转基因检测国家局培训教材(基因成分检测)课件.ppt

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1、,食品中转基因成分、真伪鉴别和过敏原及其成分检测,质检系统实验室技术能力培训教材,主要内容,食品中转基因成分检测食品中过敏原及其成分检测食品真伪鉴别（动物源性成分检测）,第一部分 食品中转基因成分检测,一、全球转基因作物种植情况和有关法规介绍,全球转基因作物种植面积（1996-2009）,2009年不同国家转基因作物种植面积,1996年到2009年美国转基因作物的种植百分率,巴西、加拿大、中国、印度转基因作物占作物种植面积的比例,9,种植国家不断增多,9,商业化种植：美洲、亚洲、大洋洲、欧洲、非洲25国,10,10,转基因作物种植比例,2009年,喷施草甘膦前,喷施草甘膦后,抗草甘膦油菜RT7

2、3,非转基因油菜,中国培育的转基因抗虫水稻Bt63介绍,Bt63,母本对照,转基因产品标识制度,2001年5月23日，国务院发布了第304号令农业转基因生物安全管理条例,农业转基因生物安全管理条例,标识的标注方法转基因动植物（种子、种畜禽、水产苗木）和微生物，直接标注“转基因”。 转基因农产品的直接加工品,标准为“转基因XX加工品（制成品）”或“加工原料为转基因XX” 用农业转基因生物或用含有农业转基因生物成份的产品加工制成的产品，但最终销售产品中已不再含有或检测不出转基因成分的产品标注为“本产品为转基因XX加工制成， 但本产品中已不再含有转基因成分”或“本产品加工原料中、 有转基因XX，但本

3、产品中已经不再含有转基因成分”,农业转基因生物标识管理办法2002年颁布实施,第一批标识管理的转基因生物（5大类17种）,转基因检测国家标准,二、以核酸为基础的检测方法介绍,主要内容,1.核酸提取纯化方法2.定性检测方法3.定量检测方法4.可能产生误差的原因及消除5.案例分析,1.核酸提取纯化方法,使用标准方法,GB/T 19495.3-2004转基因产品检测核酸提取纯化方法,A 酚-氯仿法提取DNAB PVP法提取DNA （Polyvinylpyrrolidone,聚乙烯吡咯烷酮）C CTAB法提取DNA （Cetyltrimethyle Ammonium Bromide,十六烷基三乙基溴化

4、铵） D 硅土法提取DNAE 胍-氯仿法提取DNA建议使用商业试剂盒,核酸提取纯化方法,核酸提取纯化方法,酚-氯仿法提取DNA、胍-氯仿法提取DNA 利用酚和胍使蛋白质变性，释放出核酸,同时抑制了DNase的降解作用，保护核酸。 利用氯仿加速有机相与液相分层。 PVP法提取DNA、 CTAB法提取DNA 利用高浓度去垢剂在高温（5565）条件下裂解细胞，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉 淀，得到水相中的核酸。 硅土法提取DNA 利用硅土对核酸的吸附作用，分离核酸。,转基因产品的检测策略 Strategy for GMO Detection,GB/T

5、19495.4-2004 转基因产品检测 核酸定性PCR检测方法,使用标准方法,主要内容,本标准方法规定了转基因产品检测的核酸定性PCR方法，适用于种子、饲料、食品和环境样品中转基因成分的定性检测。从以下五个方面进行介绍： A.方法简介 B.检测目标物 C.检测体系 D.结果判定 E.结果表述,A.方法简介,普通PCR+电泳方法 原理 聚合酶链式反应（PCR）在反应缓冲液中，脱氧核糖核酸、寡核苷酸引物在DNA聚合酶的作用下经循环反应对目标序列进行复制。 PCR产物可用琼脂糖凝胶电泳方法依据DNA分子长度的不同加以分离。,A.方法简介,缺点：1. 普通PCR灵敏度可达到0.1，而实时荧光PCR检

6、测下限可达到0.01。2. 电泳存在EB等致癌物质，需要特殊处理。3. 检测时间长。,B.检测目标物,1物种特异性检测方法 大豆、番茄、玉米、油菜、马铃薯、棉属作物、真核生物18SrRNA、叶绿体多拷贝DNA序列检测方法。2筛选检测方法： CaMV35S启动子、 NOS终止子、 NPTII基因、FMV 35S启动子筛选检测方法。,3结构基因特异性检测方法 抗草甘膦大豆、转基因番茄Zeneca、转基因玉米Bt11、Bt176、T25、转基因马铃薯New Leaf Plus、New Leaf Y结构基因特异性检测方法。4品系特异性检测方法 转基因玉米MON810、抗草甘膦油菜RT73品系特异性检测

7、方法、棉花MON531、华番一号。,C.检测体系,D.结果判定,PCR 检测时应做平行对照，两份平行样品结果应保持一致。如果一个样品结果为阳性而另一个为阴性时，应重新进行检测。可以通过增加PCR反应中DNA的模板量使两份平行样结果一致。 所检测目标片段出现扩增，且PCR产物经过确认，所有对照结果正常，结果判定为阳性，所检测目标片段未出现扩增; 所有对照结果正常，结果判定为阴性。,一般要求实验结果不能用“+/”来表述。阴性结果不能用“不含GMO”（“GMO not present”）来表述。,E.结果表述,阴性结果的表述,测试报告应该包括下列内容：“对于X物种，未检测出转基因成分。根据xxx（即

8、标准参照物质），该方法的检测下限为X %。”英文表述为：“For species X, GMO derived material was not detected.The LOD of the method is X % determined with xxx (identify the reference material).”,测试报告应该包括下列内容：“对于X物种，检测出转基因成分。”英文表述为：“For species X, the presence of GMO derived material was detected.”,阳性结果的表述,3. 核酸定量PCR检测方法,使用标准方法

9、,GB/T 19495.5-2004转基因产品检测 核酸定量PCR检测方法 本标准方法规定了转基因成分核酸定量检测方法，适用于种子、饲料、食品和环境样品中转基因成分的实时荧光PCR定量检测。从以下五个方面进行介绍：,主要内容,A.方法原理简介 B.检测目标物 C.检测体系 D.定量计算 E.结果表述,实时荧光PCR方法：在普通PCR基础上引入标记有荧光基团的寡核苷酸探针，可与目的片段结合，在DNA聚合酶的作用下寡核苷酸降解，荧光释放出来。荧光的积累与PCR产物的形成同步，荧光的强度反映了产物生成的量。通过设置标准物质/分子，绘制出标准曲线，进而可对样品中的目标分子进行定量判断。 优点：1.快速

10、 2.灵敏 3.污染小,A.方法原理简介,实时荧光PCR的原理,R = Reporter FAM or VIC DyesQ = Quencher TAMRA Dye,R,Q,扩增曲线：域值和Ct值,EVENT176玉米中CryIA(b)标准曲线,B.检测目标物,转基因大豆GTS-40-3-2；转基因玉米MON810、Bt176、Bt11及GA21；转基因油菜RT73。,C.检测体系,D.定量计算,E.结果表述,定量检测结果有4种情况，每种检测结果表述如表,4.可能产生误差的原因及消除,试验结果可能受到提取样品DNA、反应体系及条件及试验环境等方面的影响，为保证试验结果的准确性从以下三个方面进行

11、论述： （1）核酸提取的质量控制 （2）定性PCR检测的质量控制 （3）定量PCR检测的质量控制,（1）核酸提取的质量控制对照的设置：每个检测样品设置两个提取平行样。 提取空白对照：以水代替样品，避免化学试剂污染而影响。 提取阴性对照 提取阳性对照DNA检测：可以通过琼脂糖凝胶电泳来检测DNA的质量；用核酸蛋白测定仪来测定DNA浓度，但这不是必须的。要检测内源基因来判断所提取的DNA是否适合PCR扩增。,（2）定性PCR检测的质量控制 PCR检测反应要设置平行实验，两份平行的测试结果应保持一致，否则要重新进行检测。 PCR检测反应要设置试剂空白对照、阳性目标DNA对照、阴性目标DNA对照、提取

12、空白对照。 检测反应完成后，若所有对照结果正常，所检测目标DNA出现扩增，结果判断为阳性，所检测目标DNA未出现扩增，结果判断为阴性。,（3）定量PCR检测的质量控制标准曲线的质量影响度量的不确定性。标准曲线上每个浓度应做3个平行。每批测试实验需要设置对照如：空白对照、阳性对照、阴性对照，以及PCR抑制物对照，所有对照的结果中若有一项不符合者，测试结果应放弃重做实验。每个重复的测试样品测试结果（转基因成分含量）的相对相差大于或等于35%，测试结果应放弃，并应从制备测试样品开始重做试验。应用Passive Reference Dye （ROX）、阳性内对照(IPC) 、标准曲线及重复样品可保证定

13、量PCR检测的质量。,重复样品 定量的结果需要进行统计学处理：平均值和标准偏差。 需要重复实验，每个样品重复3次以上，以满足统计学的要求去除定量误差。,（3）定量PCR检测的质量控制,5.案例分析,案例一 转基因大豆、玉米检测案例二 转基因大米Bt63检测,案例一 转基因大豆、玉米检测,1. 样品处理-碾磨成细粉美国联邦谷物检验署(FGIS) 使用的碾磨机,SPEX 冷冻研磨机系列,防止污染效果好快速超细需要液氮,2. DNA提取定性PCR检测试剂盒，推荐：（1）宝生物工程(大连)有限公司产品 TaKaRa PCR Amplification Kit（2）天根生化科技（北京）有限公司产品（3）

14、Promega 公司产品实时荧光PCR检测试剂盒，推荐：（1）宝生物工程(大连)有限公司产品（2）天根生化科技（北京）有限公司产品（3）AB 公司产品,3、PCR扩增内参照基因: 18S rRNA, Lectin, Zein, IVR, SPS筛选检测:CaMV 35S, Nos, NptII,Bar,FMV35s, Pat 先筛选： CaMV 35S, NOS, NPTII等基因。玉米还要检测Bar,PAT等，视转基因材料的背景情况决定。,阳性样品,阴性样品,Ct 值,如果未检测出，就报告未检出 XXX 基因。 如果检测出以上筛选基因，需再进行品系检测。 品系特异性检测： 大豆：GTS40-

15、3-2, Mon89788, A2704. 玉米：Bt176, Mon810, Bt11, GA21, T25， Mon863, Nk603, Tc1507等。,案例二 转基因大米Bt63检测,出口到欧盟国家按照国家局质检食函200893号关于做好输欧大米及米制品转基因BT63项目检测工作的紧急通知来执行，方法原文来自：,Bt63大米检测引物和探针序列,证书格式,兹证明上述产品已按照欧盟D.MADE的检测方法进行检测，不含有转Bt63基因成分。This is to certify that products described above have been tested according

16、to European Union D.MADE method and free from genetically modified Bt63.,三、以蛋白为基础的检测方法介绍,样品的预处理 取500g以上大豆，粉碎、微孔滤膜过滤。 微孔滤膜孔径为450微米，保证孔径小于450微米的粉末质量占大豆样品质量的90%。,蛋白检测检测方法,GB/T 19495.8-2004 转基因产品检测 蛋白质检测方法,蛋白质抽提流程,酶联免疫吸附法 (ELISA),ELISA实验流程,结果可信度判断的条件,酶联免疫检测方法的技术参数,方法检测的灵敏度为0.1%定量的线性范围0.5%-3%,转基因大豆试纸条检测,GB/T 19495.8-2004转基因产品中Cry1Ab/Ac蛋白的试纸条检测,试纸条方法,适合于田间、仓库现场检测,谢谢大家,