生物化学实验：SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)课件.pptx

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1、,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）Sodium dodecyl sulfate polyacrylamidegel electrophoresis,一. 实验目的,1.学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理 2.掌握垂直板电泳的操作方法,二. 实验原理,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠） 1967年，Shapiro等人首先发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶电泳(聚丙烯酰胺凝胶中主要取决于三种因素：蛋白大小，形状和电荷)系统中加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小？,SDS的作用,SDS is a

2、 strong detergent agent used to denature native proteins to unfolded, individual polypeptides. When a protein mixture is heated to 100 C in presence of SDS, the detergent wraps around the polypeptide backbone. It binds to polypeptides in a constant weight ratio of 1.4 g SDS/g of polypeptide. In this

3、 process, the intrinsic charges of polypeptides becomes negligible when compared to the negative charges contributed by SDS. Thus polypeptides after treatment become rod-like structures possessing a uniform charge density, that is same net negative charge per unit length. The electrophoretic mobilit

4、ies of these proteins will be a linear function of the logarithms of their molecular weights.,当蛋白质的分子量在15,000200,000之间时，样品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。符合如下方程式：lg MW =b m + K 其中，MW 为蛋白质的分子量，m 相对迁移率，b为斜率，K为截距。当条件一定时，b与K均为常数 因此通过已知分子量的蛋白与未知蛋白的比较，就可以得出未知蛋白的分子量,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)按照缓冲液的pH值和凝胶孔径的差异及有无浓缩效应分为连续系统和不

5、连续系统两大类 连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应 不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳,Gel,5%,10%,15%,29,45,66,97,200,29,45,66,97,200,29,45,66,97,200,Ammonium (AP) (N2H8S2O8; MW: 228.2). APS is a source of free radicals and is often used as an ini

6、tiator for gel formation.TEMED(N, N, N, N-tetramethylethylenediamine) (C6H16N2; MW: 116.21). TEMED stabilizes free radicals and improves polymerization,垂直板电泳装置,加样,样品迁移方向,电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。,混合样品,带孔胶,按分子大小分离,电泳方向,电泳,小分子,大分子,夹在两块玻璃板之间的凝胶,电泳缓冲液,电泳缓冲液,加在槽中的经SDS处理的样品,分子量小,分子量大

7、,电源,电泳后的凝胶径考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片,标准蛋白分子量,未知蛋白,在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以通过标准曲线求未知多肽链分子量。,相对迁移率,水平式电泳装置,电泳缓冲液,凝胶,操作过程,1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干2.把玻璃板在灌胶支架上固定好(放好密封条和隔离板) *固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板,配 胶,3.按比例配好分离胶,用移液枪快速加入（或直接用小烧杯倒入）,大约5厘米左右,之后加少许蒸馏水（或异丙醇除泡）,静置至胶凝 * 凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶。注胶过

8、程最好一次性完成,避免产生气泡,* 水封的目的：保持分离胶上沿平直，排气泡,加速聚合. * 胶凝好的标志：胶与水层之间形成清晰的界面 4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至边缘处,迅速插入梳子,静置到胶凝 * 梳子需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平 5.拔出样梳后,拆掉密封条，在内槽中加入缓冲液 *用吸瓶将加样孔内和玻璃板下面放密封条位置的气泡全部排出,6.上样： （1）marker 10l （2）样品（100沸水浴，3-5min 处理并离心，蛋白变性） 7. 微量注射器（加样器）上样, 上样量 10-15l *微量注射器不可过低,以防刺破胶体；也

9、不可过高, 样品下沉时易发生扩散，溢出加样孔,8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，溴酚蓝距凝胶边缘约数cm时，停止电泳 9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入考马斯亮蓝染色染色液，染色20-30min左右 10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰 *剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分 11.实验结果分析,注意的问题,蛋白质电泳 常用的SDS-PAGE：单一亚基组成的蛋白质 非变性PAGE：多个不同亚基组成的蛋白质,聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套,试剂,1.40%丙烯酰胺（Acr）：2.10

10、%SDS（十二烷基硫酸钠）3.1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.8， 最后用蒸馏水定容至100ml4.0.5mol/L pH6.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris12.1g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8， 最后用蒸馏水定容至100ml,（7）10%过硫酸铵(AP)（8）TEMED（四甲基乙二胺）（9）样品溶解液： SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+ 溴酚蓝（2mg）+甘油（2g）+ 0.05mol/L pH8.0Tris-HCl（2ml），最后定容至10ml。（10）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液250ml，过滤后备用 （11）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml （12）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris- 0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml,