名是Ficoll，它是由蔗糖和1氯2，3环氧丙烷合成的高聚物，Mr约400 000。密度梯度在离心管内的分布是管底的密度最大

11、，向上逐渐减小,2022/12/19,28,凝胶过滤层析 (分子排阻 ),（1）凝胶过滤的介质 凝胶过滤所用的介质是凝胶颗粒，其内部是多孔的网状结构，,2022/12/19,29,二、利用溶解度差别的纯化方法,影响蛋白质溶解度的外部因素很多，其中主要有：溶液的pH，离子强度，介电常数，温度。自身因素：在同一的外部条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度，这是因为溶解度归根结底取决于它们本身的分子结构，例如分子所带电荷的性质和数量、亲水基团与疏水基团的比例，它们在蛋白质分子表面的排列以及由此而产生的偶极矩等。,2022/12/19,30,1. pH控制蛋白质的沉淀,蛋白质处于等电点时，其静电荷为零，由

12、于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。不同的蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。,2022/12/19,31,2. 蛋白质的盐溶和盐析,盐溶：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶。,由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强，因而溶解度增高,盐溶,2022/12/19,32,盐析：当溶液的离子强度增加到一定数值时，蛋白质溶解度开始下降。当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和的程度，很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来，这种现象称为盐析（salting out

13、）。,2022/12/19,33,3有机溶剂分级分离法,与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇和丙酮等)能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下，这些有机溶剂不仅能引起蛋白质沉淀，而且伴随着变性。,2022/12/19,34,3有机溶剂分级分离的机理,有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是改变了介质的介电常数。水是高介电常数物质(20时，80)，有机溶剂是低介电常数物质(20时，甲醇33，乙醇24，丙酮21.4)，因此有机溶剂的加入使水溶液的介电常数降低。这样，蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，因此促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一重要方式可能与盐析相

14、似，与蛋白质直接争夺水化水，致使蛋白质聚集而沉淀。,2022/12/19,35,4温度对蛋白质溶解度的影响,在一定温度范围内，约040之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加， 在4050以上，大部分蛋白质变得不稳定并开始变性，一般在中性pH介质中即失去溶解能力。大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此蛋白质的分级分离操作一般都在0或更低的温度下进行。,2022/12/19,36,电泳 是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象,蛋白质的电泳分离,2022/12/19,37,蛋白质胶体颗粒的沉淀,带正电荷的蛋白质,带负电荷的蛋白质,在等电点的蛋白质,酸,酸,碱,碱,脱水,脱水,脱

15、水,不稳定的蛋白质颗粒 （沉淀）,带正电荷的蛋白质 （疏水胶体）,带负电荷的蛋白质 （疏水胶体）,碱,酸,（亲水胶体）,（亲水胶体）,（亲水胶体）,2022/12/19,38,带电颗粒在电场中所受到的电场力,F=EQ,根据Stoke定律，球形分子在液体中泳动所受到的阻力,F=6rv,电泳原理：,2022/12/19,39,F=F,即：EQ= 6rv 时，,当物质在电场中移动时，受到电场力和液体阻力两方面的力的影响，当电场力和阻力平衡时，带电颗粒作匀速运动，,2022/12/19,40,两个带电颗粒能否分开，由两个颗粒在电泳过程中的迁移率所决定，即,或,2022/12/19,41,迁移率（或泳动

16、度）是指带电颗粒在单位电场强度下泳动的速度，可用下列公式计算： =/E =(d/t)/(V/l) =dl/Vt 为迁移率（cm2V-1min-1）；为颗粒泳动速度（cms-1）；E为电场强度（Vcm-1）；d为颗粒泳动的距离（cm）；l为滤纸有效长度（cm）；V为实际电压（V）；t为通电时间（s或min）。通过测量d, l, V, t, 即可计算出被分离物质的迁移率。,2022/12/19,42,影响电泳的因素,1、带电粒子的性质与电泳行为,2、电场强度对带电粒子迁移的影响：电场强度也称电位梯度，是指单位长度（每一厘米）支持物体上的电位降，它对泳动速度起着十分重要的作用。一般，电场强度越高，带

17、电颗粒移动速度越快。,2022/12/19,43,3、溶液的pH对带电粒子迁移的影响：溶液的pH值决定了带电颗粒解离的程度，也决定了物质所带净电荷的多少。,4、电渗对电泳的影响：电渗是在电场中液体对固体的相对移动。,2022/12/19,44,电 渗 作 用,2022/12/19,45,5、离子强度对电泳的影响：电泳液中的离子增加会使电泳迁移率降低，原因是带电的离子会吸引相反符号的离子聚集在其周围，形成一个与运动粒子符号相反的离子氛，它使该离子向相反的方向运动，从而降低了该粒子的迁移率。,2022/12/19,46,6、温度对的电泳的影响：电泳过程中由于通电产生焦耳热，热对电泳有很大的影响。

18、温度每升高1，迁移率约增加2.4%。为降低热效应对电泳的影响，可控制电压或电流，或在电泳系统中安装冷却散热装置 。,2022/12/19,47,电 泳 的 分 类 和 特 点,电泳的分类,自由移动界面电泳,区带电泳,稳态电泳,2022/12/19,48,自由移动界面电泳（moving boundary electrophoresis），没有支持物，在一个U形管中进行电泳，目前已被区带电泳所取代。,区带电泳（zone electrophoresis）在一定的支持物上进行的电泳，电泳结果形成一条条的区带而得名。,稳态电泳（steady state electrophoresis）带电颗粒电泳一定时

19、间后达到稳态而停止移动。,2022/12/19,49,2022/12/19,50,根据电荷不同的纯化方法,根据蛋白质的电荷不同即酸碱性质不同分离蛋白质混合物的方法有电泳和离子交换层析两类。 1. 电泳(electrophoresis)在外电场的作用下，带电颗粒，向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。 蛋白质电泳分离原理：分子大小不同的蛋白质所带电种类不同，净电荷密度不同，迁移率不同，因此，在电泳时可以分开。,2022/12/19,51,电泳的类型,目前电泳的类型很多， 最常见的是区带电泳，由于在支持物上电泳时蛋白质混合物被分离成若干区带而得名。,2022/12/19,52,区带电泳按其

20、支持物的物理性状不同可以分成4类： 滤纸电泳和薄膜电泳(如醋酸纤维薄膜电泳和聚酰胺薄膜电泳)； 粉末电泳，支持介质是淀粉、纤维素粉或硅胶粉等，粉末与适当的溶剂调和，铺设成平板；,2022/12/19,53, 细丝电泳，如尼龙丝和其他人造丝电泳，这是一类微量电泳； 凝胶电泳，最常用的支持介质有聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶，前者适于分离蛋白质和多核苷酸，后者适于分离核酸，这两种凝胶电泳的分辨率都很高，,2022/12/19,54,2022/12/19,55,双向电泳 (two-dimensionalelectrophoresis),2022/12/19,56,2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (polyacry

21、laminde gel electrophoresis，简称PAGE),也称圆盘电泳，它是在区带电泳的基础上发展起来的。它以聚丙烯酰胺凝胶为支持物,一般制作成凝胶柱或凝胶板，,2022/12/19,57,按其凝胶的组成系统可分成四种：,(1) 连续凝胶电泳：只用一层凝胶，采用相同的pH值和相同的缓冲液。(2) 不连续凝胶电泳：采用二层或三层性质不同的凝胶(即：样品胶、浓缩胶和分离胶)重叠起来，使用两种不同的pH值（6.7和8.3）和不同的缓冲液（Tris-HCl和Tris-Gly）(3) 梯度凝胶电泳：采用梯度混合装置，使制得的凝胶由上至下孔径逐渐减小(即凝胶浓度由上至下逐渐增高)。梯度凝胶电

22、泳主要适宜于测定球蛋白的相对分子质量。(4) SDS凝胶电泳：在聚丙烯酰胺凝胶中加入 SDS(十二烷基硫酸钠),2022/12/19,58,4等电聚焦 (isoelectric focusing，IEF),等电聚焦是60年代建立的一种高分辨率的蛋白质分离和分析技术。它是利用蛋白质分子或其他两性电解质分子具有不同的等电点，从而在一个稳定、连续、线性的pH梯度中得到分离。 近年来，等电聚焦电泳技术的分辨率有了很大提高，可以分辨pI只差0.001的生物大分子，这是等电聚焦最突出的优点，,2022/12/19,59,凝胶聚合的原理及有关特性,1聚合反应 凝胶的聚合单体:丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双

23、丙烯酰胺(Bis)；常用过硫酸铵(AP)为催化剂，四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。TEMED的碱基可催化AP水溶液产生游离氧原子，激活Acr单体，使其聚合成单体长链，在Bis作用下，聚合成网状凝胶。碱性条件下凝胶易聚合，室温下7.5的凝胶在pH8.8时30min聚合，在pH4.3时约需90min。 此外，核黄素亦可为催化剂，聚合需光照，故使用不多。,2022/12/19,60,丙烯酰胺凝胶聚合原理,2022/12/19,61,2022/12/19,62,凝胶浓度与被分离物相对分子质量的关系,2022/12/19,63,PAGE原理,PAGE根据其有无浓缩效应，分为 连续系统：电泳体系中缓冲

24、液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应； 不连续系统：由电极缓冲液、样品胶、浓缩胶及分离胶组成，两层玻璃板中排列顺序依次为上层样品胶、中间浓缩胶、下层分离胶。电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性。,2022/12/19,64,不连续PAGE系统：,样品胶的T=3，c=2，缓冲液为pH6.7的Tris-HCl，其作用是防止对流，促使样品浓缩以免被电极缓冲溶稀释。目前，一般不用样品胶，直接在样品液中加入等体积40蔗糖，同样具有防止对流及样品被稀释的作用。,T = (a+b)/m l00c = b/(a+b) 100式中 a：Acr克数； b

25、：Bis克数； m：缓冲液体积(ml)。 T：Acr和Bis总浓度 c：交联剂百分比,2022/12/19,65,浓缩胶是样品胶的延续，凝胶浓度及pH值与样品胶完全相同，其作用是使样品进入分离胶前，被浓缩成窄的区带，从而提高分离效果。 分离胶的T=7.0一7.5%，c=2.5，缓冲液为pH8.9的Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷)，大部分蛋白质在此pH条件下带负电荷。此胶主要起分子筛作用。,2022/12/19,66,不连续PAGE电泳的3种物理效应：, 样品的浓缩效应； 凝胶对被分离分子的筛选效应(颗粒小的移动快，颗粒大的移动慢)； 一般电泳分离的电荷效应。由于这3种物理效应，使样品分离效

26、果好，分辨率高。人血清用纸电泳只能分成57个组分，而圆盘电泳则可分成几十个清晰的条带。,2022/12/19,67,样品浓缩效应(由三种不连续性造成),（1）凝胶孔径的不连续性 上述三层凝胶中，样品胶及浓缩胶为大孔胶；分离胶为小孔胶。在电场作用下，样品颗粒在大孔胶中泳动的阻力小，移动速度快；当进入小孔胶时，受到的阻力大，移动速度减慢。因而在两层凝胶交界处，样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。,浓缩胶,分离胶,2022/12/19,68,(2) 缓冲体系离子成分及pH值的不连续性,HCl在任何pH溶液中均易解离出Cl，在电场中迁移率快，走在最前面称为快离子。 在电极缓冲液中，除有Tris外，还有甘氨

27、酸，其pI=6.0，在pH8.9的电极缓冲液中，易解离出甘氨酸根(NH2CH2COO)，而在pH6.7的凝胶缓冲体系中，甘氨酸解离度仅有0.11，因而在电场中迁移很慢，称为慢离子。,Tris-HClpH=6.7,pH=8.9,Gly,Cl-,Gly-,Tris-HCl,血清中大多数蛋白质pI在5.0左右,迁移率介于快离子与慢离子之间，,+,凝胶缓冲体系，Tris-Gly,pH=8.3,2022/12/19,69,(3) 电位梯度的不连续性,电泳开始后，快离子的快速移动会在其后形成一个离子强度很低的低电导区，使局部电位梯度增高，将蛋白质浓缩成狭窄的区带。,2022/12/19,70,分子筛效应,

28、大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。 蛋白质进入pH8.9的同一孔径的分离胶后，分子小且为球状的蛋白质分子所受阻力小，移动快，走在前面；反之，则阻力大，移动慢，走在后面，从而通过凝胶的分子筛作用将各种蛋白质分成各自的区带。 这种分子筛效应不同于柱层析中的分子筛效应，后者是大分子先从凝胶颗粒间的缝隙流出，小分子后流出。,2022/12/19,71,电荷效应,在pH8.9的分离胶中，各种带净电荷不同的蛋白质有不同的迁移率。净电荷多，则迁移快；反之，则迁移慢。因此，各种蛋白质按电荷多少、相对分子质量及形状，以一定顺序排成一个个区带，因而

29、称为区带电泳。,2022/12/19,72,2022/12/19,73,蛋白质的层析分离,层析的分类,分配层析,吸附层析,离子交换层析,分子筛（凝胶过滤）层析,亲和层析,2022/12/19,74,层析技术的基本原理,任何一种层析技术都由互不相溶的两相组成，分别称为固定相和流动相。被分离的物质由于其本身的物理性质或化学性质的不同，在两相中的分配系数（溶解度）不同，经过一定的时间后，混合在一起的物质彼此实现分离。,2022/12/19,75,2022/12/19,76,2022/12/19,77,2022/12/19,78,迁移率(Rf)：层析过程中，样品移动的相对速率或相对距离。,a,b,Rf

30、= =,溶质斑点中心移动的距离,溶剂前沿移动的距离,a,b,滤纸,前沿,原点,影响Rf值的主要因素,物质的结构和极性的影响：一般来说，物质分子中极性基团增加，物质的极性就随着增加，则分配系数变大，Rf值变小。而分子中(-CH2-) 增加分子极性变小，Rf值相应变大。,2022/12/19,79,常用参数：,1/2h,0.607h,2022/12/19,80,如图所示为一色谱流出曲线：,2022/12/19,81,基线：在正常的操作条件下，仅有流动相（无被分离样品）通过检测器时所产生的信号。,层析峰：样品从洗脱开始到样品流出层析柱时，检测器对层析样品和层析时间所产生的信号。,峰高：峰的最大值到峰

31、底的距离。,峰宽：层析峰半高峰时的宽。,峰面积：峰与峰底间的面积。,2022/12/19,82,层析峰区域宽度,半峰宽：峰高一半处的峰宽度。,峰宽：峰的基线宽度，通过层析峰两侧拐点作切线交于基线上的距离。,标准差：样品组分被带出层析柱的分散度，用表示。两侧拐点之间的距离为2个标准差。,Wb=4 =1.699W1/2,W1/2=2.354 ,2022/12/19,83,保留值：表示样品中各组分在层析柱中停留时间的长短或组分流出时所需流动相体积的大小。,保留时间和保留体积：样品组分通过层析柱出峰所需的时间称保留时间；样品组分通过层析柱出峰时所需流动相的体积称保留体积。,2022/12/19,84,

32、死时间或死体积：柱中未被固定相所占有的空间，如柱的接口、柱出口管路、检测器内腔空间及柱内填充空隙等称为死体积；流动相流经死体积所需的时间称死时间。,调整保留时间或调整保留体积：保留时间中扣除死时间后的时间；或保留体积中扣除死体积后的体积。,2022/12/19,85,分离度：指相邻两峰的保留时间差值是两峰宽平均值的几倍。,因Wb=4 ，即分离度为1时， tR 4 。两峰有98分离。,当W1=W2，且峰面积相等时,RstR/ W,2022/12/19,86,柱效：层析过程是一个连续过程，流动相不断流过，在任何一点上实际上都无法获得平衡，当流动相通过柱的一定高度，在离开这段柱时，流动相中某组分的平

33、均浓度与固定相中的平均浓度可以达到分配平衡，完成这一平衡所需要的柱长称为理论塔板等效高度，简称板高,N=L/H,2022/12/19,87,层析的主要设备,2022/12/19,88,2022/12/19,89,自动分步收集器,2022/12/19,90,离子交换层析法,离子交换层析利用物质的电荷与层析载体(离子交换剂)电荷之间的相互作用达到分离纯化目的的技术。,离子交换层析分离蛋白的依据是其带电状态，当溶液pH高于目的蛋白等电点时，蛋白带净负电荷，可与阴离子交换剂结合；如pH低于蛋白等电点时蛋白带净正电荷，与阳离子交换剂结合。,2022/12/19,91,2022/12/19,92,常用离子

34、交换纤维素的种类和特性,2022/12/19,93,离子交换层析技术的基本操作,1、样品的准备,2、离子交换剂和层析柱的准备,1）纤维素离子交换剂的预处理,0.5mol/L NaCl 浸泡30min，蒸馏水洗至pH8.00.5mol/L HCl浸泡30min，蒸馏水洗至中性0.5mol/L NaCl 浸泡30min，蒸馏水洗至pH8.0最后用上样缓冲液平衡,2022/12/19,94,2）葡聚糖离子交换剂的预处理,Sephadex用前在上样缓冲液中室温浸泡一天DEAESephadex CL6B使用前用12mol/L NaCl浸泡，然后用上样缓冲液平衡DEAESephadex是以24%乙醇中提供

35、的，用前要用起始缓冲液充分洗涤。,2022/12/19,95,3、层析柱的准备：将层析介质均匀的装入适当的玻璃管中组成离子交换柱。离子交换层析柱一般较短粗，高径比一般在10:115:1。层析柱太高将使样品扩散而稀释。上样量根据层析柱的交换容量决定，一般为交换容量的1/10。,2022/12/19,96,2022/12/19,97,2022/12/19,98,4、目的蛋白的洗脱 样品上样后，用特定的缓冲液从被离子交换剂吸附的组分从层析柱上洗脱下来，这一过程称为洗脱。离子交换层析的洗脱有两种方式：1)改变洗脱液的离子强度；2)改变洗脱液的pH值,2022/12/19,99,每种方式又分为阶段洗脱和

36、梯度洗脱两种类型。,阶段洗脱：用一系列不同浓度的洗脱液逐次对层析柱进行洗脱的方式,2022/12/19,100,1、阶段洗脱：用几种具有不同洗脱能力的缓冲液相继进行活脱,阶段洗脱的优点： 设备和操作简单 洗脱迅速 洗脱液体积小这种洗脱方式适合于混合物组成简单，目的物在层析行为上和其它有组分有显著差别或需要快速分离时。,2022/12/19,101,阶段洗脱的缺点：,亲和力相近的不同组分不易分开，而生物介质中具有相似层析特性的组分往往是很多的，很难找到使某一种组分解吸，而其它组分皆不解吸的条件。 拖尾现象：生物大分子和离子交换纤维素表面的电荷分布都是不规则的，电荷密度大，排列恰当的部位亲和力大，

37、另一些部位亲和力小，所以同一个组分的不同分子所遇到的微环境有差别，吸附紧密程度不同。在一个恒定的洗脱条件下，吸附较紧密的分子落在后面形成拖尾现象。,2022/12/19,102,同一个组分的多峰现象：由于同一个组分的不同分子吸附紧密程度不同，每当改换一次洗脱能力较大的洗脱液时，便出现一个峰，导致一个组分出现几个假峰。,2022/12/19,103,梯度洗脱：用连续浓度的溶液对层析柱进行连续洗脱的洗脱方式。,2022/12/19,104,2、梯度洗脱：在梯度活脱中缓冲液的洗脱能力是逐渐的连续的加强。在梯度洗脱的条件下，同种组分中那些因为吸附较紧密而落在后面的分子，会因为洗脱能力的逐步加强而赶上前

38、面的分子，克服了阶段洗脱中的拖尾现象和假峰。同时，混合物中的各个组分将逐个地进入解吸状态，而被逐次洗脱为峰形对称的各个清晰层析谱峰，分辨力大大超过阶段洗脱。,2022/12/19,105,连续梯度的形式及连续梯度的建立,2022/12/19,106,2022/12/19,107,缓冲液的选择,1、对缓冲液pH的选择：决定于被分离物质的等电点、稳定性和溶解度，也要根据交换纤维素解离基团的pK值。用阴离子交换纤维素时要选用低于其pK值的缓冲液，用阳离子交换纤维素则要选用高于其pK值的缓冲液。pH值一经选定，便限制了缓冲液种类选择。适用于不同pH范围的一些常用缓冲液种类如下表：,2022/12/19

39、,108,常用缓冲液种类,2022/12/19,109,3.1.2 缓冲液的选择,2、为了获得足够的缓冲容量，选用的缓冲离子，其pK值要尽量接近起始缓冲液的pH值(最好约在0.5个pH单位之内)。这样可降低因缓冲液离子与离子交换纤维素的相互作用和由吸附过程本身所引起的pH紊乱。否则会出现pH的交错界面而形成假峰。,2022/12/19,110,3.1.2 缓冲液的选择,3、适宜的缓冲液必须在所选择的pH范围内有足够的缓冲能力，而且必须不影响目的物的活性，并且不干扰洗脱液的分析。如用紫外吸收法来分析洗脱液中的蛋白质和核酸含量时不能选用含芳香族化合物(如吡啶、巴比妥)的缓冲液。而假如用215225

40、nm波长光测吸收进行分析时，则不能用含有羧基的缓冲液。选用的缓冲液也必须不影响样品的溶解性或与一些活性保护剂(如Ca、Mg)等生成沉淀。,2022/12/19,111,3.1.2 缓冲液的选择,4、用阳离子交换纤维素时一般应使用阴离子型缓冲液(如磷酸、醋酸等)，而用阴离子纤维素时则应使用阳离子型缓冲液(如Tris，吡啶等)，以避免缓冲液离子被吸附而形成人为的pH和盐浓度交错界面。 5、为了结合尽可能多的样品，起始缓冲液的离子强度一般较低，为0.0010.01M。当用增加离子强度进行洗脱时，为使层析系统尽可能地单一，可以用单纯增加缓冲液离子浓度的办法来达到，这样便于控制pH。,2022/12/1

41、9,112,3.1.2 缓冲液的选择,6、当需要将洗脱液分部干燥后测量放射性时，残渣中的盐会妨碍放射性的正常测量或分离较小的分子时去盐也常常出现困难，在这些情况下可选用挥发性缓冲液。 7、在进行某些容易丢失活性的物质的层析分离时，缓冲液中可适当加入保护剂，如巯基保护剂：半胱氨酸、巯基乙醇；螯合剂：EDTA、甘氨酸；无机离子等。,2022/12/19,113,洗脱液按一定的体积分别收集后逐管进行分析，最后将分析结果对收集管号作图。,2022/12/19,114,分析分为两种类型：1、非特异性分析，反映各组分的分离情况；2、特异性分析，反映目的物的具体位置。,洗脱峰纯度鉴定理论上应出现一个对称的峰

42、，但实际上吸附层析得到的峰几乎都有拖尾现象。鉴定可用圆盘电泳和凝胶过滤法。,2022/12/19,115,3.6 应用实例,DEAE纤维素柱层析分离甘露醇脱氢酶,2022/12/19,116,DEAE纤维素柱上的层析分离人血清免疫球蛋白的分离情况,2022/12/19,117,兔球蛋白的木瓜蛋白酶水解物在CM纤维素柱上的层析分离,2022/12/19,118,天花粉各成分用特种离子交换剂层析分离,2022/12/19,119,2022/12/19,120,天花粉各成分用特种离子交换剂层析分离,2022/12/19,121,2022/12/19,122,E.Coli核酸在甲基血清白蛋白硅藻土层析

43、柱上的分部分离情况,2022/12/19,123,凝胶过滤(分子筛层析),2022/12/19,124,2022/12/19,125,2022/12/19,126,凝胶层析中常用的术语和参数,2022/12/19,127,床体积：膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积（Vt）表示。,Vt=V0+Vi+Vg,内水体积：是层析基质颗粒内部所含水的体积，用（V0）表示。,外水体积：层析基质颗粒之间所含水的体积，用（Vi）表示。,基质体积：层析基质本身在层析柱中所占有的体积（Vg）表示。,2022/12/19,128,凝胶过滤的分配常数,在给定的条件下，Vt和Vo都为恒定值，而Ve随着分离物分子质量的变化

44、而变化。对凝胶过滤，其分配常数应在0Kav1。当被分离物质完全排阻时，Kav等于0，Ve等于V0；当被分离物质自由扩散时，Kav等于1，Ve等于VoVi。,2022/12/19,129,从上式可以看出，Ve、Vo可通过层析过程中测定，只要测出Vt即可计算出Kav。,Vt是凝胶过滤柱床总体积，由三部分组成，即VoViVg。,Vtr2h或用 VtVoViVg,Vg很小，可忽略不计。V0一般用蓝色葡聚糖2000测定，其分子是为200万，呈蓝色，在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可直接观察。,2022/12/19,130,Vi的测定：选用一种分子量小于凝胶工作范围下限的化合物，测出洗脱体积，减去

45、V0就是Vi。常用铬酸钾来测定，铬酸钾为黄色化合物，可直接观察，优点为不与葡聚糖起任何反应；也可用硫酸铵测定，用硝酸银检出洗脱峰。,2022/12/19,131,凝及的选择和处理,凝胶的选择,凝胶的型号和粒度的选择,型号的选择：选择时主要根据凝胶的筛分范围、凝胶分辨率及分离目的而确定。,粒度的选择：根据层析对分辨率及流速的要求合理的选择凝胶的粒度。,2022/12/19,132,主要凝胶过滤介质的牌号及骨架结构,2022/12/19,133,2022/12/19,134,性能：,(1)溶胀性 Sephadex系均以干态供应，使用前必须在过量的溶剂中充分溶胀后才能使用。,(2)化学稳定性 Sep

46、hadex不溶于一切溶剂，在水、盐溶液、有机溶剂、碱及弱酸溶剂中均较稳定。因葡聚糖中的糖苷键在强酸中可发生降解作用，所以只能接触强酸的稀溶液，在0.1mol/L盐酸中可接触12小时，在0.02mol/L盐酸中经6个月均无明显变化，但要避免作用氧化剂。,2022/12/19,135,(3)物理稳定性 pH中性湿态珠体可经受120、30min高压灭菌而不影响色谱性能,(4)机械强度 Sephadex凝胶的机械强度取决于交联度，交联度越大，机械强度越高。机械强度与柱床所能承受的压力有关，其压力与流速的关系为：,V：线速度， cm/h； P：压力降，cm水柱；L：床高；K：比渗透率，受粒径影响较大。,

47、2022/12/19,136,葡聚糖凝胶(G),2022/12/19,137,Sephadex的型号及性能,2022/12/19,138,(二)、琼脂糖系 由经过纯化的琼脂糖制备，其中含有极小的带电基团。利用琼脂糖热溶液冷却时可凝胶化的特点，能方便地制成珠状物。在凝胶过程中由单独的多糖链先形成双螺旋，然后聚集成胶束。胶束之间有孔，孔的大小取决于胶束的多少即琼脂糖的浓度。传统的琼脂糖凝胶非特异性吸附极低，分离范围很广，分离范围从1000040000000，所以适用于分子量差距较大的分子间分离，分辨率不很高。琼脂糖凝胶有两种牌号BioGel A系和Sepharose,2022/12/19,139,

48、2022/12/19,140,BioGel A系型号及性能,2022/12/19,141,Sepharose系型号能性能,2022/12/19,142,Sepharose是该系中最早的产品，为非交联结构，因此不能进行高压灭菌，仅能在240范围内使用。根据琼脂糖含量的不同，对含量为2、4及6的产品分别命名为2B、4B和6B。由于新型凝胶的不断出现，此型凝胶有逐渐被淘汰的趋势。,2022/12/19,143,Superose为刚性半刚性珠体，在高黏性液体如8mol/L尿素下也能保持适当流速将广泛的分离范围及高分辨率集于一身，适用于糖类、核酸、病毒等的分离，特别是包含体蛋白在促溶剂中的纯化。能一次性

49、分离生物分子大小差异较大按的混合物。由于颗粒细小，粒度分布均匀，柱效高，可允许高流速，适用于中、高压层析系统分离。,2022/12/19,144,Sepharose Fast Flow 是新型的BioProcess凝胶介质，经过高度交联的琼脂糖珠体。具有机械强度高、流速快、极高的物理化学稳定性及非特异性吸附极低等特点，而适合工业规模生产使用。对蛋白质的回收率很高，并可用多种促溶剂及有机溶剂或12mol/L的NaOH进行清洗。,2022/12/19,145,聚丙烯酰胺系,由丙烯酰胺与N,N亚甲基双丙烯酰胺共聚而成的亲水性凝胶。是结构稳定的合成高聚物，不受微生物侵蚀，可在120消毒30min后，色

50、谱性能不变。干胶的羧基含量3.0mmol/g，含有极少的游离电荷，所以非特异性吸附很小。还可以通过改变交联剂的用量控制凝胶孔径的大小，得到不同排阻极限的系列产品。,2022/12/19,146,2022/12/19,147,BioGel P类凝胶,2022/12/19,148,2022/12/19,149,2022/12/19,150,2022/12/19,151,2、凝胶用量的计算：根据层析柱的体积和干凝胶的膨胀度按以下公式计算；,2022/12/19,152,3、凝胶的处理：将所用的干凝胶慢慢倾入510倍的蒸馏水中，按凝胶本身的要求进行溶胀时间进行浸泡，弃去上层悬浮的小颗粒，再用0.5mo