基因诊断与基因治疗生物化学课件.ppt
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1、基因诊断与基因治疗Gene Diagnosis and Gene Therapy,基因诊断与基因治疗生物化学,基因诊断与基因治疗生物化学,一、基因诊断的概念、特点及临床意义,定义: 利用分子生物学技术,通过检测基因及基因表达产物的存在状态,对人体疾病作出诊断的方法。基因诊断检测的目标分子是DNA、RNA,也可以是蛋白质或者多肽。,基因诊断与基因治疗生物化学,一、基因诊断的概念、特点及临床意义 定义:基因诊断与基因治疗,诊断依据(遗传物质改变)DNA、RNA或蛋白质水平变化,如病毒基因及其转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平从低到高;基因结构变化,如点突变引起基因失活、染色体转位引起基因异常激
2、活或灭活。,基因诊断与基因治疗生物化学,诊断依据(遗传物质改变)基因诊断与基因治疗生物化学,基因诊断的特点高特异性高灵敏性早期诊断性应用广泛性,基因诊断与基因治疗生物化学,基因诊断的特点基因诊断与基因治疗生物化学,二、基因诊断中常用的分子生物学技术,核酸分子杂交(Nucleic acid hybridization) 聚合酶链式反应(PCR) 单链构象多态性(SSCP) 限制性片段长度多态性(RFLP) DNA序列测定(DNA sequencing) 生物芯片(biochips) Western免疫印迹(Western blotting) 免疫组织化学诊断,基因诊断与基因治疗生物化学,二、基因
3、诊断中常用的分子生物学技术核酸分子杂交(Nuclei,单链构象多态性分析(single-strand conformation polymorphism, SSCP),DNA 的突变造成DNA片段中碱基序列不同,变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的构象不同(单链构象多态性),利用迁移率的差别可使各种序列不同的单链分离开来。,基因诊断与基因治疗生物化学,单链构象多态性分析(single-strand confo,PCR-SSCP分析原理示意,基因诊断与基因治疗生物化学,PCR-SSCP分析原理示意基因诊断与基因治疗生物化学,正常人,纯合突变,杂合突变,+,PCR-SSCP分析,基因诊断与基因治疗
4、生物化学,正常人纯合突变杂合突变+ PCR-SSCP分析 基,限制性片段长度多态性分析 (restriction fragment length polymorphism, RFLP),由于DNA 变异产生新的酶切位点或原有的酶切位点消失,在用限制性核酸内切酶消化时产生不同长度或不同数量的片段。 可借助核酸分子杂交或PCR进行检测。,基因诊断与基因治疗生物化学,限制性片段长度多态性分析 (restriction fr,设计适当的扩增引物,使扩增片段包括某一个或数个限制性内切酶识别序列,在PCR扩增后用该限制酶切割PCR产物,根据电泳后酶切片段长度变化,即可作出诊断。,PCR-RFLP,基因诊断
5、与基因治疗生物化学,设计适当的扩增引物,使扩增片段包括某一,GAATTC,CTTAAG,EcoR 限制性内切酶位点的变化,基因诊断与基因治疗生物化学,ABCDEFGDEFBGCAGAATTCCTTAAGEF,DNA序列测定 (双脱氧末端终止法),基因诊断与基因治疗生物化学,DNA序列测定 (双脱氧末端终止法)基因诊断与基因治疗生物化,左侧:正常;右侧突变,序列分析用于基因诊断研究,基因诊断与基因治疗生物化学,左侧:正常;右侧突变 序列分析用于基因诊断研究基因诊断与基因,基因芯片杂交流程示意图,基因诊断与基因治疗生物化学,基因芯片杂交流程示意图基因诊断与基因治疗生物化学,基因诊断中常用的分子生物
6、学方法比较,基因诊断与基因治疗生物化学,基因诊断中常用的分子生物学方法比较方法优点与问题解决方案核酸,基因诊断技术路线与方法,直接诊断:直接分析致病基因分子结构及表达是否异常间接诊断:利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析,根据对致病基因或相关基因的了解程度决定基因诊断的技术途径选择。,基因诊断与基因治疗生物化学,基因诊断技术路线与方法 根据对致病基,(一)直接诊断途径,必要条件: 被检测基因变化与疾病发生有直接因果关系 被检基因正常分子结构已被确定 被检基因致病的分子机制(突变位点或表达变化)已知,基因诊断与基因治疗生物化学,(一)直接诊断途径 必要条件:基因诊断与基因治疗生物化学,5/,
7、5/,3/,3/,RFLP,1.点突变的检测(1)有限制性内切酶位点改变,基因诊断与基因治疗生物化学,5/5/3/3/RFLP1.点突变的检测基因诊断与,斑点杂交、反向斑点杂交AS-PCR、PCR-SSCP、 PCR-ASO、PCR产物直接测序,5/,5/,3/,3/,(2)无限制性酶切位点改变,基因诊断与基因治疗生物化学,斑点杂交、反向斑点杂交5/5/3/3/(2)无限制性,在DNA序列上有一段较长序列的重新排布。包括数十个碱基到数千个碱基的丢失、插入、替换、重复和倒位等,以及染色体突变或畸变,包括染色体的易位、缺失或染色三体(如唐氏综合征)等。,2. 基因重排的检测,核酸分子探针杂交与PC
8、R,基因诊断与基因治疗生物化学,在DNA序列上有一段较长序列的重新排布。包括,BamHI,BamHI,2,1,2,10 kb,14 kb,probe,-珠蛋白生成障碍性贫血的直接基因诊断,-珠蛋白基因不同程度的缺失可引起不同类型的-珠蛋白生成障碍性贫血,基因诊断与基因治疗生物化学,BamHIBamHI212 10 kb14 kbpro,根据引物3端的互补与否,设计一对与正常或突变模板配对的特异引物,等位基因特异PCR AS-PCR(allele specific PCR),基因诊断与基因治疗生物化学,根据引物3端的互补与否,设计一对与正常或突,3. 基因表达异常的检测 mRNA的相对定量分析
9、mRNA的绝对定量分析 mRNA长度分析,基因诊断与基因治疗生物化学,3. 基因表达异常的检测基因诊断与基因治疗生物化学,(二)间接诊断途径,1.采用原因致病基因未知或基因结构不确定致病突变机制不清致病位点不便检测,基因诊断与基因治疗生物化学,(二)间接诊断途径1.采用原因基因诊断与基因治疗生物化学,DNA多态性:指群体中的DNA分子存在至少两种不同的类型,即个体间同一染色体的相同位置上核苷酸序列存在一定的差异或变异。 多在进化中形成,本身并不致病,只是与某些遗传性致病基因有一定连锁关系。,2. 遗传标记,基因诊断与基因治疗生物化学,2. 遗传标记基因诊断与基因治疗生物化学,间接诊断:检测与致
10、病基因连锁的遗传标记,三代遗传标记: RFLP(基于核酸分子杂交技术) VNTR (variable number of tandem repeats) ; STR (short tandem repeats) SNP(single nucleotide polymorphism),基因诊断与基因治疗生物化学,间接诊断:检测与致病基因连锁的遗传标记三代遗传标记:基因诊断,7.6kb,13kb,患者,正常,HBS的间接基因诊断 RFLP标记的连锁分析,Hap,7.6kb,13kb,Southern印迹杂交,N H P,N:正常;H:杂合子;P:患者(纯合子);黄色区域为探针,基因诊断与基因治疗生
11、物化学,7.6kb13kb患者正常 HBS的间接基因诊断,遗传病的基因诊断Gene Diagnosis of Hereditary Diseases,基因诊断与基因治疗生物化学,遗传病的基因诊断Gene Diagnosis of H,一、血红蛋白病(hemoglobinopathy) (一)镰状细胞贫血病 (二)-珠蛋白生成障碍性贫血症 二、血友病(Hemophilia) 甲型血友病基因诊断 三、脆性X综合征,基因诊断与基因治疗生物化学,一、血红蛋白病(hemoglobinopathy) 基因诊断,(一)镰状细胞贫血病,一、血红蛋白病,1.镰状红细胞贫血患者基因诊断ASO杂交法2.HBS的限制
12、性内切酶谱分析3.HBS的PCR-RFLP分析,基因诊断与基因治疗生物化学,(一)镰状细胞贫血病一、血红蛋白病1.镰状红细胞贫血患者基,正常的(N)的ASO探针: 5-ACT CCT GAG GAG AAG TCT GC-3 突变的(M)的ASO探针: 5-ACT CCT GTG GAG GAAG TCT GC-3,1.镰状红细胞贫血患者基因诊断ASO杂交法,基因诊断与基因治疗生物化学,正常的(N)的ASO探针:1.镰状红细胞贫血患者基因诊断A,斑点杂交结果 N:正常;M突变,镰状红细胞贫血患者ASO杂交法检测,N-ASO,M-ASO,正常 突变 突变纯合子 杂合子 纯合子,基因诊断与基因治疗
13、生物化学,斑点杂交结果 N:正常;M突变镰状红细胞贫血患者ASO杂交法,5,3,正常基因,1.15kb,(CCT GAG G),突变基因,1.35kb,(CCT GTG G),镰状红细胞贫病的限制性内切酶谱分析,Mst酶切位点(CCTNAGG),2. HBS的限制性内切酶谱分析,目 录,基因诊断与基因治疗生物化学,53正常基因1.15kb(CCT GAG G)53,0.2kb,1.15kb,1.35kb,正常人,突变携带者,患者,镰状红细胞贫血病的限制性内切酶谱分析,目 录,基因诊断与基因治疗生物化学,0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带者患者镰状红,3. HBS的PCR-RFLP
14、分析,正常人的扩增产物经 Mst 消化可生成54bp和56bp两个片段,而镰状细胞贫血症患者的DNA片段不被酶切,仍为110bp,杂合子可见三条带,正常人,杂合体,患者,Marker,基因诊断与基因治疗生物化学,3. HBS的PCR-RFLP分析 正常人的扩增产物经,1. PCR-RFLP分析,-珠蛋白生成障碍性贫血症基因密码子17突变的检测 M:pBR322 DNA/Msp I; 1:未酶解片段; 2:bA/ bA; 3:bA/ bT; 4:bT/ bT注:由于54bp、114 bp、72 bp片段及分子量标准中低于200 bp的片段太小,在0.8的琼脂糖凝胶中不易被观察到,(二)-珠蛋白生
15、成障碍性贫血症,基因诊断与基因治疗生物化学,1. PCR-RFLP分析 -珠蛋白生成障碍性贫,-珠蛋白生成障碍性贫血症的反向斑点杂交分析,2. 反向斑点杂交,基因诊断与基因治疗生物化学,-珠蛋白生成障碍性贫血症的反向斑点杂交分析2. 反向斑点杂,二、血友病(Hemophilia),甲型血友病是由于血浆凝血因子VIII(FVIII)缺陷造成。甲型血友病的基因突变类型已有300余种,其中点突变占174种;另有部分患者是由于缺失或插入突变或内含子22的基因倒位所致。,基因诊断与基因治疗生物化学,二、血友病(Hemophilia)甲型血友病是由于血浆凝血因,1. FVIII基因倒位的DNA印迹分析,将
16、基因组DNA用Nco I,Dra I或Bcl I等内切酶(酶切位点位于交换点两侧)消化,用特异探针进行杂交分析,正常人表现为21.5 kb、14 kb和16 kb三种类型。I型倒位患者表现为20、17.5和14 kb三种类型;型倒位患者表现为20、16和15.5 kb三种带型。在一些重型甲型血友病家系中还有其他异常带型出现。,基因诊断与基因治疗生物化学,1. FVIII基因倒位的DNA印迹分析,2. FVIII基因突变的检测,(1)依赖于FVIII基因内或旁侧的多态性标记的连锁分析(2)RFLP连锁分析(3)VNTR分析(4)短串联重复序列(STR)的连锁分析,基因诊断与基因治疗生物化学,2.
17、 FVIII基因突变的检测(1)依赖于FVIII基因内或,三、脆性X综合征,脆性 X 智力低下基因1(FMR1)5非翻译区遗传不稳定的(CGG)n 三核苷酸重复序列的异常扩增以及相邻CpG 岛的异常甲基化。正常人中约为 850 拷贝。男性和女性携带者增多到52200拷贝,相邻的CpG 岛未被甲基化,称为前突变(premutation)。男性患者和脆性部位高表达的女性中,达到2001000拷贝,相邻的CpG岛也被甲基化,称为全突变(full mutation)。 全突变可关闭相邻FMR1基因的表达,FMR1 mRNA在几乎所有患者不表达或只有低表达,从而出现临床症状。,基因诊断与基因治疗生物化学
18、,三、脆性X综合征脆性 X 智力低下基因1(FMR1)5非翻,脆性X综合征常用基因诊断方法,1PCR-ASO 2DNA连锁分析 3Souhern印迹杂交法4PCR扩增,基因诊断与基因治疗生物化学,脆性X综合征常用基因诊断方法基因诊断与基因治疗生物化学,感染病的基因诊断 Gene Diagnosis of Infectious Diseases,目 录,基因诊断与基因治疗生物化学,感染病的基因诊断 Gene Diagnosis of,一、病毒性疾病,甲型肝炎病毒(HAV) HAV系RNA病毒,利用RT-PCR技术可从粪便中检测出甲型肝炎病毒的基因组RNA。 乙型肝炎病毒(HBV) 设计保守区序列
19、引物,扩增各型HBV DNA片段;设计位于可变区的引物扩增某一亚型HBV DNA,以便分型。丙型肝炎病毒(HCV) HCV为正链RNA病毒,先反转录成cDNA,再进行巢式PCR检测HCV。,目 录,基因诊断与基因治疗生物化学,一、病毒性疾病甲型肝炎病毒(HAV)目 录基因诊断与基因治,二、细菌引起的疾病,结核分枝杆菌 先设计一对特异性引物,用PCR技术扩增出一383 bp序列,再用探针杂交,灵敏度可达到100个细菌水平。幽门螺杆菌(HP) 主要采用PCR技术:检测HP染色体DNA特异片段;检测HP尿素酶A基因;用PCR-RFLP鉴别HP菌株。,基因诊断与基因治疗生物化学,二、细菌引起的疾病结核
20、分枝杆菌 基因诊断与基因治疗生物化学,三、寄生虫及衣原体感染,疟原虫 卡氏肺孢子虫衣原体感染 诊断方法:核酸杂交和PCR技术,基因诊断与基因治疗生物化学,三、寄生虫及衣原体感染疟原虫 基因诊断与基因治疗生物化学,肿瘤的基因诊断Gene Diagnosis of Malignant Tumors,基因诊断与基因治疗生物化学,肿瘤的基因诊断Gene Diagnosis of Mali,一、原癌基因与抑癌基因的检测 二、常见肿瘤的基因诊断 乳腺癌 结肠癌,基因诊断与基因治疗生物化学,一、原癌基因与抑癌基因的检测 基因诊断与基因治疗生物化学,一、原癌基因与抑癌基因的检测,1原癌基因的检测 ras 基因
21、家族由H-ras、K-ras和N-ras组成。最常见的突变是第12、13、59或第61位密码子的点突变。 胰腺癌、结肠癌、肺癌以K-ras突变为主,如第12位密码子突变,由编码甘氨酸的GGT突变为TGT、GTT或GAT,少数突变为GCT。 急性淋巴细胞白血病,慢性淋巴细胞白血病等以N-ras突变为主;泌尿系统肿瘤则以H-ras突变为主。,基因诊断与基因治疗生物化学,一、原癌基因与抑癌基因的检测1原癌基因的检测基因诊断与基因,PCR 及PCR-SSCP分析:扩增ras 基因第12位密码子点突变部位,再用SSCP技术进行分析,或者直接测序确定患者ras原癌基因的点突变。 核苷酸杂交技术(如ASO)
22、:检测ras基因第12位密码子点突变。,2. ras原癌基因突变常用的检测方法,基因诊断与基因治疗生物化学,PCR 及PCR-SSCP分析:扩,3抑癌基因p53的检测,53的基因诊断方法有 (1)PCR-SSCP分析技术 (2)DNA序列分析 (3)PCR-RFLP分析,基因诊断与基因治疗生物化学,3抑癌基因p53的检测 p53的基因诊断方法有基因诊断与基,基因诊断在法医学上的应用Application of Gene Diagnosis in Forensic Medicine,目 录,基因诊断与基因治疗生物化学,基因诊断在法医学上的应用Application of G,重复序列以各自核心序
23、列(重复单元)首尾相连多次重复,称为串联重复序列,其重复次数在人群中存在变异,形成多态性。串联重复序列散在分布于染色体上。重复单位625 bp长,称为小卫星DNA。重复单位26 bp长,如(TA)n, (CGG)n等,称为微卫星DNA。,一、DNA指纹与多态性遗传标记,基因诊断与基因治疗生物化学,重复序列以各自核心序列(重复单元)首尾相连多次重复,称为串联,人类DNA指纹图,基因诊断与基因治疗生物化学,人类DNA指纹图基因诊断与基因治疗生物化学,二、DNA指纹与法医学诊断,个体识别和亲子鉴定: DNA指纹技术是从基因水平检测DNA的高度多态性,个体识别率高。以往在刑事案件的法医学鉴定中应用的是
24、血型、血清蛋白型、红细胞酶型和HLA分型,个体分辨能力不够,只能排除,不能做到统一认证。,基因诊断与基因治疗生物化学,二、DNA指纹与法医学诊断个体识别和亲子鉴定: DNA指纹技,基因治疗的概念及策略 Concept and Strategy of Gene Therapy,目 录,基因诊断与基因治疗生物化学,基因治疗的概念及策略 Concept and Strat,基因治疗:指将目的基因通过基因转移技术(病毒载体介导或者非病毒载体介导的基因转移技术)导入靶细胞内,目的基因表达产物对疾病起治疗作用。,目 录,基因诊断与基因治疗生物化学,基因治疗:指将目的基因通过基因转移技术(病毒载体介导或者非
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