高效液相色谱法应用讲座ppt课件.ppt
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1、高效液相色谱法应用讲座,台州市药品检验所 曾茂法,1、HPLC概述,2、HPLC实验操作应知,3、HPLC常见问题与思考,主要内容,HPLC实验操作应知,HPLC操作操作流程流动相的配制色谱柱使用与维护实验操作注意事项检测器数据处理,1 概述,定义,分离模式与主要分离机制,基本术语,正相与反相色谱,HPLC的特点,问题思考,定义,HPLC用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。,仪器结构简介,仪器组成根据需要配置流动相在线脱气装置、梯度洗脱装置、自动进样系统、柱后反应系统等。,泵,输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析
2、结果的可靠性。输液泵应具备如下性能:流量稳定,其RSD应0.5%,这对定性定量的准确性至关重要;流量范围宽,分析型应在0.110 ml/min范围内连续可调,制备型应能达到100 ml/min;输出压力高,一般应能达到150300kg/cm2;液缸容积小;密封性能好,耐腐蚀。,泵的使用和维护注意事项,防止任何固体微粒进入泵体,常用的方法是滤过,输液泵的滤器应经常清洗或更换。 流动相不应含有任何腐蚀性物质,含有缓冲液的流动相不应保留在泵内,尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。 溶剂瓶内的流动相被用完。 输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力,否则会使高压密封环变形,产生漏液。,附:高效液相色谱
3、仪流程图,泵,1.2 HPLC分离模式与主要分离机制,正相色谱法与反相色谱法,正相色谱法反相色谱法,正相与反相,正相色谱法 反相色谱法固定相极性高中 中低流动相极性低中 中高组分洗脱次序极性小先洗出 极性大先洗出,正相:流动相极性,洗脱能力,k ,组分tR反相:流动相极性,洗脱能力,k,组分tR,1.3特点,适用范围宽:现在绝大部分化学类药品皆可采用该仪器分析。 分离效率高:复方分析、辅料干扰时等情况下,更显示其威力。 速度快:一般出峰时间均在30min以内。,灵敏度高:可检测物质达10-9g左右,一般最低检测浓度均可达10-110-3g/ml(进样体积1020l)。并可通过使用不同的检测器,
4、测定不同物质,或再提高测定灵敏度。,色谱柱可反复使用:一般保存好,均可达2年以上。 流出的组分容易收集:可用于制备色谱或价格极为昂贵的物质收集。,安全:仅有一些有机溶剂的污染(使用时,流动相口要密封,一者以免挥发,流动相中各组分比例不准,二者防止挥发,污染环境),比气相要安全的多。,1.4 思考,1、为什么说分离度与重复性是系统适应性试验指标中是更具有实用意义的参数?2、影响柱效的因素有哪些?3、影响分离度的因素有哪些?4、影响重复性的因素有哪些?,Rs,仪器,影响分离的因素,1,思考,si、bar、Mpa如何换算?乙醇为什么不常用作流动相?,2、HPLC操作操作流程,开机 最后开检测器配制流
5、动相流动相平衡,在此过程和适当时候调节柱温、流速、流动相比例。必要时要选柱子。配制对照品、样品溶液。系统适应性试验进样数据处理关机 先关检测器,后冲洗,流动相的配制,流动相应具有的特点流动相脱气流动相过滤除去微粒流动相贮存流动相极性与截止波长流动相调pH值思考题,流动相具备以下的特点: a、流动相对样品具有一定的溶解能力,保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。 b、流动相具有一定惰性,与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。 c、流动相的黏度要尽量小,以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果;同时降低柱压降,延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。,d、流动相
6、的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器,最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。 e、流动相沸点不要太低,否则容易产生气泡,导致实验无法进行。,流动相为什么要脱气,流动相使用前必须进行脱气处理 ,以除去其中溶解的气体(如O2),以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时,因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音,造成灵敏度下降,甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化,柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。若用FLD,可能会造成荧光猝灭。,常用的脱气方法比较,氦气脱气法:利用液体中氦气的溶解度比空气低,连续吹氦脱气,效果较好,但成本高。加热回流法:效果较好,但操作复杂,
7、且有毒性挥发污染。抽真空脱气法:易抽走有机相。,常用的脱气方法比较,超声脱气法:流动相放在超声波容器中,用超声波振荡10-15min,此法效果最差。在线真空脱气法:Agilent1100LC真空脱机利用膜渗透技术, 在线脱气,智能控制,无需额外操作,成本低,脱气效果明显优于以上几种方法,并适用于多元溶剂体系。,压力、温度与气泡,压力减少时要产生气泡温度升高时要产生气泡,防止产生新的气泡,沿管壁缓缓倒入先混合后脱气 梯度洗脱预先“部分混合”,为什么要滤除微粒,为什么溶剂和样品要过滤? 色谱柱:由于填料颗粒很细,色谱柱内腔很小,溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。仪器:溶剂和样品中的
8、细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损,同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。要正确选用滤膜,流动相的贮存,流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内,不能贮存在塑料容器中。贮存容器一定要盖严,防止溶剂挥发引起组成变化,也防止氧和二氧化碳溶入流动相。磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉,应尽量新鲜配制使用,不要贮存。如确需贮存,可在冰箱内冷藏,并在3天内使用,用前应重新滤过。,流动相的贮存,容器应定期清洗,特别是盛水、缓冲液和混合溶液的瓶子,以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物。因甲醇有防腐作用,所以盛甲醇的瓶子无此现象。,6,流动相常用溶剂的极性和截止波长 由极性可以看出,在反相色谱中,要使
9、出峰时间加快,可增加流动相中的乙腈比例,但要注意分离度的减小;若要使出峰时间减慢,可增加流动相中水的比例,增加水的比例还会引起分离度的增加;两者之间综合来考虑。四氢呋喃使用时注意波长。必须选用色谱级的。,由于甲醇的极限波长为210nm左右,故短波长测定时,最好不要采用甲醇,而用乙腈。 样品稀释用溶剂的选择:测定有关物质时最好选用流动相,避免以溶剂峰的干扰,水往往出倒峰。,各溶剂截止波长,流动相的pH值,采用反相色谱法分离弱酸(3pKa7)或弱碱(7pKa8)样品时,通过调节流动相的pH值,以抑制样品组分的解离,增加组分在固定相上的保留,并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。对于弱酸,流动相的p
10、H值越小,组分的k值越大,当pH值远远小于弱酸的pKa值时,弱酸主要以分子形式存在;对弱碱,情况相反。,分析弱酸样品时,通常在流动相中加入少量弱酸,常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液;分析弱碱样品时,通常在流动相中加入少量弱碱,常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和30mmol/L三乙胺溶液。 注:流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的强相互作用,减轻或消除峰拖尾现象。所以在这种情况下有机胺(如三乙胺)又称为减尾剂或除尾剂。,流动相的配制,缓冲盐溶液 浓度不要配错 ,临用新配 调PH时一般在水相调,当流动相中有机相比例较高时无法调。,思考题,1、流动相流速与组成与保留时间的关
11、系如何?2、流速与柱效、峰面积的关系3、乙腈与甲醇在应用上的区别。4、水与有机相混合比例不同,会引起粘度变化吗?5、流动相有时为什么要调pH?6、流动相配好后可用多长时间?,色谱柱的使用与维护,阅读说明书安装时注意方向如何排气泡?反相柱C-18或C8当用含缓冲盐或表面活性剂的流动相后,要冲洗干净。,色谱柱的使用与维护,色谱柱不用、存放时,两头柱塞一定塞住,防止柱内溶剂挥干,否则容易挥发干损伤柱子。分析生化样品、血液制品和手性色谱柱时,最好加一预柱以保护。流动相极性及流速(压力)不要突变。,(1)色谱柱不能够碰撞、弯曲或强烈震荡;安装时,一定要保证阀件或管路的清洁。(2)尽量不使用或少使用高粘度
12、的流动相。(3)在满足灵敏度的情况下,尽可能使用小进样量。如果样品比较“脏”,要进行净化或提纯处理。,柱温控制,柱温箱的作用:1、保留时间精确再现2、提高分离效率3、对高分子化合物或黏度大的样品,分析时柱温必须高于室温。4、对一些具有生物活性的生物分子,要求低的柱温,系统平衡,1.除上所述外,流动相配制时还需注意什么?2.流动相冲洗多长时间平衡?如何平衡?3.有表面活性剂时小流速过夜,再到规定流速30min。4.基线什么情况下才算平衡?,配制样品和对照品溶液,2配制:溶剂;容器:塑料容器常含有高沸点的增塑剂,可能释放到样品液中造成污染,而且还会吸留某些药物,引起分析误差。某些药物特别是碱性药物
13、会被玻璃容器表面吸附,影响样品中药物的定量回收。3 对照品称量问题,预试,预试目的n,R是否符合要求;保留时间是否合适调节色谱条件流动相组成流速柱温柱子,因柱效是柱中流动相线性流速的函数,使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱,要追求最佳柱效,最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱,流速一般选择1mlmin,对于内径为4.0mm柱,流速0.8mlmin为佳。 当选用最佳流速时,分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时,可适当增加甲醇或乙腈的含量)。,流速和柱温均可适当改变,以适应测定的需要。如含量测定时,可适当加大流速和提高柱温;改变
14、柱温和流速降低均可提高分离效果。,第一次测定时,应先将空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各进一针,并尽量收集较长时间的图谱(如30分钟以上),以便确定样品中被分析组分峰的位置、分离度、理论板数及是否还有杂质峰在较长时间内才洗脱出来,确定是否会影响主峰的测定。,4进样量:药品标准中常标明注入10ul而目前多数HPLC系统采用定量环(10ul、20ul和50ul),因此应注意进样量是否一致。(可改变样液浓度),系统适应性试验,含量测定对照品2份,样品2 份;有关物质,对照品一份,样品一份。每份对照品进样三次,计算RSD%。系统适应性符合要求后,再进样。或者一份对照品先进5针,计算RSD%符合要求,实
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