大小型层析柱的装填实践介绍(中文)ppt课件.ppt

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1、A. Sprauer 5/06,Pall-Euroflow / Resolute,TOYOPEARL树脂填料的装填,内容提要,Peak Biotech,装填的一般原则TOYOPEARL的装填压力最好在0.5 - 5 bar的范围内装填流速至少比实际操作流速高50%不要使用会产生剪切力的装置（如：磁力搅拌器、 齿轮泵） - 这些装置会磨碎树脂填料并产生小颗粒 TOYOPEARL是一种刚性强的树脂填料，装填时务必区别于一般的软式琼脂糖凝胶,Superformance / Gtec,TOYOPEARL树脂填料的装填,基本步骤,去除小颗粒,装填缓冲液平衡,匀浆准备,装柱,TOYOPEARL出货时为悬浮

2、液状态（含20%乙醇）,TOYOPEARL树脂填料的装填,装柱前务必进行小颗粒去除的操作!小颗粒的存在会阻塞筛板或烧结板，并最终会导致整个柱子的压降增大小颗粒的去除采取悬浮静置移注法重复这一步骤不少于3次,借助显微镜可检查小颗粒的存在,小颗粒的去除,TOYOPEARL 粒径Coarse C级规格: 100 mMedium M级规格: 65 mFine F级规格: 45 mSuperfine S级规格: 35 m,水中静置时间15-30 Min.30-45 Min.45-60 Min.60-90 Min.,Amicon Moduline-120cm ID,显微镜微观显示 Toyopearl 65

3、0 M,TOYOPEARL的静置时间,在去除小颗粒时的最后一次步骤中可加入装填缓冲液进行填料的平衡最好根据实际生产中所使用的缓冲液选取合适的装填缓冲溶液一般来讲，分离纯化工艺中将使用到的最高离子强度的流动相是装填缓冲液的首选这一操作可以将填料装得最为紧密，并且可以防止死体积的发生或胶体内沟槽的出现。,装填缓冲液的平衡,TOYOPEARL-典型的装填缓冲溶液,利用量筒测量静置胶体体积或使用水泵抽滤浆液至湿滤饼后计算装填所需要的填料体积通过添加装填缓冲液调节浆液浓度:流动式装填柱 40 - 70% (v/v) 自动装填柱 20 - 60% (v/v) 最终装填好的柱床体积是要小于装填前胶体静置体积

4、或抽干的湿滤饼的体积,Slurry preparation in the column,Slurry preparation in a separate tank,Settling resin,Amicon Moduline-120cm ID,匀浆准备,ToyopearlHW-40, HW-50, HW-55HW-65 and HW-75FEther-650, Phenyl-650Butyl-650, DEAE-650Super-Q-650, CM-650SP-650 and all AffinityQAE-550C and SP-550C,使用约1.1倍柱体积的静置胶使用约1.2倍柱体积的静

5、置胶使用约1.25-1.4倍柱体积的静置胶,对于给定的柱子，装柱所需的静置胶体积,恒流速装填法恒压装填法辅助的重力沉降装填法,主要装填方法,方法简介:将柱底筛板用装填缓冲液润湿（赶走气泡）任何时候，均需确保浆液在注入层析柱前进行过匀浆操作匀浆液倒入后，立刻将分配器置于储槽内浆液表面分配器与溶液浆液间不应有气泡存在阶段性调整装填流速至目标流速，以产生一个实时的、没有太大振动的栓塞流在最初的压实操作基础上，为进一步压实柱床，至少泵入5-10倍柱体积的装填缓冲液调整分配器至胶体表面重复后两个步骤，直至柱床被彻底压实。最后将分配器移至距离柱床2-5 mm 处（最后一次）。不要担心使用分配器的同时进行柱

6、床的压实操作！,MilliporeQuik Scale,Flow Packed Columns (Millipore-QuikScale+Moduline, GE Healthcare-BPG, Gtec-Superformance, BioRad-Geltec, etc.),恒流速装填方法,实验室规模最优化的装填及柱操作流速,柱尺寸(I.D. x L)2.2 cm x 60 cm9 cm x 30 cm25 cm x 30 cm,填料类型HW-55SQAE-550CDEAE-650M,目标流速 (ml/min)23002000,增加量(ml/min) 0.5 50 500,保持时间(min)

7、 0.5 2 2,恒流速装填法中流速的增加量举例：,恒流速装填方法,Gtec/Superformance 20cm ID Column,气泡会由于切换阀、管路连接处、 活塞运动、未脱气缓冲液而引起.,恒流速装填方法- 扰动（由入口处筛板下气泡而引起的）,装填,运行,管路清洗,卸料,Horizontal Flow - “Self Packer” - preset column volume(Pall/Euroflow-ResoluteTM, Millipore-IsoPakTM, GE Healthcare-Chromaflow, Eastern River),优点：易于装填弱点：填料用量较大,

8、 卸料可能较难, 有剪切力发生, 卸料会导致大量的浆液体积,Resolute,恒压装填方法,Radial Flow - “Self Packer” - preset column volume (Proxcys-CRIO),Low space requirements only 0,51 m2; even 600 liter BV is mounted on wheelsLarge inlet surface area cotrolled & gentle product application (“Natural Distribution”).Thin frit keeps the resi

9、n together it is not used as flow distributor a barrier of only 60um negligible influence on pressure generation,Identical pathlength for all substances A-E,CRIO - Colonne Radiale InOxidable,恒压装填方法,Dynamic Axial Compression (Novasep, Peak Biotech, Technikrom, GE Healthcare),Unpacking,Pneumatic/Hydra

10、ulic,Slurry transfer,优点：装填操作简单，非常快缺点：卸料会导致大量的浆液体积(while column is assembled) ；不易操作g (while disassembling the column), 卸料缓慢,Peak Biotech/Dan Process - DAC,恒压或恒流速装填方法,不要使用没有进行正确柱效评价的层析柱!SEC、RPC及HIC型层析柱的柱效与装填质量密切相关的。只有IEC和AFC型层析柱，在没有高塔板数时也能正常工作。尽管如此，对称性因子还是相当重要的。,层析柱操作,使用5-10倍柱体积的低离子强度缓冲液进行柱子的平衡使用低分子量、

11、无保留的化合物进行柱效的测定（如：丙酮、盐）进样体积为柱体积的0.25 - 1%将测定而得的塔板数、不对称性因子与厂家提供的最小值相比较如果未达到最小塔板数等期望值，必须重新进行柱子的装填！,可供选择的方法: 使用高离子强度的装填缓冲液，使用低盐溶液或水进样，会产生一个负的电导信号/倒峰（不需要平衡、节省时间等）,柱效评价,N = plates per columnVe = elution volume cm or mlW1/2 = width of the peak at half peak height cm or mlSymmetry:Distance b / a = peak widt

12、h at 10% peak height cm or ml,h,结果与下列因素有关: 评价操作（因人而异） 进样的可重复性（硬件影响） 流速 进样样品的分子尺寸,柱效与不对称性因子的计算,样品：丙酮,Pall Resolute 400,TOYOPEARL填料装填柱的最小柱效值,Gau 前沿/前伸峰 拖尾峰,柱效评价 峰形,前沿峰的处理提高浆液浓度降低装填压力缩短静置时间 (在柱中)拖尾峰的处理与前沿峰的处理方法相反低柱效的处理去除小颗粒重新平衡胶体改变样品/样品缓冲液检查检测器/泵,Pall - Resolute,柱效评价 常见问题及处理,流动式装填中出现沟槽/管路,柱床发生塌陷,BPG 20

13、cm ID Column / Toyopearl DEAE-650M,Resolute 40cm ID Column / Toyopearl Butyl-650M,2-3 cm length- not critical,Channels 5 cm length - critical !,处理方法：柱子的最大耐压为3 bar - 更换耐压较高的柱子（如： 7 bar ）,处理方法：尽量将活塞靠近柱床表面 尽可能降低装填速度,非理想的装填,Bed depression in the center,From pack to pack reproducibly split peak generatio

14、n,In Euroflow and Superformance columns,处理方法： Superformance - 更换筛板/优化流量分配系统Pall/Euroflow - 修改装填程序,处理方法：更换柱筛板,非理想的装填,装填好的柱子或已使用过的散装填料应保存在含有抑菌剂（如：20%的乙醇）的蒸馏水溶液中，并最好在4 25C下存储。储存后，如果需要重新使用层析柱，必须进行清洗操作。（盐析/盐沉淀的影响；微生物的生长；病毒的清除）,柱子/填料的保存,工艺层析柱装填实例,Achim SprauerTechnical SpecialistTOSOH Bioscience GmbHGermanyAchim.SprauerT,TOYOPEARL树脂填料的装填实践,