生物制品分析概论资料课件.ppt

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1、第二十章 生物制品分析,制作人：沈阳药科大学 药学院 80K药物分析 陈丹丹 131080102,沈阳药科大学,目录,CONTENTS,沈阳药科大学,第二十章 生物制品分析,第一节,CONTENTS,沈阳药科大学,第二十章 生物制品分析,沈阳药科大学,生物制品（Biological Products） 是应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和液体等生物材料制备，用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品。根据用途分为三类 1）预防类：细菌类疫苗、病毒类疫苗、联合疫苗 2）治疗类：抗毒素及免疫血清、血液制品、细胞因子及DNA重组技术制品

2、和单克隆抗体 3）诊断类：体内诊断类、体外诊断类根据所用材料、制法或用途分为以下几类：,第二十章 生物制品分析,沈阳药科大学,第二十章 生物制品分析,由有关细菌、螺旋体或其衍生物制成的减毒活疫苗、灭活疫苗、重组DNA疫苗和亚单位疫苗等。,细菌类疫苗,由病毒、衣原体、立克次体或其衍生物制成的减毒活疫苗、灭活疫苗、重组DNA疫苗和亚单位疫苗等。,病毒类疫苗,指两种或两种以上疫苗原液按特定比例配合制成的具有多种免疫原性的疫苗。,联合疫苗,由两个及以上同种但不同型（或群）抗原合并组成的含有双价或多价抗原成分的一种疫苗分别称。,双价及多价疫苗,沈阳药科大学,第二十章 生物制品分析,指用病毒或立克次体接种

3、于动物、鸡胚，或经组织培养后加以处理制造而成。,第二节,CONTENTS,沈阳药科大学,第二十章 生物制品分析,沈阳药科大学,第二十章 生物制品分析,生物制品的质量标准有别于其他商品，强调其特殊性。,使用安全，副作用小。,使用后能产生相应效力。,制品的生产工艺、储存条件、成品的药效、稳定性、外观、包装、使用方法和价格可接受。,第三节,CONTENTS,沈阳药科大学,第二十章 生物制品分析,沈阳药科大学,第二十章 生物制品分析,系在琼脂糖凝胶板上按一定距离打数个孔，在相邻两孔内分别加入抗原与抗体，若抗原、抗体互相对应，浓度、比例适当，则一定时间后、在抗原与抗体孔之间形成免疫复合物的沉淀线，以此对

4、供试品的特异性进行检查。ChP2010收载的伤寒Vi多糖疫苗、狂犬病人免疫球蛋白和人血白蛋白等，均采用该法进行鉴别。,沈阳药科大学,第二十章 生物制品分析,沈阳药科大学,第二十章 生物制品分析,ChP人血白蛋白的鉴别1）将完全溶胀的1.5%琼脂糖溶液倒于水平板上（每平方厘米加0.19ml琼脂糖），凝固后打孔，直径3mm，孔距3mm（方阵型）。2）中央孔加入抗血清，周边孔加入供试品溶液，并留一孔加入相应阳性对照血清。每孔加样20l，然后置水平湿盒中，37水平扩散24小时。3）用生理氯化钠溶液充分浸泡琼脂糖胶板，以除去未结合蛋白。4）将浸泡好的琼脂糖凝胶板放入0.5%氨基黑溶液中染色，用脱色液脱色

5、至背景无色，沉淀线呈清晰蓝色为止。应仅与抗人血清或血浆产生沉淀线，与抗马、抗猪、抗牛、抗羊血清或血浆不产生沉淀线。,系将供试品通过电泳分离成区带的各抗原，然后与相应的抗体进行双相免疫扩散，当两者比例合适时形成可见的沉淀弧。将沉淀弧与已知标准抗原、抗体生成的沉淀弧的位置和性状进行比较，即可分析供试品中的成分及其性质。ChP2010收载的人血白蛋白和冻干人免疫球蛋白等均采用该法进行鉴别。,沈阳药科大学,第二十章 生物制品分析,沈阳药科大学,第二十章 生物制品分析,ChP冻干人免疫球蛋白的鉴别1）将1.5%琼脂糖溶液倾倒于大小适宜的水平玻板上，厚度约3mm，静置，待凝胶凝固成无气泡的均匀薄层后，于琼

6、脂糖凝胶板负极1/3处的上下各打一孔，孔径3mm，孔距10-15mm。2）测定孔加供试品溶液10l和溴酚蓝指示液1d，对照孔加正常人血清或血浆10l和溴酚蓝指示液1d。3）用三层滤纸搭桥和巴比妥缓冲液（电泳缓冲液）接触，100V恒压电泳月2h（指示剂迁移到前沿）。电泳结束后，在两孔之间距离两端月3-5mm处挖宽3mm槽，向槽中加入血清抗体或人血浆抗体，槽满但不溢出。放湿盒中37扩散24小时。3）用生理氯化钠溶液充分浸泡琼脂糖胶板，以除去未结合蛋白。4）将浸泡好的琼脂糖凝胶板放入0.5%氨基黑溶液中染色，用脱色液脱色至背景无色。,与正常人血清或血浆比较，主要沉淀线应为IgG。,系以供试品与特异性

7、抗体结合后，抗体再与酶标抗体特异性结合，通过酶学反应的显色，对供试品的抗原特异性进行检查。ChP2010收载的重组人促红素注射液（CHO细胞）和注射用重组人干扰素1b等均采用该法进行鉴别。,沈阳药科大学,第二十章 生物制品分析,所用原理同免疫印迹法，但具体操作有所不同。以供试品与特异性抗体结合后抗体再与酶标抗体特异性结合，通过酶学反应的显色，对供试品的抗原特异性进行检查。ChP2010收载的注射用重组人干扰素2a等，均采用该法进行鉴别。,沈阳药科大学,第二十章 生物制品分析,ChP2010规定抗毒素和抗血清制品鉴别试验采用酶联免疫法。如动感乙型脑炎灭活疫苗（Vero细胞）、人用狂犬疫苗（Ver

8、o细胞）和重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）等均采用该法进行鉴别。,沈阳药科大学,第二十章 生物制品分析,第四节,CONTENTS,沈阳药科大学,第二十章 生物制品分析,沈阳药科大学,第二十章 生物制品分析,沈阳药科大学,第二十章 生物制品分析,物理性状的检查蛋白质含量测定防腐剂和灭活剂含量测定纯度检查相对分子质量或分子大小测定其他：水分含量测定、酸碱度和氯化钠测定安全检查生物制品的效力测定杂质检查,1.外观外观异常往往涉及制品的安全和效力问题；通过固定的人工光源进行目测。2.真空度及溶解速率真空封口的冻干制品应测定真空度，瓶内应出现蓝紫色辉光，溶解速度应在规定时限以下。3.装量通过容量法测试其实际

9、装量不得少于标示量。,”,“,沈阳药科大学,第二十章 生物制品分析,1.目的检查有效成分，计算纯度和比活性。2.常用测定方法凯氏定氮法（钨酸沉淀法和三氯乙酸沉淀法）、酚试剂法（Loery法）和双缩脲法（紫外-可见分光光度法）等。,”,“,沈阳药科大学,第二十章 生物制品分析,生物制品在生产中为了脱毒、灭火和防止活菌污染，常加入适量本分、甲醛、氯仿和汞制剂等作为防腐剂和灭活剂。对这些非有效成分，ChP2010中规定其含量应控制在一定限度内。,”,“,沈阳药科大学,第二十章 生物制品分析,生物制品在经过精制后，要检查纯度是否达到规定要求，常用电泳法和高效液相色谱法。ChP重组人促红素注射液（CHO

10、细胞）纯度测定 1）亲水硅胶体积排阻色谱柱：排阻极限300kD，孔径24nm，粒度10m，直径7.5mm,长30cm； 2）流动相：3.2mmol/L磷酸氢二钠-1.5mmol/L磷酸二氢钾-400.4mmol/L氯化钠，pH7.3； 3）上样量：20-100g； 4）在波长280nm处检测，以人促红素色谱峰计算旳理论板数不低于1500。按面积归一化法计算人促红素纯度，不低于98.0%。,”,“,沈阳药科大学,第二十章 生物制品分析,对提纯的蛋白质制品如白蛋白、丙种球蛋白或抗毒素，在必要时需测定其单体、聚合体或裂解片段的相对分子质量及分子大小；提纯的多糖疫苗需测定多糖的分子大小及其相对含量。常

11、用方法：凝胶层析法 SDS-PAGE法 超速离心分析法,”,“,沈阳药科大学,第二十章 生物制品分析,沈阳药科大学,第二十章 生物制品分析,菌毒种和主要原材料：1）用于生产的菌、病毒种，投产前必须按药典或有关规定要求，进行毒力、特异性和培养特异性等试验，检查其生物学特性是否存在异常。2）用于生产血液制品的血液，采血前必须对献血者进行严格的体检和血样化验，采集血后还应进行必要的复查。半成品（包括原液）：在生产过程中，主要检查对活菌、活毒或毒素的处理是否完善，半成品是否有杂菌或有害物质的污染，所加灭活剂、防腐剂是否过量等。成品：成品在分装或冻干后，必须进行出厂前的安全检查。逐批按药典三部或有关规定

12、要求，进行无菌试验、纯菌试验、毒性试验、热原试验和安全试验等检查，以确保制品的安全性。,沈阳药科大学,第二十章 生物制品分析,杀菌、灭火和脱毒检查,过敏性物质的检查,残余毒力和毒性物质的检查,外源性污染的检查,一些死菌苗、灭活疫苗以及类毒素等制品，需作检查：无菌试验、活毒检查和解毒试验。,沈阳药科大学,第二十章 生物制品分析,采用异体蛋白为原料制成的治疗制剂，需检查其中过敏源的去除是否达到允许限度。豚鼠试验,主要用于检查组织培养疫苗，要求其含量不超过50ng/剂。,用人胎盘血或静脉血准备的白蛋白和丙种球蛋白，常有少量A或B型物质，O型血孕妇使用后，可能引起新生儿溶血症。,残余毒力检查,无毒性试

13、验（一般安全试验）,毒性检查,防腐剂检查,沈阳药科大学,第二十章 生物制品分析,沈阳药科大学,第二十章 生物制品分析,沈阳药科大学,第二十章 生物制品分析,免疫力试验 1）定量免疫定量攻击法 2）变量免疫定量攻击法（50%有效免疫剂量测定法） 3）定量免疫变量攻击法（免疫指数测定法）活菌数和或病毒滴度测定 1）活菌数（率）测定 2）病毒滴度测定血清学试验 测定抗体水平或抗原活性,沈阳药科大学,第二十章 生物制品分析,生物污染物 1）微生物污染 2）细胞成分（宿主细胞（菌）蛋白） 3）外源性DNA 4）培养基成分 5）产品制备和纯化过程中残留的有关大分子物质产品相关杂质 1）二聚体和多聚体 2）脱氨或氧化产物和突变物工艺添加剂 1）残余抗生素 2）蛋白分离剂聚乙二醇 3）佐剂氢氧化铝 4）产品稳定剂辛酸钠和肝素 5）防腐剂苯酚、硫柳汞、三氯甲烷,沈阳药科大学,第二十章 生物制品分析,宿主细胞（菌）蛋白残留量的检查 ChP2010中均采用酶联免疫法外源DNA残留量的检查 第一法 DNA探针杂交法 第二法 荧光染色法残余抗生素的检查产品相关杂质的检查,沈阳药科大学,