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1、实验五 薄层色谱实验,一、实验目的,1、掌握薄层色谱的操作技术。 2、了解薄层色谱的基本原理和应用。,二、实验原理: 1、原理 薄层色谱(Thin Layer Chromatography)常用 TLC表示,又称薄层层析,属于固液吸附色谱。样品在薄层板上的吸附剂(固定相)和溶剂(移动相)之间进行分离。由于各种化合物的吸附能力各不相同,在展开剂上移时,它们进行不同程度的解吸,从而达到分离的目的。,2、薄层色谱的用途: 1)化合物的定性检验。(通过与已知标准物对比的方法进行未知物的鉴定)在条件完全一致的情况,纯碎的化合物在薄层色谱中呈现一定的移动距离,称比移值(Rf值),所以利用薄层色谱法可以鉴定
2、化合物的纯度或确定两种性质相似的化合物是否为同一物质。,影响比移值的因素很多,如薄层的厚度,吸附剂颗粒的大小,酸碱性,活性等级,外界温度和展开剂纯度、组成、挥发性等。所以,要获得重现的比移值就比较困难。为此,在测定某一试样时,最好用已知样、品进行对照。,2、快速分离少量物质(几到几十微 克,甚至0.01g)3、跟踪反应进程 在进行化学反应 时,常利用薄层色谱观察原料斑点 的逐步消失,来判断反应是否完成。4、化合物纯度的检验(只出现一个斑 点,且无拖尾现象,为纯物质),三、实验装置,1.薄层板的制法;2.薄层色谱活化;3.薄层色谱点样;4.薄层色谱展开;5.薄层色谱显色与分析;,四、实验步骤:,
3、1、吸附剂的选择薄层色谱的吸附剂最常用的是氧化铝和硅胶。 1)硅胶: “硅胶H”不含粘合剂;“硅胶G”含煅石膏粘合剂;其颗粒大小一般为260目以上。颗粒太大,展开剂移动速度快,分离效果不好;反之,颗粒太小溶剂移动太慢,斑点不集中,效果也不理想。,四、实验步骤:,对化合物的吸附能力与它们的极性成正比,具有较大极性的化合物吸附较强,因而Rf值较小。酸和碱 醇、胺、硫醇 酯、醛、酮 芳香族化合物 卤代物、醚 烯 饱和烃本实验选择的吸附剂为薄层色谱用硅胶G。,2、薄层板的制备:,薄层板制备的好坏直接影响色谱的结果。薄层应尽量均匀且厚度要固定。否则,在展开时前沿不齐,色谱结果也不易重复。在烧杯中放入2g
4、硅胶G,加入56ml0.5%的羧甲基纤维素钠水溶液,调成糊状。,将配制好的浆料倾注到清洁干燥的载玻片上,拿在手中轻轻的左右摇晃,使其表面均匀平滑,在室温下晾干后进行活化。本实验用此法制备薄层板4片。,3、薄层板的活化将涂布好的薄层板置于室温凉干后,放在烘箱内加热活化,活化条件根据需要而定。硅胶板一般在烘箱中渐渐升温,维持105110活化30min。氧化铝板在200烘4h可得到活性为级的薄板,在150160烘4h可得活性为级的薄板。活化后的薄层板放在干燥器内保存待用。,4、点样先用铅笔在距薄层板一端1cm处轻轻划一横线作为起始线,然后用毛细管吸取样品,在起始线上小心点样,斑点直径一般不超过2mm
5、。,若因样品溶液太稀,可重复点样,但应待前次点样的溶剂挥发后方可重新点样,以防样点过大,造成拖尾、扩散等现象,而影响分离效果。若在同一板上点几个样,样点间距离应为1。点样要轻,不可刺破薄层。,5、展开薄层色谱的展开,需要在密闭容器中进行。在层析缸中加入配好的展开溶剂,使其高度不超过1cm。将点好的薄层板小心放入层析缸中,点样一端朝下,浸入展开剂中。盖好瓶盖,观察展开剂前沿上升到一定高度时取出,尽快在板上标上展开剂前沿位置。,晾干,观察斑点位置,计算Rf值。,在特定的色谱系统中,化合物的Rf值是一定的,比较未知物和标准物的Rf值能够作为鉴定未知物的依据。,薄层色谱流动相及展开机制,TLC展开就是
6、流动相沿薄层(固定相)运动,以实现样品混合组分分离的过程。选择原则为“相似相容”强极性试样用强极性展开剂,弱极性试样用弱极性展开剂,常用溶剂极性顺序为: 乙烷二硫化碳苯四氯化碳二氯甲烷乙醚乙酸乙酯丙酮丙醇甲醇水,6、显色被分离物质如果是有色组分,展开后薄层色谱板上即呈现出有色斑点。如果化合物本身无色,则可用碘蒸气熏的方法显色。还可使用腐蚀性的显色剂如浓硫酸、浓盐酸和浓磷酸等。对于含有荧光剂的薄层板在紫外光下观察,展开后的有机化合物在亮的荧光背景上呈暗色斑点。,比较常用的显色剂由两种,碘和5%-10%硫酸甲醇溶液,一般的物质在这两种显色剂中都能显色。碘显色的好处是显完色后放置一段时间碘挥发后不影
7、响你的点,缺点是它显所有的点都是黄色的;硫酸显色的颜色很丰富,可以根据颜色初步判断物质的种类,也可以判断Rf值相同的点是否是同一物质。,山楂的薄层鉴别:供试液制备: 取本品粉末0.5g,加醋酸乙酯2ml浸渍24小时,取上清液作为供试品溶液。对照液制备: 取熊果酸对照品加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液。,点样:供试品溶液点样4ul,对照品溶液点样2ul展开剂:甲苯-醋酸己酯一甲酸(20:4:0.5)显色:喷以硫酸乙醇溶液(3 -10),80加热数分钟,至斑点显色清日析,置日光和紫外光灯( 365nm)下检视。,色谱识别:日光下观察,供试品色谱中部可见与熊果酸对照品相同的紫红色斑点为主斑。紫外光灯下的荧光色谱除熊果酸显橙黄色荧光斑点外,尚有其他荧光斑点,可供辅助鉴别。,五、实验讨论:载玻片应干净且不被手污染,吸附剂在玻片上应均匀平整。点样不能戳破薄层板面,各样点间距1- 1.5cm,样点直径应不超过2mm。展开时,不要让展开剂前沿上升至底线。否则,无法确定展开剂上升高度,即无法求得Rf值和准确判断粗产物中各组分在薄层板上的相对位置。显色加热时间不宜过长,否则薄层板表面易炭化而背景被污染。,六、思考题如何利用Rf值来鉴定化合物?薄层色谱法点样应注意些什么?常用的薄层色谱的显色剂是什么?,
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