纳米稀土荧光材料与时间分辨荧光免疫分析-硅胶包裹纳米铽荧.docx

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1、纳米稀土荧光材料与时间分辨荧光免疫分析作 者：叶志强, 谭明乾 指导教师：袁景利, 王桂兰一室101组摘要：在油包水型的微乳液中，合成了三种形状规则、尺寸均匀的硅胶基质纳米稀土荧光材料。与前驱体相比，新型荧光纳米微粒具有更强的荧光强度和抗光漂白性能。将纳米微粒表面修饰并标记链酶亲和素SA（或抗体）后应用于时间分辨荧光免疫分析，建立了人血清中前列腺特异抗原（PSA）、甲胎蛋白（AFP）和乙肝表面抗原（HBsAg）的高灵敏度检测方法。关键词：荧光纳米微粒；稀土配合物；生物标记；时间分辨荧光免疫分析。 时间分辨荧光生物分析技术是基于稀土荧光化合物特殊荧光性质而建立起来的一种高灵敏度分析方法，现已广泛

2、应用于免疫测定、DNA杂交测定和荧光显微镜成像测定等生化检测的领域1。该技术利用具有荧光寿命长、Stokes 位移大和半峰宽窄等特点的稀土荧光配合物作为标记物，不仅适用于多标记分析，而且可完全消除各种散乱光和短寿命荧光对测定的干扰，从而实现超高灵敏度分析。基于这些优点，时间分辨荧光生物分析技术在近20年来取得了重大的发展，在临床医学与生命科学的实践与研究中发挥着重要的作用。近年来，纳米尺度发光材料在生化分析领域中的作用受到了越来越多的关注。量子点2、胶体金3、核壳型荧光探针4等纳米颗粒作为标记物已经开始应用于生化检测领域。但是由于纳米尺度的发光粒子的瑞利、拉曼和丁达尔散射产生的背景光对测定的严

3、重干扰,影响了检测结果的灵敏度、精密度和准确度，无法实现高灵敏的定量分析。在我们的研究中，综合稀土荧光标记物和纳米技术的优势，合成了三种具有长寿命荧光的纳米稀土荧光微粒5-7。新型纳米荧光微粒用于时间分辨荧光生物分子分析，不仅可从根本上彻底消除各种散乱光和短寿命荧光对测定的干扰，提高分析方法的灵敏度,而且由于荧光配合物被包覆在硅胶的骨架结构中,基本隔绝了外部环境对配合物的影响，极大地增强了荧光材料的光稳定性。实验部分1.掺杂型纳米荧光微粒的制备将160 mg N,N,N1,N1-2, 6-bis(3-aminomethyl-1-pyrazolyl)-phenyl- pyridinetetrak

4、is(acetate)-Tb3+ （BPTA-Tb3+）溶于1.1 ml的水后和200 l的四乙氧基硅（TEOS）搅拌下加入到100 ml的圆底烧瓶中，然后再分别加入2.37 g Triton X-100、1.87 g 正己醇和7.25 g环己烷，制成W/O型微乳液，在剧烈搅拌下向其中加入含有2.37 g Triton X-100、1.87 g正己醇、7.25 g环己烷及200 l浓氨水的另一种微乳液。室温搅拌反应24小时后，加入50 ml丙酮结束反应。将反应液离心后除去上清液，沉淀部分用乙醇和二次蒸馏水各洗三次，真空干燥后得到白色硅胶包裹BPTA-Tb3+纳米荧光微粒。2.掺杂型纳米荧光微粒

5、用于测定人血清样品中的PSA将含抗人PSA单克隆抗体（10 g/ml）的pH值为9.6的0.1 mol/L的碳酸钠缓冲溶液50 l分注于96微孔板的各孔中，4 oC, 24小时包被后，将PSA标准溶液（用5% BSA-0.9% NaCl-0.1% NaN3的pH值7.8的0.05 mol/L Tris-HCl溶液制备）或血清样品45 l注入上述包被后的微孔板中。37 0C，1小时反应后，用含有0.05% Tween 20 的pH值7.8的0.05 mol/L Tris-HCl缓冲溶液（缓冲溶液1）洗两次，再用pH值7.8的0.05 mol/L Tris-HCl缓冲溶液（缓冲溶液2）洗一次，然后

6、加入45 l生物素标记的抗PSA抗体溶液，37 0C，1小时反应后，用缓冲溶液1洗两次，缓冲溶液2洗一次，再加入45 l 纳米微粒标记的SA溶液，37 0C，1小时反应后，用缓冲溶液1洗4次，然后进行固相时间分辨荧光测定。 3.共聚合型纳米荧光微粒的制备将160 mg BPTA-Tb3+溶于1.1 ml的水后和200 l的TEOS搅拌下加入到100 ml的圆底烧瓶中，然后再分别加入2.37 g Triton X-100、1.87 g正辛醇及7.25 g环己烷，制成W/O型微乳液，在剧烈搅拌下向其中加入含有2.37 g Triton X-100、1.87 g正辛醇、7.25 g环己烷及200 l

7、浓氨水的另一种微乳液。室温搅拌反应5小时后，加入6 l的3-2-(2-aminoethylamino)ethylaminopropyl- trimethoxysilane（AEPS），继续搅拌19小时后，加入50 ml丙酮结束反应。将反应液离心后除去上清液，沉淀部分用乙醇和二次蒸馏水分别洗三次，真空干燥后得到白色的共聚合型硅胶包裹BPTA-Tb3+纳米荧光微粒。4.共聚合型荧光纳米微粒用于测定人血清样品中的AFP将含抗人AFP单克隆抗体（10 g/ml）的pH值为9.6的0.1 mol/L碳酸钠缓冲溶液50 l分注于96微孔板的各孔中，4 0C, 24小时包被后将AFP标准溶液或血清样品45

8、l注入上述包被后的微孔板中，37 0C，1小时反应后，用缓冲溶液1洗两次，缓冲溶液2洗一次。加入45 l纳米荧光微粒标记的抗AFP多抗溶液，37 0C，1小时反应后，用缓冲溶液1洗4次，然后进行固相时间分辨荧光测定。5. 共价键合型荧光纳米微粒的制备将10.4 mg氨丙基三乙氧基硅 (APS，47 mmol)，7.1 mmol 4,4-bis(1, 1,1,2,2,3,3-heptafluoro-4,6-hexanedion-6-yl)-chlorosulfo-o- terphenyl (BHHCT)及3.55 mmol EuCl36H2O 加入30 l环己烷中，超声振荡反应15分钟后，反应液

9、加入到含有1.1 ml水，4.74 g Triton X-100、3.64 g正辛醇及14.50 g环己烷的W/O型微乳液中，搅拌0.5小时后，加入200 l的TEOS和200 l的浓氨水。室温搅拌反应24小时后，加入40 ml丙酮结束反应。将反应液离心后除去上清液，沉淀部分用乙醇和二次蒸馏水分别洗三次后悬浮于水中备用。6. 共价键合型纳米微粒用于人血清中乙肝表面抗原（HBsAg）测定使用抗HBsAg单抗和多抗进行测定，测定步骤与掺杂型纳米荧光微粒测定人血清中PSA相同。结果和讨论 1. 掺杂型纳米荧光微粒的制备及时间分辨荧光免疫测定PSA 掺杂型纳米荧光微粒的制备原理见图1。在表面活性剂和助

10、表面活性剂的作用下，含有 TEOS,BPTA-Tb3+的水溶液在油相中形成均匀的小液室，每一个小液室相当于一个微反应器，TEOS的水合化和聚合化的过程都被限制在微反应器内。微反应器的体积主要由水和表面活性剂的比值所决定，而微反应器的体积大小又决定了纳米颗粒的尺寸大小。我们用这种方法制备了直径在42 3 nm的纳米颗粒(图2)，由电镜照片可以看出纳米颗粒形状规则、尺寸均匀。 图1 在微乳液中制备纳米微粒的原理 图2 硅胶包裹BPTA-Tb3+纳米微粒的电镜照片 纳米荧光微粒表面的硅胶经过修饰后可与生物分子相连。将纳米荧光微粒与SA共价结合后，可用于时间分辨荧光免疫测定。PSA是前列腺癌诊断的一个

11、重要指标，现用于临床检测的方法主要有放射性免疫法和酶联免疫法，它们的检测灵敏度大约在100 pg/ml左右。而最近的研究表明，如果方法的检测灵敏度可达到20 pg/ml以下，那么至少可以提前一年诊断出治疗后前列腺癌患者是否复发。所以发展高灵敏度的血中PSA的检测方法显得十分重要。使用BPTA-Tb3+纳米微粒标记SA的时间分辨荧光免疫分析法测定PSA的工作曲线如图3所示，方法的最低检测限为7 pg/ml（用本底信号标准偏差的3倍计算）。使用本方法对24个人血清样品的PSA浓度进行了测定，并与临床测定的结果进行了比较，两者的相关性见图4。两种方法对24个人血清样品中PSA浓度测定结果的相关性方程

12、式为y1.01x0.008，相关系数为0.998，说明使用纳米微粒作为标记物的测定方法的结果是完全可信的。 图3用硅胶包裹BPTA-Tb3+纳米微粒标记SA 图4 新方法和临床检测法用于24个人血清的时间分辨荧光免疫测定PSA的工作曲线 样品中PSA浓度测定的相关性2. 共聚合型纳米荧光微粒的制备及时间分辨荧光免疫测定AFP AEPS和TEOS一样，都可以在氨水存在的条件下发生水解和聚合反应。而且它具有的活性基团-NH2在聚合后会存在于纳米微粒的表面，为后续标记生物分子提供极大的方便。所以，在我们的研究中利用将AEPS和TEOS共聚合的方法在微乳液中制备出了表面带有活性氨基的功能性硅胶包裹铽配

13、合物纳米荧光微粒。其电镜测定结果（见图5）显示这种纳米微粒不仅形状规则，而且粒径分布范围窄(453 nm)。聚合后存在于纳米微粒表面的-NH2基团使得生物标记更加容易。通过简单的方法将纳米微粒与抗AFP抗体结合后，建立了一种以纳米微粒为标记物的时间分辨荧光免疫分析方法用于人血清中AFP的测定，其工作曲线见图6。本方法的最低检测限为0.1 ng/ml，相对标准偏差（CV%）小于9.0%，血清添加回收率在84.0-98.0%范围，说明该法具有较高的精密度和准确度，可以用于人血清样品的测定。 图5功能性铽纳米荧光微粒的电镜照片 图6 测定AFP的工作曲线3. 共价键合型纳米荧光微粒的制备及时间分辨荧

14、光免疫测定HBsAgBHHCT-Eu3+是一种强荧光性铕配合物，只是它的水溶性较差，所以在用掺杂型方法制备纳米微粒时只有少量的配合物被包进纳米微粒中，导致制得的纳米微粒荧光很弱。而采用共价键合的方法则不但可以增加每个纳米微粒中所包含BHHCT-Eu3+分子的个数，从而使得纳米微粒的荧光强度得到大幅度提高，而且一次性地在纳米微粒表面导入了自由氨基。电镜测定结果（见图7）显示该法制得的纳米微粒大小均匀，粒径为373 nm。 图7 共价键合型纳米微粒的电镜照片 图8. 纳米微粒标记SA（a）和BHHCT-Eu3+标记SA-BSA（b）测定人血清中HBsAg的工作曲线将纳米微粒与SA结合后，用于时间分

15、辨荧光免疫测定人血清中的HBsAg，其工作曲线见图8a。本法的最低检测限为23 pg/ml，证明其灵敏度要高于直接使用BHHCT-Eu3+为标记物的测定方法（图8b，最低检测限为84pg/ml）。该法用于人血清样品测定的相对标准偏差小于10%，添加回收率在80-110%范围，说明该法具有较高的精密度和准确度。结论 本研究利用微乳液法制备了三种硅胶基质纳米稀土荧光微粒，制备方法简单且重复性好。所制备的纳米微粒形状规则、尺寸均匀，在对其进行表面修饰后用于生物标记及时间分辨荧光免疫测定，建立了人血清中PSA、AFP及HBsAg的高灵敏度定量测定方法。由于新型稀土荧光微粒具有强荧光、强抗光漂白性能及易

16、用于生物标记等优点，预计其在荧光显微镜生物成像测定及生物芯片等领域也有重要的应用前景，这部分的研究工作将在近期展开。注：本文系由中国科学院领域前沿项目大连化物所青年基金资助参考文献：1. Soini, E.; Lvgren, T. CRC Crit. Rev. Anal. Chem. 1987, 18, 105-154.2. Taylor, J. R.; Fang, M. M.; Nie, S. Anal. Chem. 2000. 72. 1979-1986.3. Schroedter, A.; Weller, H. Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 17, 3218-3

17、221.4. Santra, S.; Zhang, P.; Wang, K.; Tapec, R.; Tan, W. Anal. Chem. 2001, 73, 4988-4993.5. Ye, Z., Tan, M., Wang, G. and Yuan, J. Analytical Chemistry. 2004，76, 513-518.6. Ye, Z., Tan, M., Wang, G. and Yuan, J. Talanta. 2004 In press. 7. Hai, X., Tan, M., Wang, G., Ye, Z., Yuan, J. and Matsumoto,

18、 K. Analytical Sciences 2004，20, 245-246.Fluorescent Lanthanide Nano-materials and Time-Resolved FluoroimmunoassayZhiqiang Ye and Mingqian TanDirected by Jingli Yuan and Guilan Wang101 group, Department of Analytical ChemistryAbstract: Three kinds of silica-based fluorescent lanthanide nanoparticles

19、 having regular shape and uniform size have been prepared and characterized. The novel nanoparticles are strongly fluorescent and highly photostable compared with lanthanide chelates. The nanoparticles were used for streptavidin or antibody labeling. Ultrasensitive time-resolved fluoroimmunoassays for prostate specific antigen (PSA), a-fetoprotein (AFP) and hepatitis B surface antigen (HBsAg) in human serum samples were developed by using the nanoparticles as the fluorescence probes.Keywords: Fluorescent nanoparticle, Lanthanide chelate, Biolabeling, Time-resolved fluoroimmunoassay. 5