基因诊断课件全面版.pptx

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1、1,基因诊断课件,第1页/共50页,1基因诊断课件第1页/共50页,概述,几乎所有的疾病均在一定程度上与基因有某种联系，基因的改变，或是疾病发生的原因，或是疾病发生的结果，或是疾病发生时的伴随现象，而这些现象的出现是有规律的。因此，可以通过检测基因的改变来反映疾病的发生和发展，疗效和预后基因诊断：是以DNA或RNA为诊断材料，通过检查基因的存在、缺陷或表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法和过程。,第1页/共50页,第2页/共50页,概述几乎所有的疾病均在一定程度上与基因有某种联系，基因的改变,基因诊断经历了三个基本发展阶段,第一阶段：世纪年代，以DNA分子杂交为基础，通过限制性片段长度多态

2、性性（RFLP)分析进行第二阶段：应用PCR技术第三阶段：应用基因芯片技术,第2页/共50页,第3页/共50页,基因诊断经历了三个基本发展阶段第一阶段：世纪年代，以,第一节 基因诊断的基础技术,一 .基因诊断中常用的几种技术（一） 核酸杂交（二） PCR（三） DNA序列测定（四） DNA芯片技术,第3页/共50页,第4页/共50页,第一节 基因诊断的基础技术一 .基因诊断中常用的几种技术第3,(一)核酸分子杂交技术,(1)方法: 以已知顺序核酸片段作为探针,经放射性或非放射性物质标记后,再与未知的目的核酸片段进行杂交反应,分离已杂交和未杂交的标记核酸链,通过标记信号的检测就可以对未知的目的核

3、酸链进行定性、定量分析.(2)几种不同形式的核酸分子杂交 a. Southern印迹(southern blot)杂交: 用于DNA的检测，可用于基因的限制性内切酶谱分析，基因突变分析等 b. Northern印迹(Northern blot)杂交: 用于RNA的检测，能对组织细胞中的总RNA 或mRNA进行定性和定量分析 c. 斑点杂交（dot blot): 既可以检测DNA也可以检测RNA,用于特定基因及其表达的定性和定量分析方法简单、灵敏；但特异性低,第4页/共50页,第5页/共50页,(一)核酸分子杂交技术(1)方法:第4页/共50页第5页/共,原位杂交（in situ hybridi

4、zation): 是细胞学技术与核酸杂交技术结合的一种核酸分析检测技术可分为DNA原位杂交和RNA原位杂交,用于检测染色体中特定的基因位置，用于染色体疾病的诊断 分类: 玻片原位杂交:如中期的染色体和组 织切片. 膜上原位杂交:将菌落或噬菌斑影印在尼 龙膜(如硝酸纤维膜),第5页/共50页,第6页/共50页,原位杂交（in situ hybridization):,原位杂交的镜像图,第6页/共50页,第7页/共50页,原位杂交的镜像图第6页/共50页第7页/共50页,(二)PCR技术在基因诊断中的应用,（）等位基因特异性寡聚核苷酸（allele specific oligonnucleotid

5、e,ASO)探针斑点杂交：PCR-ASO该方法是诊断已知点的突变：需分别合成野生型和突变型探针在基因诊断时，只需用PCR扩增受检者目的DNA片段，再分别与上述探针杂交杂交的结果有如下几种情况： PCR扩增产物与正常探针杂交，不与突变探针杂交-不 存在这种突变； 只与突变探针杂交-突变基因为纯合子； 与正常探针和突变探针都可杂交-突变基因为杂合子； 与正常探针和突变探针都不能杂交-突变基因不属于已发 现的类型,第7页/共50页,第8页/共50页,(二)PCR技术在基因诊断中的应用（）等位基因特异性寡聚核,（）单链构象多态性（single strand conformation ploymorph

6、ism,SSCP)分析,是一种基于单链DNA构象差别来检测点突变的方 法DNA变性形成单链，在中性条件下长度相同的单 链指DNA,如果碱基组成和(或)排列顺序不同,形成的 构象就不同,这样就形成了单链构象多态性.这些分子在非变性PAGE中电泳中表现出不同的迁移率. SSCP特别适于分析小于400bp 的 PCR产物。据认为SSCP可以区分1bp的差异PCR-SSCP分析不能确定基因变异的内容，因此电泳后结果有差异后还需进行测序分析，确定变异性质,第8页/共50页,第9页/共50页,（）单链构象多态性（single strand 是一种基于,(3)限制性片段长度多态性（ restriction

7、fragment length polymorphisms,RFLP）分析,基因突变导致的基因碱基组成或(和)顺序发生改变,会在基因结构中产生新的限制性内切酶位点或使原有的位点消失. 用限制酶对不同个体基因组进行消化时，其电泳条带的数目和大小就会产生改变，根据这些改变可以判断出突变是否存在.,第9页/共50页,第10页/共50页,(3)限制性片段长度多态性（ restriction fra,限制性片段长度多态性 RFLPs ( restriction fragment length polymorphisms),1987年等人以RFLP为遗传标记绘制了第一张人类遗传图谱,第10页/共50页,第

8、11页/共50页,限制性片段长度多态性样品一样品二1987年等人以RFL,(4)PCR+变性梯度凝胶电泳分析技术,双链DNA在一定浓度变性剂(尿素,甲酰胺)作用下,会变性而解链,导致DNA分子电泳迁移率变化.当在不同梯度浓度变性胶中电泳时, DNA泳动到变性剂浓度能使DNA发生变性，DNA开始解链，从而不同的DNA片段会形成不同的迁移率条带优点：可靠，检出单碱基突变率可达缺点：富含高熔点GC区时，则难以检测出突变,第11页/共50页,第12页/共50页,(4)PCR+变性梯度凝胶电泳分析技术 双链DNA在一定,（）用甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR)进行分析

9、,在PCR扩增前，先用化学试剂（NaHSO3)处理模板DNA,将所有未甲基化的胞嘧啶（C)转变成尿嘧啶(U)，在PCR扩增时，U与引物中A配对；而CpG岛上甲基化的C不受影响，在扩增时仍与G配对,基于这种差异可以进行甲基化特异性PCR设计一对甲基化特异性引物（引物中G结合模板中C);和非甲基化特异性引物（引物中A结合模板中U),通过PCR扩增就可检测出甲基化等位基因化学修饰的DNA序列和非甲基化等位基因序列用于一些疾病和肿瘤的基因诊断,第12页/共50页,第13页/共50页,（）用甲基化特异性PCR（methylation-spec,(6)采用PCR技术对靶核酸进行定量分析,定量PCR(qua

10、ntiative PCR, Q-PCR): 就是对靶核酸分子进行定量分析的技术.根据PCR扩增指数增长期原理，理论上扩增产物累积分子数N=No(1+E),其中E是指每次循环中参与复制的模板数与总模板数的比率.通过N值可求出No. 但PCR扩增时平台期(15-25)的出现会影响测量的准确度.定量PCR的策略和方法较多.,n,第13页/共50页,第14页/共50页,(6)采用PCR技术对靶核酸进行定量分析 定量PCR(q,第三阶段：应用基因芯片技术DMD患儿在5岁前发病，20岁左右由于心力衰竭和呼吸衰竭而死亡，发病率在男性活婴中约1/3500 。群的频率为0.原理：同一染色体上位置十分靠近的相邻基

11、因或其它遗传标记，在遗传过程中分离的几率很低，常常一起遗传，形成连锁。杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)可以通过一个或几个基因或遗传标记的分析，了解另一个或几个基因。FQ-PCR技术的两种定量形式:基因组DNA探针法: 用突变高发区的常见序列作为探针,检测抗肌萎缩蛋白基因的相应变异.有300多万个单核苷酸多态性,SNP在人类基因组中广泛存在，平均每5001000个碱基对中就有1个，3-4个相邻的标记构成的单倍型（haplotype）就可有8-16种。因重排,使原来相隔数百个碱基的IgH和TCR DNA芯片技术法：根据PCR扩增的目标DNA片段在非

12、变性凝胶电泳中迁移率，将突变基因检测出来。是一种基于单链DNA构象差别来检测点突变的方 法DNA变性形成单链，在中性条件下长度相同的单 链指DNA,如果碱基组成和(或)排列顺序不同,形成的 构象就不同,这样就形成了单链构象多态性.它是由于T细胞受体(TCR)基因和IgH基2)Southern 印迹杂交分析第五节 基因诊断存在的问题与发展前景第一节 基因诊断的基础技术,a. 通过测定PCR产物量 方法: 对已知量的靶DNA进行系列稀释,比较待测样品和已知系列稀释样品的PCR产量,还可对未知量的靶DNA进行绝对定量. b. 采用极限稀释法对靶核酸进行定量分析: 方法:将待测DNA标本进行倍数稀释,

13、直至扩增不到靶基因的稀释度,用稀释程度表示启始靶基因分子数的相对量,是一种半定量方法.,第14页/共50页,第15页/共50页,第三阶段：应用基因芯片技术 a. 通过测定PCR产物量第,c.采用非竞争性对照法对靶核酸进行定量分析 方法:该方法是在一个试管内同步扩增来自同一DNA的一段靶序列和另一段内标序列,用内标序列控制DNA的用量、可扩增性和管间扩增效率的变化,通过比较两段序列PCR扩增产物电泳带的荧光强度,对靶序列进行定量分析 d. 采用竞争抑制法对靶核酸进行定量分析: 方法:参照标准不是同一核酸分子上的另一段序列,通常是人工模板,与待测序列具有相同的引物结合位点,能与待测序列竞争聚合酶,

14、底物,引物分子. 方法:将竞争模板作系列稀释后加入恒量的样品DNA进行PCR扩增,通过分离和分析竞争模板和样品DNA的PCR产量,对样品DNA进行定量分析,第15页/共50页,第16页/共50页,c.采用非竞争性对照法对靶核酸进行定量分析第15页/共50,e.荧光定量PCR(FQ-PCR)技术是一种目前国内外应用较为广泛的定量PCR技术,是通过始点定量和荧光检测系统实时监测累计荧光强度而实现,具有灵敏度高,特异性强等优点. FQ-PCR技术的两种定量形式: 绝对定量:一般采用外标准品定量的制备来实现绝对定量. 如合成目的基因;将PCR产物直接梯度稀释;或将PCR产物克隆到载体上,抽取质粒,经过

15、测量浓度和拷贝数可准确定量.优点:稳定,准确. .相对定量:指在测定目的基因的同时测定一内源性管家基因(如-actin, rRNA等),该管家基因主要是用于核苷酸的拷贝数的比较,反映反应体系内是否存在PCR扩增的影响因素.,第16页/共50页,第17页/共50页,e.荧光定量PCR(FQ-PCR)技术第16页/共50页,(三）DNA序列测序,1977年Sanger创建的链终止反应序列测序法 用放射性同位素标记引物，用双脱氧核苷酸随机终止DNA链的延伸，产生长度不同的DNA片段，再用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离这些片段，放射自显影读出结果。自动测序法 采用四色荧光标记代替了放射性同位素标记。 DNA

16、测序测定是基因突变检测的最直接，最准确的方法，它不仅可确定突变的部位，还可确定突变的性质,第17页/共50页,第18页/共50页,(三）DNA序列测序1977年Sanger创建的链终止反应序,（四）DNA芯片技术,DNA芯片（DNA chip)又称为基因芯片，DNA微阵列（DNA microarray) 该技术的基础仍然是利用核酸分子杂交原理：首先将一系列预先设计好的核酸探针（oligos or cDNA)有序地，高密度地排列在玻璃，硅片或尼龙膜等固体支持物上，制成DNA微阵列。用荧光标记待测样品（DNA,cDNA,RNA)与位于芯片上的核酸探针杂交后，通过激光共聚焦荧光扫描系统检测杂交信号强

17、度，再用特定的软件对荧光信号进行综合分析，就能获得待测样品的大量基因序列信息或表达信息。 基因芯片按照用途分为：表达芯片，诊断芯片，指纹图谱芯片，测序芯片，毒理芯片等。 该技术可用于新基因鉴定，突变检测，表达监控和遗传制图等。,第18页/共50页,第19页/共50页,（四）DNA芯片技术 DNA芯片（DNA chip)又称为基,第二节 对不同的疾病需要采用不同的基因诊断策略,已经基本清楚基因突变与疾病发生之间的分子机制，相关的基因已被克隆，测序，并被定位在染色体上。 如：一些与疾病有关的内源基因-癌基因，抑癌基因和血红蛋白基因突变型。 诊断方法：根据突变的基因序列设计探针.,第19页/共50页

18、,第20页/共50页,第二节 对不同的疾病需要采用不同的基因诊断策略第19页/共5,二.通过连锁遗传标志检测诊断疾病,许多基因病，虽然它们的基因结构还没有阐明，但通过染色体分析已被定位在染色体的特定位置上，这些基因是通过检测与特定染色体位点连锁的遗传标记来发现的。 原理：同一染色体上位置十分靠近的相邻基因或其它遗传标记，在遗传过程中分离的几率很低，常常一起遗传，形成连锁。可以通过一个或几个基因或遗传标记的分析，了解另一个或几个基因。,第20页/共50页,第21页/共50页,二.通过连锁遗传标志检测诊断疾病 许多基因病，虽然它们,40-60年代: 功能克隆,即基于明显可见的或直接与生化功能相关的

19、线索确定与疾病相关的基因: 如苯丙酮尿症与镰刀型的贫血病等.70-80年代:定位克隆,即基于疾病-染色体-基因的反向遗传学策略对没有明显的表型或生化功能异常的疾病.90- 今 :表型克隆,不考虑基因在染色体上的位置信息,而是直接在疾病与正常样本之间寻找分子水平上的差异.,第21页/共50页,第22页/共50页,40-60年代: 功能克隆,即基于明显可见的或直接与生化功能,利用表型克隆诊断疾病,表型克隆：对疾病相关的一组基因进行克隆 一些多基因，多因素的疾病，如：肥胖，哮喘，高血压，冠心病，肿瘤，精神病，自体免疫性疾病等，由于疾病发生的原因复杂，不仅涉及多基因互作，还涉及基因与环境互作。不可能通

20、过前面的方法来诊断，必须利用差异显示等技术找出正常人和疾病患者之间的差异序列，鉴定与疾病相关的多个基因，确定导致疾病的分子缺陷。 方法：根据克隆到的一组基因制作相应的一组探针，用这组探针检测一组与疾病相关的基因来诊断多基因病,第22页/共50页,第23页/共50页,利用表型克隆诊断疾病表型克隆：对疾病相关的一组基因进行克隆,基因诊断方法:一些多基因，多因素的疾病，如：肥胖，哮喘，高血压，冠心病，肿瘤，精神病，自体免疫性疾病等，由于疾病发生的原因复杂，不仅涉及多基因互作，还涉及基因与环境互作。第三阶段：应用基因芯片技术P53基因与肿瘤：p53基因是最常被失活的抑癌基 PCR+ASO 探针法 为主

21、要方法 根据 -珠蛋有300多万个单核苷酸多态性,SNP在人类基因组中广泛存在，平均每5001000个碱基对中就有1个，3-4个相邻的标记构成的单倍型（haplotype）就可有8-16种。分为异常血红蛋白病和地中海贫血,前者是由于珠蛋白的基因突变；第五节 基因诊断存在的问题与发展前景（single nucleotid polymorphism，SNP）当在不同梯度浓度变性胶中电泳时, DNA泳动到变性剂浓度能使DNA发生变性，DNA开始解链，从而不同的DNA片段会形成不同的迁移率条带,第三节 遗传病的基因诊断,一. 遗传病基因诊断的策略1.直接策略：采用基因突变的诊断方法，直 接检测致病基因

22、。该策略的前提是基因已被克隆. 2.间接策略：即通过检测与致病基因连锁 的遗传标记进行基因诊断.,第23页/共50页,第24页/共50页,基因诊断方法:第三节 遗传病的基因诊断一. 遗传病基因诊断的,人类基因组上的DNA遗传标记,限制性片段长度多态性(RFLPs )1985 短串联重复序列 (short tendem repeats, STRs ,mini- satellites )1990s 单核苷酸多态性 (single-nucleotide polymor-phisms SNPs),第24页/共50页,第25页/共50页,人类基因组上的DNA遗传标记 限制性片段长度多态性(RFLP,短串

23、联重复序列STRs (short tendem repeats, Microsatellites ),STR广泛存在于人基因组，占约5%，基本单位是1bp-8bp的串联重复，重复次数 n=15-60，已知8000多个，主要形式为： (CA)n ， (GA)n ， (AA)n ， (GG)n ， (CAA)n， (CGG)n ，其中以 (CA)n ， (GT)n 为多见。1992年，Welssenbanch等以STR为标记的第二代连锁图取代了RFLP连锁图。,第25页/共50页,第26页/共50页,短串联重复序列STR广泛存在于人基因组，占约5%，第25页/,定义:主要是指在基因组水平上由单个核

24、苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。与RFLP与STR不同,它是直接以序列的变异作为标记,而不是以片段的长度差异作为标记. 人类基因组图谱的初步分析表明，共有3万至万个基因。有300多万个单核苷酸多态性,SNP在人类基因组中广泛存在，平均每5001000个碱基对中就有1个，3-4个相邻的标记构成的单倍型（haplotype）就可有8-16种。 1996年，Lander报道了用单核苷酸多态性 标记制备第三代遗传连锁图的遗传标记。,单核苷酸多态性（single nucleotid polymorphism，SNP）,第26页/共50页,第27页/共50页,定义:主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的

25、变异所引起的DN,SNP用作遗传标记具有以下优点：, SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因频率都可估计出来。它在基因组中的分布较微卫星标记广泛得多。与串联重复的微卫星位点(STR)相比，SNP是高度稳定的.尤其是处于编码区的SNP(cSNP),而前者的高突变率容易引起对人群的遗传分析出现困难。部分位于基因内部的SNP可能会直接影响产物蛋白质的结构或基因表达水平，因此，它们本身可能就是疾病遗传机制的候选改变位点。易于进行自动化分析，缩短了研究时间 .,第27页/共50页,第28页/共50页,SNP用作遗传标记具有以下优点： SNP在人群中是二等位,一. 血红蛋白病的基因诊断,分

26、为异常血红蛋白病和地中海贫血,前者是由于珠蛋白的基因突变；后者是由于珠蛋白合成速率降低，a链和b链合成不平衡。（一）异常血红蛋白病的基因诊断： 如镰状红细胞贫血病:链第六位氨基酸:GAA(谷)GUA(颉)代替. 对该病的基因诊断应采用: 1)PCR+限制酶切,即用PCR从患者基因组扩增含突变位点的珠蛋白基因片段,再选适当的内切酶消化PCR产物,根据电泳图谱上片段数量和大小做出判断 2)Southern 印迹杂交分析,第28页/共50页,第29页/共50页,一. 血红蛋白病的基因诊断 分为异常血红蛋白病和地中海贫血,血红蛋白病的基因诊断2,（二） 地贫的基因诊断： 1. 定性分析：PCR法直接扩

27、增1和2 基因的3端有差别，针对此可设计 引物进行PCR，如有缺失，则不能扩 增出产物 2. 定量分析:地贫的共同特点是 珠蛋白mRNA的量减少，因此可用 RT-PCR定量分析mRNA的量以助诊断,第29页/共50页,第30页/共50页,血红蛋白病的基因诊断2（二） 地贫的基因诊断：第29页/共,（三） -地贫的基因诊断 1. DN检测与分析 ： PCR+ASO 探针法 为主要方法 根据 -珠蛋 白主要突变位点，设计2对引物，扩增可能发生 突变的2个片段,再分别与相应野生型探针和突 变探针进行斑点杂交。 PCR+RFLP连锁分析法 检测与-珠蛋白基因连 锁的遗传标记进行基因诊断,如-珠蛋白5端

28、 有一限制内切酶HgiAI的多态性位点,在中国人 群的频率为0.5 DNA芯片技术 2.RNA检测与分析：RT-PCR定量分析mRNA的量以助诊 断,第30页/共50页,第31页/共50页,（三） -地贫的基因诊断第30页/共50页第31页/共5,二.杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD),DMD：是性连锁隐性遗传病,是由抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因突变(突变或缺失). 其突出特点为横纹肌进行性萎缩，引起无力和挛缩。DMD相对更为常见。DMD患儿在5岁前发病，20岁左右由于心力衰竭和呼吸衰竭而死亡，发病率在男性活婴中约1/3500 。,第

29、31页/共50页,第32页/共50页,二.杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular d,杜氏肌营养不良症的基因诊断,RFLP连锁分析:通过家系连锁分析,找出与突变基因相连锁的DNA多态性,并将其作为遗传标记追踪多态性在家族成员中的传递.基因组DNA探针法: 用突变高发区的常见序列作为探针,检测抗肌萎缩蛋白基因的相应变异.cDNA探针法:用较短的抗肌萎缩蛋白基因cDNA作为探针.比2方便、检出率高.多重PCR法:对基因突变较集中的区域,设计多对引物,扩增基因相应的突变高发区,检测相应的基因突变.,第32页/共50页,第33页/共50页,杜氏肌营养不良症的基因诊断RFLP连锁分析:通过

30、家系连锁分析,第四节 用基因诊断技术检测肿瘤,肿瘤的发生涉及多个基因、多种因素、发生过程呈多阶段性、发生的分子机制十分复杂,因此对不同的肿瘤要采用不同的基因诊断策略.一.通过检测肿瘤染色体易位及融合基因诊断肿瘤淋巴造血系统肿瘤: 染色体易位及基因融合是较普遍的现象. 如:淋巴瘤和淋巴结反应性增生.它是由于T细胞受体(TCR)基因和IgH基因重排,使原来相隔数百个碱基的IgH和TCR基因的V区和J区靠近在一起.用PCR扩增该区域片段,通过长度分析就能判断是否发生了基因重排.,第33页/共50页,第34页/共50页,第四节 用基因诊断技术检测肿瘤 肿瘤的发生涉及多个基因、,二.通过检测癌基因和抑癌

31、基因诊断肿瘤,癌基因的激活及抑癌基因的失活与肿瘤的发生密切相关.大多人类肿瘤组织或细胞中都能检测到癌基因和(或)抑癌基因的突变1.癌基因-ras与肿瘤: ras是肿瘤中最常被激活的癌基因.激活的分子机制主要是点突变,高发区是第12 、13和61位密码子.如90%的胰腺癌,50%的结直肠癌和1/3的肺腺癌都在是K-ras基因第12位密码子突变. ras癌基因点突变检测方法: 法:检测速度快，灵敏度高，检测样品量大等优点； 但点突变的检出仅限于寡核苷酸探针的探测位点和突变类 型。 法：根据PCR扩增的目标DNA片段在非变性凝胶电泳中迁移率，将突变基因检测出来。该法检测点突变更方便； 缺点：不能检测

32、出突变的具体位点和具体类型。,第34页/共50页,第35页/共50页,二.通过检测癌基因和抑癌基因诊断肿瘤 癌基因的激活及抑癌,通过检测癌基因和抑癌基因诊断肿瘤（续）,2 .P53基因与肿瘤：p53基因是最常被失活的抑癌基 因，失活的分子机制主要是基因突变，也有因为基 因表达异常而使p53失活，约50%以上的恶性肿瘤有 p53基因突变。 突变类型：130290密码子间常发生点突变，也有少量的插入或缺失突变。 基因检测方法： PCR-SSCP:可检出有无突变 PCR-RFLP:通过内切酶位点的消 失或增加检测p53的基因突变。,第35页/共50页,第36页/共50页,通过检测癌基因和抑癌基因诊断

33、肿瘤（续） 2 .P53基因与肿,已经发现多种病毒与肿瘤的发生有关，它们有DNA病毒，也有RNA病毒,其中逆转录病毒(retro-virus)对动物细胞的致瘤作用已得到公认.还发现一些与人肿瘤发生有关的病毒如:,第36页/共50页,第37页/共50页,已经发现多种病毒与肿瘤的发生有关，它们有DNA病毒，也,mRNA诊断肿瘤,肿瘤标志物（tumor marker)是由肿瘤组织细胞产生的，与肿瘤形成和发展相关的物质，包括：肿瘤抗原，激素，酶和同工酶。仅存在肿瘤细胞中。 类型：基因标志：是指基因本身突变和异常表达，能反映癌前启动阶段的变化。基因表型标志：基因产物表达和调控异常，表现为所编码的表达产物

34、合成紊乱，产生胚胎性抗原，一般出现较晚。 基因诊断方法： 基因变异导致肿瘤标记物的产生或含量改变，可选择：PCR-RFLP,PCR-ASO,PCR-测序，PCR-SSCP等技术。 导致肿瘤标记物产生或含量改变分子机制不清楚，可用RT-PCR技术检测肿瘤标记物mRNA的存在或含量的改变。如：端粒活性酶活性被用来作为肿瘤标记物，在肿瘤细胞中该酶的活性增高。,第37页/共50页,第38页/共50页,mRNA诊断肿瘤肿瘤标志物（tumor marker)是由肿,第五节 感染性疾病的基因诊断,每种病原体都有各自特异的遗传物质,可以是DNA,也可以是RNA.每种病原生物都有各自种属特异的基因. 一.病毒感

35、染性疾病的诊断 a.乙型肝炎病毒: 目前采用免疫法检测血清中病毒抗原. HBV基因组包含4个开放阅读框,S、C 、P和X区,C区变异性小,是基因诊断采用的目标部位.在用PCR检测时可扩增HBV的特异核苷酸序列,通过PCR产物的直接电泳分析、或内切酶谱分析、或点杂交、或Southern印迹等结果作出判断.也可采用基因芯片技术.,第38页/共50页,第39页/共50页,第五节 感染性疾病的基因诊断 每种病原体都有各自特异,b.传染性非典型肺炎(SARS): 是由新型变异冠状病毒(SARS-CoV)感染引起. SARS-CoV基因组为正链单股RNA,有11个开放阅读框,基因组的特异保守序列为编码RN

36、A聚合酶的序列. 基因诊断方法: 采用RT-PCR技术扩增保守序列 DNA芯片二.诊断细菌感染性的疾病 用PCR技术通过对致病细菌所含质粒的特异序列,设计引物,检测引起的疾病的细菌类型.,第39页/共50页,第40页/共50页,b.传染性非典型肺炎(SARS):第39页/共50页第4,第五节 基因诊断存在的问题与发展前景,一.基因诊断技术应用存在的问题 1.理论问题 目前找到的致病基因不多,由多基因及基因 与环境互作所引发多种疾病的分子机制还不 清楚 2.技术问题 设备条件;操做人员;污染造成的假阳性. 3.伦理问题二.发展前景,第40页/共50页,第41页/共50页,第五节 基因诊断存在的问

37、题与发展前景一.基因诊断技术应用存在,结束语,基因诊断利用分子生物学技术,从DNA/RNA水平检测基因的存在、分析基因的结构变异和表达状态,从而对疾病作出诊断.基因诊断的基本技术是核酸分子杂交和PCR扩增.前者是最直接、最准确的基因诊断技术,后者则是应用前景最为广阔的诊断技术.目前,基因诊断技术已广泛地应用到遗传病、肿瘤和感染性疾病的诊断.随着医学和分子生物学技术的不断发展,基因诊断技术将会更加广泛.,第41页/共50页,第42页/共50页,结束语 基因诊断利用分子生物学技术,从DNA/RNA水,(4)PCR+变性梯度凝胶电泳分析技术,双链DNA在一定浓度变性剂(尿素,甲酰胺)作用下,会变性而

38、解链,导致DNA分子电泳迁移率变化.当在不同梯度浓度变性胶中电泳时, DNA泳动到变性剂浓度能使DNA发生变性，DNA开始解链，从而不同的DNA片段会形成不同的迁移率条带优点：可靠，检出单碱基突变率可达缺点：富含高熔点GC区时，则难以检测出突变,第42页/共50页,第43页/共50页,(4)PCR+变性梯度凝胶电泳分析技术 双链DNA在一定,(4)PCR+变性梯度凝胶电泳分析技术,双链DNA在一定浓度变性剂(尿素,甲酰胺)作用下,会变性而解链,导致DNA分子电泳迁移率变化.当在不同梯度浓度变性胶中电泳时, DNA泳动到变性剂浓度能使DNA发生变性，DNA开始解链，从而不同的DNA片段会形成不同

39、的迁移率条带优点：可靠，检出单碱基突变率可达缺点：富含高熔点GC区时，则难以检测出突变,第43页/共50页,第44页/共50页,(4)PCR+变性梯度凝胶电泳分析技术 双链DNA在一定,二.通过连锁遗传标志检测诊断疾病,许多基因病，虽然它们的基因结构还没有阐明，但通过染色体分析已被定位在染色体的特定位置上，这些基因是通过检测与特定染色体位点连锁的遗传标记来发现的。 原理：同一染色体上位置十分靠近的相邻基因或其它遗传标记，在遗传过程中分离的几率很低，常常一起遗传，形成连锁。可以通过一个或几个基因或遗传标记的分析，了解另一个或几个基因。,第44页/共50页,第45页/共50页,二.通过连锁遗传标志

40、检测诊断疾病 许多基因病，虽然它们,二.通过连锁遗传标志检测诊断疾病,许多基因病，虽然它们的基因结构还没有阐明，但通过染色体分析已被定位在染色体的特定位置上，这些基因是通过检测与特定染色体位点连锁的遗传标记来发现的。 原理：同一染色体上位置十分靠近的相邻基因或其它遗传标记，在遗传过程中分离的几率很低，常常一起遗传，形成连锁。可以通过一个或几个基因或遗传标记的分析，了解另一个或几个基因。,第45页/共50页,第46页/共50页,二.通过连锁遗传标志检测诊断疾病 许多基因病，虽然它们,一. 血红蛋白病的基因诊断,分为异常血红蛋白病和地中海贫血,前者是由于珠蛋白的基因突变；后者是由于珠蛋白合成速率降

41、低，a链和b链合成不平衡。（一）异常血红蛋白病的基因诊断： 如镰状红细胞贫血病:链第六位氨基酸:GAA(谷)GUA(颉)代替. 对该病的基因诊断应采用: 1)PCR+限制酶切,即用PCR从患者基因组扩增含突变位点的珠蛋白基因片段,再选适当的内切酶消化PCR产物,根据电泳图谱上片段数量和大小做出判断 2)Southern 印迹杂交分析,第46页/共50页,第47页/共50页,一. 血红蛋白病的基因诊断 分为异常血红蛋白病和地中海贫血,一. 血红蛋白病的基因诊断,分为异常血红蛋白病和地中海贫血,前者是由于珠蛋白的基因突变；后者是由于珠蛋白合成速率降低，a链和b链合成不平衡。（一）异常血红蛋白病的基

42、因诊断： 如镰状红细胞贫血病:链第六位氨基酸:GAA(谷)GUA(颉)代替. 对该病的基因诊断应采用: 1)PCR+限制酶切,即用PCR从患者基因组扩增含突变位点的珠蛋白基因片段,再选适当的内切酶消化PCR产物,根据电泳图谱上片段数量和大小做出判断 2)Southern 印迹杂交分析,第47页/共50页,第48页/共50页,一. 血红蛋白病的基因诊断 分为异常血红蛋白病和地中海贫血,b.传染性非典型肺炎(SARS): 是由新型变异冠状病毒(SARS-CoV)感染引起. SARS-CoV基因组为正链单股RNA,有11个开放阅读框,基因组的特异保守序列为编码RNA聚合酶的序列. 基因诊断方法: 采

43、用RT-PCR技术扩增保守序列 DNA芯片二.诊断细菌感染性的疾病 用PCR技术通过对致病细菌所含质粒的特异序列,设计引物,检测引起的疾病的细菌类型.,第48页/共50页,第49页/共50页,b.传染性非典型肺炎(SARS):第48页/共50页第4,第五节 基因诊断存在的问题与发展前景,一.基因诊断技术应用存在的问题 1.理论问题 目前找到的致病基因不多,由多基因及基因 与环境互作所引发多种疾病的分子机制还不 清楚 2.技术问题 设备条件;操做人员;污染造成的假阳性. 3.伦理问题二.发展前景,第49页/共50页,第50页/共50页,第五节 基因诊断存在的问题与发展前景一.基因诊断技术应用存在,基因诊断课件全面版,