药典常用定量分析方法概述课件.ppt

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1、,盐城卫生职业技术学院,第四章 药典中常用定量分析方法概述Chapter 4 Assay,药物分析技术Technology of Pharmaceutical Analysis,学习目标,在回顾总结常见定量分析方法的基础上，介绍了常见定量分析方法在中国药典现行版中的应用，通过本章的学习，为理解好掌握后面药物的含量测定打下坚实基础。,重量分析法 酸碱滴定(非水酸碱滴定法) 配位滴定 容量分析法 沉淀滴定 分 氧化还原滴定 纸色谱PC 析 电化学分析法 平面色谱 化 经典色谱 薄层色谱TLC 学 色谱分析 柱色谱法(CC) 气相色谱法(GC) 现代色谱 *高效液相色谱法(HPLC) 高效毛细管电泳

2、法(HPCE) 紫外可见分光光度法(UVVis) 红外分光光度法IR 原子吸收分光光度法(AAS) 光谱分析 原子发射分光光度法(AES) 或波谱分析 荧光分析法(Fluor) 核磁共振法(NMR) 质谱法(MS),电导法,电位法,伏安法,电化学分析法,电解法,极谱法,续前,按任务分 定性分析 定量分析 结构分析,：鉴定组成：测定含量：研究结构,按对象分 无机分析有机分析,：鉴定组成和测定含量：官能团的分析和结构鉴定,按测定原理分 化学分析仪器分析,：重量分析，滴定分析：光学分析，电分析，色谱分析 NMR，MS，电子显微镜，x-射线分析,知识要求,掌握常见定量分析方法的基本原理，在药物分析中的

3、测定方法及分析结果的计算。熟悉常见定量分析方法在使用中的注意事项。了解其他定量分析方法及高效液相色谱仪、紫外-可见分光光度计等仪器的结构。,能力要求,熟练应用常见定量分析技术对药物进行定量分析。学会使用定量分析仪器并能对分析数据进行处理。,Ch4-1 化学分析法,重量分析法酸碱滴定法氧化还原滴定法非水溶液滴定法沉淀滴定法配位滴定法,Ch4-1-1 重量分析法,通过称量被测组分的质量来确定被测组分百分含量的分析方法,分类： 挥发法 萃取法 沉淀法,特点： 准确度高， 费时，繁琐， 不适合微量组分,Ch4-1-2 酸碱滴定法,容量分析法（滴定分析法）：将一种已知准确浓度溶液（滴定液）滴加到待测物质

4、的溶液中，直到化学反应按计量关系完全作用为止，然后根据所用滴定液的浓度和体积计算出待测物质含量的一种分析方法。酸碱滴定法（中和法）：以酸、碱中和反应为基础的滴定分析法。以酸（碱）性滴定液滴定到被测物质，以酸碱指示液或仪器指示终点，根据酸（碱）滴定液的浓度好消耗的体积，计算出被测物质的含量。,酸碱的定义,电离理论电子理论质子理论,应用,直接滴定法： Ca Ka1 10-8 的弱酸 Cb Kb1 10-8 的弱碱剩余滴定法,非水溶液滴定法non-aqueous titration method,非水溶液酸碱滴定法是以非水溶剂作为滴定介质，不仅可增大有机物的溶解度，还可改变溶液的酸碱性，克服在水溶液

5、中滴定的困难，从而扩大酸碱滴定的应用范围。,酸碱滴定一般是在水溶液中进行，以水为溶剂既价廉又安全，但是也会受到一定的局限性。如: 弱酸或弱碱在水溶液中没有明显的滴定突跃； 有机酸或碱在水中溶解度较小； 还有一些多元酸或多元碱，混合酸（碱），由于它们的离解常数较接近，在水中不能分步或分别滴定。,（1）非水酸量法non-aqueous acidimetry 滴定液：甲醇钠的苯-甲醇溶液。 指示剂：邻硝基苯胺。 溶剂：二甲基甲酰胺。（2）非水碱量法non-aqueous alkalimetry 滴定液：高氯酸二氧六环溶液 指示剂：甲基红 结晶紫 溶剂：冰醋酸 醋酐,Ch4-1-3 氧化还原滴定法,以

6、氧化还原反应为基础的滴定分析方法。,实质：电子的转移特点： 1）机理复杂、多步反应 2）有的程度虽高但速度缓慢 3）有的伴有副反应而无明确计量关系分类： 碘量法、高锰酸钾法、重铬酸钾法、 亚硝酸钠法、溴量法、铈量法 应用：广泛，直接或间接测定无机物、有机物,（一）碘量法*,利用I2的氧化性和I-的还原性建立的滴定分析方法,注：pH 9 时，不受酸度影响，应用范围更为广泛,电对反应 I2 + 2e 2I-,I2 + I - I3- （助溶）,I3- + 2e 3 I-,（一）直接碘量法: 利用I2的弱氧化性质滴定还原物质,测定物：具有还原性物质,可测：S2-，Sn()，S2O32-，SO32-酸

7、度要求：弱酸性，中性，或弱碱性(pH小于9)强酸性介质：I-发生氧化导致终点拖后； 淀粉水解成糊精导致终点不敏锐 强碱性介质：I2发生歧化反应,3I2 + 6OH- 5I- + IO3- + 3H2O（歧化反应）,4I-+O2 + 4H+ 2I2 + 2H2O（氧化反应）,（二）间接碘量法： 利用I-的中等强度还原性滴定氧化性物质,测定物：具有氧化性物质,可测：MnO4-，Cr2O7-，CrO4-，AsO43-，BrO3-， IO3-，H2O2，CLO-，Cu2+酸度要求：中性或弱酸性强酸性介质：S2O32-发生分解导致终点提前； I-发生氧化导致终点拖后碱性介质： I-与S2O32-发生副反

8、应，无计量关系,S2O32- + 2H+ SO2 + S+ H2O（分解）,4 I2 + S2O32- + 10 OH- 8I- + 2SO42-+5H2O,（三）碘量法误差的主要来源,1碘的挥发预防： 1）过量加入KI助溶，防止挥发 增大浓度，提高速度2）溶液温度勿高3）碘量瓶中进行反应（磨口塞，封水）4）滴定中勿过分振摇,2碘离子的氧化（酸性条件下）预防：1）控制溶液酸度（勿高）2）避免光照（暗处放置）3）I2完全析出后立即滴定4）除去催化性杂质（NO3-，NO，Cu2+）,（四）标准溶液的配制与标定,1NaS2O3溶液,A配制：不稳定原因 a水中溶解的CO2易使NaS2O3分解 S2O3

9、2- + CO2 + H2O HSO3- + HCO3-+ S b空气氧化：2S2O32-+ O2 SO42- + S c水中微生物作用： S2O32- Na2SO3 + S配制方法：煮沸冷却水，加入NaCO3使 pH=910， 放置78天，过滤,B标定,续前,Cr2O72-+ 6I- （过量）+ 14H+ 2Cr3+ 3I2 + 7H2O （酸度高） I2 + 2S2O32- 2I-+ S4O62- （加水稀释弱酸性）,I2 + 2S2O32- 2I-+ S4O62- （加水稀释弱酸性）,K2CrO7基准物标定法 I2标液比较法,续前,2碘标准溶液,A配制: 避光，防止I-I2（注：不可用分

10、析天平称）B标定：As2O3基准物质标定法NaS2O3标准溶液比较法,As2O3 + 6OH - 2AsO33- + 3H2OAsO33- + I2 + 2H2O H3AsO4 + 2 I - + H+,（五）淀粉指示剂,要求：室温；弱酸性；新鲜配制 加入时间： 直接碘量法滴定前加入（终点：无色深蓝色） 间接碘量法近终点加入（终点：深蓝色消失）变色原理：,注：间接碘量法中淀粉指示剂过早加入，强烈吸附I2， 造成终点拖后,I2（过量）+ I- I3- （与淀粉形成深蓝色配合物）,（六）应用与示例,1直接碘量法：指示剂加入时间：滴定前加入终点：无色深蓝色例：Vc的测定,2间接碘量法指示剂加入时间：

11、近终点加入终点：深蓝色消失1）剩余碘量法(返滴定法)例：葡萄糖的测定2）置换碘量法例：CuSO4的含量测定,剩余碘量法测葡萄糖的含量,注：无须知道CI2,葡萄糖 + I2（定过量） 葡萄糖酸盐 I2（剩余）+ 2Na2S2O3 2 NaI + Na2S4O6,置换碘量法测定CuSO4的含量,注：CuI易水解，故以HAc为介质CuI强烈吸附I2造成终点提前，滴定时应用力振摇 或加入KSCN转化CuI沉淀为CuSCN，同时释放I2,2Cu2+ + 4I- （过量） 2CuI + I2 I2 + 2S2O32- 2I- + S4O62-,Ch4-1-5 沉淀滴定法,通过本章的学习，能熟练运用铬酸钾指

12、示剂法、铁铵矾指示剂法、吸附指示剂法和电位滴定法的原理测定难溶性银盐化合物的含量。这为后期进行药物分析课程的学习奠定基础。,吸附指示剂法（Fayans法，法扬司法 ）,吸附指示剂法：利用沉淀对有机染料吸附而改变颜色 来指示终点的方法吸附指示剂：一种有色有机染料，被带电沉淀胶粒吸 附时因结构改变而导致颜色变化,原理：,SP前： HFL H+ + FL- （黄绿色） AgCL:CL- - - - - 吸附过量CL-SP时：大量AgCL:Ag+:FL-（淡红色）- - -双电层吸附,滴定条件及注意事项 a）控制溶液酸度，保证HFL充分解离：pHpKa 例：荧光黄pKa 7.0选pH 710 曙红pK

13、a2.0 选pH 2 二氯荧光黄pKa 4.0选pH 410 b）防止沉淀凝聚 措施加入糊精，保护胶体 c）卤化银胶体对指示剂的吸附能力 对被测离子的吸附能力( 反之终点提前 ，差别过大终点拖后) 吸附顺序：I-SCN-Br -曙红CL-荧光黄 例： 测CL荧光黄 测Br曙红,D避免阳光直射E被测物浓度应足够大F被测阴离子阳离子指示剂 被测阳离子阴离子指示剂,适用范围： 可直接测定CL-，Br-，I-，SCN-和Ag +,电位滴定法,原理：是一种容量分析中确定终点或选择、核对指示剂变色域的方法。 应用标准溶液滴定待测物溶液过程中,借助指示电极参比电极和电位计来监测滴定时电极电位的变化率, 发生

14、“突跃”的最大点就是滴定的终点,以替代一般指示剂用变色来指示终点的方法。,应用,酸碱滴定法：PHV（含非水）沉淀滴定法：PAgV 络合滴定法：PMV氧化还原滴定法：EV,2.终点指示方法,学习目的,Ch4-1-6 配位滴定法,学习目标知识目标 掌握EDTA的性质和与金属离子配位反应的特点；金属指示剂的变色原理、具备条件和常用金属指示剂；EDTA滴定液的配制和标定。 熟悉影响配位反应平衡的因素；配位滴定酸度条件的选择及配位滴定法在药物分析中的应用。 了解副反应和副反应系数及条件稳定常数的意义。能力目标 熟练应用掌握EDTA滴定液的配制、标定和直接测定金属离子的含量的操作技能和计算。 学会用返滴定

15、法测定铝盐的操作技术和计算。,氮测定法,凯氏定氮法药物分析 杜马氏法元素定量分析 范斯莱克法生化分析 （氨基氮测定）,1、原理 含氮供试品与浓硫酸共热，供试品中所含氮转变成氨，并与硫酸结合为硫酸氢铵和硫酸铵，用氢氧化钠碱化后，释出氨，随水蒸气馏出，用硼酸溶液或定量的酸吸收后，用标准酸液或标准碱液滴定，用空白试验校正。,凯氏定氮法分为3个步骤,(1) 消解 (凯氏烧瓶中进行) 将样品、Con.H2SO4、K2SO4、CuSO4放入凯氏烧瓶中一起加热，有机含N化合物中的N全部转变成NH3并以铵盐的形式固定(NH4)2SO4、NH4HSO4。,H2SO4：氧化剂和炭化剂。 SO2和SO3 消解一般在

16、通风橱中进行,K2SO4：提高H2SO4沸点 缩短消解时间,CuSO4：催化剂，使消解速度加快,消解产物：(NH4)2SO4、NH4HSO4,(2) 蒸馏与吸收,用40%的NaOH溶液水蒸气蒸馏,(NH4)2SO4+2NaOHNa2SO4+2NH3+2H2ONH4HSO4+NaOHNaHSO4+NH3+H2O,(3) 测定, 直接滴定法,吸收液：2%硼酸溶液滴定液：0.005mol/L H2SO4液每1ml的0.005mol/L H2SO4液=0.1401mg的N指示剂：甲基红-溴甲酚绿混合指示剂终点颜色：灰紫色NH3+H3BO3NH3.H3BO32NH3.H3BO3+H2SO4(NH4)2S

17、O4+2H3BO3, 剩余滴定法,用标准盐酸或硫酸作吸收液。将蒸馏出来的NH3吸收于定过量的标准酸溶液中，过量的酸用标准碱溶液滴定。,永停滴定法,1. 原 理,测量时, 把两个相同的铂电极插入滴定溶液中,在两个电极间外加小电压（10-200mv）, 进行滴定，根据电流变化情况确定终点。,可逆电对：I2/I 两个铂电极间外加一个小电压, 接正端的电极发生氧化反应：2II22e,接负端的电极发生还原反应：I22e2I ,即发生电解。 只有两个电极上都发生反应,他们之间才会有电流通过。 I2/ I,在溶液中与双铂电极组成电池 ,给一个很小的外加电压就能产生电解,有电流通过,称为可逆电对。,可逆电对与

18、不可逆电对,电对的氧化态和还原态浓度相等时电流最大;不相等时电流的大小决定于浓度低的那个氧化态和还原态的浓度。,不可逆电对：S4O62与S2O32(S4O62/ S2O32),三 永停滴定法,永停滴定法: 利用上述现象确定滴定终点的方法。,2. 指示终点的方法,滴定剂属可逆电对,被测物属不可逆电对 如：I2滴定Na2S2O3,终点前：a.溶液中只有S4O62/ S2O32电对,虽有外加电压, 也不能产生电解。b.溶液中虽有I,阳极上有I氧化成I2的可能性, 无I2 ,故电解反应同样不能发生。所以,终点前电流计指针一直在0电流位置上不动。,第二节 药典常用分析方法,三 永停滴定法,终点时：达到终

19、点有稍过量的I2,溶液中有I2/ I可逆电对,电极上产生电解反应,有电流通过,电流计指针开始偏转并不再返回0,指示滴定终点到达。,终点后：随I2浓度的逐渐增加,电解浓度逐渐增大。,滴定剂为不可逆电对,被测物为可逆电对如Na2S2O3滴定I2,终点前：即存在I2/ I的可逆电对,有电流通过,滴定越接近终点,I2的浓度逐渐变小, 电流逐渐变小。,终点时：由于I2浓度为0, 电解电流变为0,指针突然下降并停留在0电流的位置保持不动,指示滴定终点到达。,终点后：溶液中只有S4O62/ S2O32的不可逆电对,无电解发生,电流降到最低点并不在变化,滴定剂与被滴定剂均为可逆电对 如Ce4滴定Fe2,滴定前

20、：溶液中只有Fe2, 无Fe3存在,阴极上不可能有还原反应, 无电解反应,无电流通过。,滴定时：当Ce4Fe3 Fe3/ Fe2可逆 电流不断; 当【Fe3】=【Fe2】时,电流达到最大值, 继续加入Ce4 , 【Fe2】 ,电流。,终点时：电流降至最低点。 阳极【O】：Fe2Fe3e 阴极【H】：Fe3eFe2,第二节 药典常用分析方法,三 永停滴定法,终点后：Ce4过量，溶液中有Ce4/ Ce2可逆电对，【Ce4】不断 电流又开始上升。 阳极【O】：Ce2Ce42e 阴极【H】：Ce42eCe2,第二节 药典常用分析方法,三 永停滴定法,3. 应 用,(1)重氮化滴定法的终点指示,(2)在

21、用Karl Fisher法测定微量水 分时的终点指示（自习）,二、光学分析法及其分类,（一）光学分析法 依据物质发射的电磁辐射或物质与电磁辐射相互 作用而建立起来的各种分析法的统称。,（二）分类： 1光谱法：利用物质与电磁辐射作用时，物质内部 发生量子化能级跃迁而产生的吸收、发射或散射 辐射等电磁辐射的强度随波长变化的定性、定量 分析方法,2非光谱法：利用物质与电磁辐射的相互作用测定 电磁辐射的反射、折射、干涉、衍射和偏振等基 本性质变化的分析方法 分类：折射法、旋光法、比浊法、射线衍射法,3光谱法与非光谱法的区别：,Ch4-2 紫外-可见分光光度法,紫外-可见吸收光谱（Ultraviolet

22、 and Visible Spectroscopy, UV-VIS）统称为电子光谱。 紫外-可见吸收光谱法是利用某些物质的分子吸收200800nm光谱区的辐射来进行分析测定的方法。这种分子吸收光谱产生于价电子和分子轨道上的电子在电子能级间的跃迁，广泛用于有机和无机物质的定性和定量测定。,原理：根据LambertBeer定律 A = E CLE：吸收系数 C:单位浓度 L:液层厚度,吸收系数有两种：,摩尔吸收系数（）：指在一定波长下,溶液浓度为1mol/L厚度为1时的吸收度.,百分吸收系数（ ）：指在一定波长下,溶液浓度为1%（W/V）厚度为1的吸收度.,与E关系E= 吸收物质的摩尔质量（分子量

23、）强吸收度：=104105 弱吸收度：102中强吸收：=102104,(2) 应 用,定性鉴别：,max及或E Amax /Amin 与标准品溶液的吸收光谱比较, 纯度检查：,在某波长，药物无吸收，而所含杂质有吸收，可检查某杂质的限度。,如：肾上腺素中肾上腺酮的检查,肾上腺素 2mg/mL 的0.05mol/L HCl液,310nm处测得的A0.05,肾上腺铜的E=435 ,求其限量, 含量测定,a.单组分的测定方法,b. 两组分测定方法： 计算分光光度法,2.荧光分析法, 原理：物质在受到激发光（ex）照射后产生了较长波长的荧光（em）溶液的荧光强度和溶液的吸光程度、溶液中荧光物质的荧光效率

24、等因素有关。,F：荧光强度 K：荧光效率I0：入射光强度 C：荧光物质的浓度E：吸收系数 l：液层的厚度, 应用, 鉴别：ex和em 荧光激发光谱, 发射光谱, 含量测定：,a.标准曲线法,b.比例法（对照法）, 说明,a. 药物本身无荧光：加衍生试剂（荧胺、邻苯二甲醛（OPA）丹酰氯）,使成荧光物质后测定。,b.荧光测定影响因素多：溶剂、pH值、散射光、荧光物质浓度故做空白试验，不易测得绝对荧光强度。,3.红外分光光度法原理：由分子的振动及转动能级跃迁而引起的。一束具有连续波长的红外光通过物质时，当物质分子中某个基团的振动频率和红外光的频率一致时，分子便吸收能量并发生跃迁。根据分子吸收红外光

25、的情况进行分析的方法为红外分光光度法.,应用,已知化合物的鉴定： a.同时测定样品和标准品吸收光谱 b.样品图谱与标准品的吸收光谱比较,未知化合物的研究,有机化合物官能团推定结构细节,如共轭结构、脂环、芳环及其取代情况等推定分子骨架,功能团位置和分子的主体结构.,药物的纯度检查杂质有自身吸收峰, 使纯物质红外光谱吸收峰增多,通过图谱可推断含有某杂质.,含量测定,选择一个预测成分的特征吸收峰,此吸收峰不被其他成分干扰即可.定量时多采用内标法,依对照品比较法公式计算含量.,红外吸收光谱特征性较强常用于物质的鉴定时比UV法更可靠.,操作麻烦测定的准确度及精密度, 不如UV法, 用作含量测定的较少.,

26、四 光谱法, TLC,原理：吸附剂对不同化合物的吸附力不同,展开剂对各组分的溶解解吸能力不同,使待分离的组分Rf值不同,不同物质最后形成相互分离的斑点.,应用定性分析 样品、对照品在同一薄层板上点样展开 要求Rf 值斑点颜色一致.,杂质检查,对照品对照法高低浓度对照法,杂质斑点的数目及颜色不得超过规定.,第二节 药典常用分析方法,五 色谱法, 定量分析,c.采用薄层扫描仪直接在薄层板上测定,a.目视法,b.浦集斑点洗脱后测定,2.气相色谱法（GC）,原理 样品中各组分在固定相与载气间分配,由于各组分的分配系数不同而分离,一般要求（ChP）载气：N2色谱柱：填充柱 毛细管柱进样口温度：高于柱温3

27、0-50进样量：不大于数微升检测器：常用氢焰离子化检测器（FID） 检测温度一般高于柱温,不得低于 100,以免水气凝结,常用250-350.,系统适用性试验（ChP）,色谱柱的理论板数（n）, 分离度（R）, 拖尾因子,重复性 取各品种项下的对照溶液,连续进样5次,除另有规定外,其峰面积测定值的相对标准差应2.0%,第二节 药典常用分析方法,五 色谱法,应用定性：根据tR,含量测定：a内标法 b外标法,杂质检查,a 峰面积归一化法b 主成分自身对照法c 内标法测定供试品中杂质的总量限度d 内标法加校正因子测定供试品中某个 杂质含量e 外标法测定供试品中某个杂质的含量, HPLC,分类： 液固

28、吸附柱色谱法 液液分配柱色谱法 离子交换柱色谱法 分子排阻塞谱法,第二节 药典常用分析方法,五 色谱法, 液-液分配柱色谱法,原理:根据物质在两相不相混容的溶剂间溶解度不同,而具有不同分配系数,从而达到分离。,第二节 药典常用分析方法,五 色谱法,常用反相液-液色谱法,流动相：水、甲醇-水、乙腈-水固定相：十八烷基硅烷键合硅胶 （ODS或C8）,第二节 药典常用分析方法,五 色谱法,系统适用性试验应用:鉴别检查含量测定同GC,第四章药物定量分析与分析方法验证第一节 定量分析样品的前处理方法一、概述 含金属或卤素的药物，如葡萄糖酸锑钠，硬脂酸镁、碘苯酯、磺溴酞钠等，在分析前需要经过不同方法处理之

29、后，方可进行测定。处理方法因金属或卤素在分子中结合的牢固程度而异，如：有机卤素药物，所含卤素原子均直接与碳原子相连，但不同药物中卤素所处的位置不同，则与碳原子结合的牢固程度就有差异。如果卤素和芳环相连接，则结合牢固，与脂肪链的碳原子相连接，则结合不牢固；,而含金属的有机药物，有两种情况：一是金属原子不直接与碳原子相连，通常为有机酸及酚的金属盐或配位化合物，称为含金属的有机化合物，其分子结构中的金属原子结合不够牢固，在水溶液中既可离解出金属离子，如有机结构部分不干扰分析时，可在溶液中直接进行其金属的鉴别或含量定；二是金属原子直接与碳原子以共价键相连接，结合状态比较牢，称为有机金属药物，在溶液中其

30、金属一般不能解离成离子状态，应该根据共价键的牢固程度，经适当处理，将其金属转变为适于分析的状态，应该根据共价键的牢固程度，经适当处理，将其金属转变为适于分析的状态（多转变为无机的金属盐或离子），方可进行其金属的鉴别或含量测定。,二、不经有机破坏的分析方法（一） 直接测定法 凡金属原子不直接与碳原子相连的含金属药物或某些C-M（金属原子直接与碳原子相连）键结合不牢固的有机金属药物，在水溶液中可以电离，因而不需有机破坏，可直接选用适当的方法进行测定 。,（二）经水解后测定法 1直接回流后测定法 2用硫酸水解后测定法（三）经氧化还原后测定法 1 碱性还原后测定,2 酸性还原后测定 3 利用药物中可游

31、离的金属离子的氧化性测定含量三、 经有机破坏的分析方法（一） 湿法破坏 1 硝酸-高氯酸法 2 硝酸-硫酸法 3 硫酸-硫酸盐法 4 其它湿法,（二） 干法破坏,（三） 氧瓶燃烧法氧瓶燃烧法（oxygen flask combustion method）系将有机药物放入充满氧气的密闭的燃烧瓶中进行燃烧，并将燃烧所产生的欲测物质吸收于适当的吸收液中，然后根据欲测物质的性质，采用适宜的分析方法进行鉴别、检查或测定含卤素有机药物或含硫、氮、硒等其它元素的有机药物。,本法是快速分解有机物的简单方法，它不需要复杂设备，就能使有机化合物中的待测元素定量分解成离子型。该方法被各国药典所收载。 1 仪器装置

32、燃烧瓶为500ml、1000ml、或2000ml磨口、硬质玻璃锥形瓶，瓶塞应严密、空心、底部熔封铂丝一根（直径为1mm），铂丝下端做成网状或螺旋状，长度约为瓶身长度的23 ，如图,2 称样3 燃烧分解操作法4 吸收液的选择,第二节 定量分析方法的特点,容量分析法光谱分析法 色谱分析法,容量分析法,容量分析法：用已知浓度的标准溶液，滴定一定体积的待测溶液，直到化学反应完全为止，到达终点，根据标准溶液的体积和浓度计算待测物质含量的方法。特点：简便，快速，准确度高，专属性较差（化学原料药分析）,容量分析法,滴定度每1 ml标准滴定液相当待测物的mg数。滴定度计算,容量分析法,直接滴定法的结果计算,V

33、为滴定液的消耗体积(ml)；T为滴定度；W为供试品的称样量(g)；103为质量换算因数(1mg等于103g)；F为滴定液的浓度校正因数。,光谱分析法,光谱分析法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内的吸光度或发光强度，对该物质进行定性、定量分析的方法。 单色光穿过吸光物质溶液时，在一定的浓度范围内，被该物质吸收的光量与该物质溶液的浓度和液层的厚度（光路长度）成正比。其关系式如下：,紫外-可见分光光度法,紫外-可见分光光度法用于药物含量测定的方法有三种：1 对照品比较法 分别配制供试品和对照品溶液，在规定波长处分别测定吸光度，按下式计算供试品溶液中被测组分的浓度。CX=（AX/AR）CR

34、 2 吸收系数法 按各品种项下方法，配制供试品溶液，在规定波长处测定其吸光度，再根据吸收系数按下式计算供试品溶液的浓度。,紫外-可见分光光度法,3 比色法 供试品本身在紫外-可见区没有强吸收，或在紫外区虽有吸收但为了避免干扰或提高灵敏度，可加入适当的显色剂显色后测定用比色法测定时，由于显色时影响的因素较多，应取供试品与对照品同时操作。除另有规定外，比色法所用的空白系指用同体积的溶剂代替对照品或供试品溶液，然后依次加入等量的试剂，并用同样方法处理，在规定的波长处测定吸光度后，按对照品比较法公式计算供试品溶液的浓度。,色谱法,色谱法（chromatography）是利用混合物不同组分在两相中具有不

35、同的分配系数（或吸附系数、渗透性等），当两相作相对运动时，不同组分在两相中进行多次反复分配实现分离后，通过检测器得以检测，进行定性定量分析。,色谱系统适用性试验,系统适用性试验指用规定的对照品对色谱系统进行试验和调整，应达到的要求。系统适用性试验通常包括最小理论板数、分离度、重复性和拖尾因子。（一）色谱柱的理论板数（n）在选定的色谱条件下，测定主成分或内标物色谱峰的保留时间（tR）和半峰宽（W1/2），按塔板理论公式计算色谱柱的理论板数。如果测得的理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱填充的优劣等），使理论板数达到要求。,（二）分离度（R）定

36、量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。除另有规定外，分离度应大于1.5。（三）重复性取各品种项下的对照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%。,（四）拖尾因子为保证测量精度，特别当采用峰高法测量时，应检查待测峰的拖尾因子是否符合各种项下的规定。拖尾因子（T）以下式计算：,除另有规定外，T 应在0.951.05之间。,第三节 药品分析方法的验证,一、目的,证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求，方法验证过程和结果均应记载在药品标准起草和修订说明中。,二、用途,1、药品质量标准起草时，分析方法需经验证。,2、药物合成方法

37、变更、制剂的组分变更、原分析方法进行修订时，分析方法需经验证。,三、需验证的分析项目,1. 鉴别试验；2. 杂质定量或限度检查；3. 原料或制剂中有效成分含量测定；4. 制剂中其它成分（降解产物、防腐剂等）的测定；5. 溶出度、释放度等功能检查中的溶出量等的测试方法。,验证内容有：准确度、精密度（重复性、中间精密度和重现性）、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性,四、验证内容,（一） 准确度（accuracy） 准确度是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，用百分回收率表示。,原料药可用已知纯度的对照品或样品进行测定，或用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较。

38、,制剂可用含己知量被测物的各组分混合物进行测定，即采用在空白辅料中加入原料药对照品的方法。 如不能得到制剂的全部组分，可向制剂中加入已知量的被测物进行测定。,回收试验空白+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M,加样回收试验 已准确测定药物含量P的真实样品+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M,数据要求 规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品各测三次。,（二）精密度（precision） 精密度是指在规定条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。用偏差（d）、标准偏差(SD)、相对标准偏差(RSD)（变异系数，CV）表示。,偏差（d）：测

39、量值与平均值之差,标准（偏）差（SD或S）,相对标准（偏）差（RSD），也称变异系数（CV）,1. 重复性 在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度；在规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品各测三次或把被测物浓度当作100%，至少测6次进行评价。,2. 中间精密度 同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备所得结果的精密度。考察随机变动因素的影响。变动因素为不同日期、不同分析人员、不同设备,3. 重现性 不同实验室，不同分析人员测定结果的精密度。当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验。如建立药典分析方法时通过协同检验得出重现性结果，协同检验的过程、重现

40、性结果均应记载在起草说明中。,（三） 检测限（limit of detection， LOD） 检测限系指试样中被测物能被检测出的最低量。是限度试验参数，无需定量测定。,1非仪器分析目视法 用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。,2信噪比法 用于能显示基线噪音的分析方法（仪器分析方法），是把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。一般以信噪比（S/N）31或21时的相应浓度或注入仪器的量确定检测限。,3数据要求 应附测试图谱，说明测试过程和检测限结果。,（四）定量限（1imit of quantitation，LOQ） 指样

41、品中被测物能被定量测定的最低量，结果应具有一定准确度和精密度。常用%、ppm、ppb表示。,常用信噪比法确定定量限，一般以信噪比（S/N）为101时相应的浓度或注入仪器的量进行确定，也可用仪器所测空白背景响应标准差（SD）的10倍为估计值，再经试验确定。,（五）专属性（specificity） 指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性，能反映该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力。是指该法用于复杂样品分析时相互干扰程度的度量。,（六） 线性 在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。 数据要求：应列出回归方程、相关系数和

42、线性图。,（七）范围 指达到一定精密度、准确度和线性的条件下，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。,（八） 耐用性 指测定条件稍有变动时，结果不受影响的承受程度，为常规检验提供依据。是衡量实验室和工作人员之间在正常情况下实验结果重现性的尺度。,2. 杂质的限量检查除专属性、检测限、耐用性外，其它都不要求。杂质的定量测定除检测限外，其它都要求。,3. 含量测定及溶出量测定除检测限、定量限外，其它都要求。,（九）应用 1. 鉴别试验除专属性、耐用性外，其它都不要求。,需验证的项目和验证内容,（十）各种含量测定方法对效能指标的要求 1. 容量分析法：用原料药精制品(含量99.5)或对照品考察方法的精

43、密度，相对标准差一般应不大于0.2；进行回收率试验。回收率一般在99.7100.3之间。,2. UV法：用适当浓度的精制品进行测定，其RSD一般不大于1。制剂的测定，回收率一般应在98102之间。,线性：吸光度A一般在0.20.7，浓度点n5。用浓度c对A作线性回归处理，得一直线方程，r应大于0.999(n5)，方程的截距应近于零。,3. HPLC法：要求RSD2，回收率98102之间。 线性范围：用精制品配制一系列标准溶液，浓度点n应为57，用浓度c对峰高h或被测物的响应值之比进行回归处理，建立回归方程，r应大于0.999，截距应趋于零。,专属性：要考查辅料、有关物质或降解产物对主药的色谱峰

44、是否有干扰，如有干扰应设法排除,生物样品分析时，常用RSD表示精密度，并可细分为批内（或日内）精密度及批间（或日间）精密度。,批内精密度：是同一次测定的精密度。所得RSD应争取达到5以内，但不能超10。,批间精密度：是不同次测定的精密度。所得RSD应控制在15以内。,附录药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则规定一般RSD应小于15%，在LOQ附近RSD应小于20%。,第二节 定量分析方法特点 一、 容量分析法（一）容量分析法的特点（二）容量分析法的计算问题 1滴定度 2滴定度（T）的计算 3百分含量计算 （1） 直接滴定法,（2）回滴定法（剩余滴定法 ）,二、光谱分析法（一）紫外-可

45、见分光光度法 1特点 紫外-可见分光光度法是根据物质分子对波长为200nm760nm 这一范围的电磁波的吸收特性所建立起来的光谱分析方法。主要特点如下： （1）灵敏度高，可达10-4g/ml10-7g/ml 。 （2）准确度高，相对误差为2% 5%。 （3）仪器价格较低廉，操作简单，易于普及。 2郎伯-比耳定律 3仪器校正和检定 4对溶剂的要求 5测定法,（二）荧光分析法 1特点 2荧光分析仪 3含量测定,三、 色谱分析法 色谱分析法（又称层析法）根据其分离原理可分为：吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱与排阻色谱等。又可根据分离方法分为：纸色谱、薄层色谱法、柱色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等

46、。（一） 高效液相色谱法 1对仪器的一般要求系统适用性实验 （1）色谱柱的理论塔板数（n） （2）分离度,.测定法 （1）内标法加校正因子测定供试品中主成分含量：,（2）外标法测定供试品中主成分含量： 外标法可分为标准曲线法和外标一点法。 1）标准曲线法： 2）外标一点法：,(二) 气相色谱法 1.对仪器的一般要求 2.系统适应性实验 3.测定法,第三节药品质量标准分析方法验证 验证内容有：准确度、精密度（包括重复性、中间精密度和重现性）、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性。 一、 准确度 （一）含量测定的准确度 准确度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般以回收率（%

47、）表示。准确度应在规定的范围内建立。回收率的计算可按下式：,(二) 数据要求,二 、 精密度 精密度系指在规定的测定条件下，同一个均匀样品，经过多次取样测定所得的结果之间的接近程度。(一)精密度表示方法 1.偏差(deviation，d ) .标准偏差(standard deviation ，SD ),3. 相对标准偏差(relative standard deviation,RSD ),也称变异系数(coefficient of varation,CV ),(二) 重复性、中间精密度及重现性 1. 重复性 在相同的条件下，由一个分析人员测定所得结果的 精密度称为重复性。2中间精密度 同一个实

48、验室，不同时间由不同分析人员用不 同设备测定结果的精密度，称为中间精密度。3重现性 在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度，称为重现性。 (三) 数据要求,三、专属性 专属性系指在其他成分（如杂质、降解产物、辅料等）可能存在下，采用的方能准确测定出被测物的特性。(一)鉴别反应(二) 含量测定和杂质测定四、 检测限 检测限（limit of detection，LOD）是试样中被测物能被检测出的最低浓度或量。LOD是一种限度检验效能指标，即反映方法与仪器的灵敏度和噪音的大小，也表明样品经处理后空白（本底）值的高低。它无需定量测定，只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可。根据所采用的方法来确定

49、检测限。,(一)常用的方法1. 非仪器分析目视法2. 仪器分析时的测定法（二）数据要求五、定量限 定量限（limit of quantitation ，LOQ）是指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应具一定准确度和精密度。杂质和降解产物用定量测定方法研究时，应确定定量限。,六、线性 线性 系指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。,七、范围 范围是指能到达一定精密度、准确度和线性、测试方法适用的高低限浓度或量的区间。八、耐用性 耐用性 系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为常规检验提供依据。 1用于鉴别试验 2用于原料药中杂质测定或制剂中

50、的降解产物测定的方法 3用于原料药中主成分或制剂中有效组分含量测定及溶出度测定,第四节 生物样品分析方法的基本要求一、常用样品的种类、采集和储贮藏 生物样品包括各种体液和组织，但实际上最常用的是比较容易得到的血液（血浆、血清、全血）尿液、唾液。(一) 血样 血浆（plasma）和血清（serum）是最常用的生物样品。(二) 唾液(三) 尿液二、生物样品分析前处理技术(一) 去除蛋白质,1加入与水相混溶的有机溶剂2加入中性盐3加入强酸4加入含锌盐及铜盐的沉淀剂5酶解法（二）缀合物的水解（三）分离、纯化与浓集1液-液提取法(liquid-liquid extraction ,LLE)2液-固提取法