基因治疗的原理专业知识培训课件.ppt

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1、基因治疗的原理专业知识,基因治疗的原理专业知识,基因治疗分类,体细胞(somatic cell)基因治疗生殖细胞(germline)基因治疗,只限于某一体细胞的基因的改变只限于某个体的当代对缺陷的生殖细胞进行矫正当代及子代,基因治疗的原理专业知识,2,基因治疗分类体细胞(somatic cell)基因治疗只限于,一、基因治疗的策略,内容提要,二、基因转移技术,三、基因干预,基因治疗的原理专业知识,3,一、基因治疗的策略 内容提要二、基因转移技术 三、基因干预基,一、基因治疗的策略,基因治疗的原理专业知识,4,一、基因治疗的策略基因治疗的原理专业知识4,（一）基因置换（gene replacem

2、ent）,定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，以导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因。,目的：将缺陷基因的异常序列进行桥正。 对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变。,基因治疗的原理专业知识,5,（一）基因置换（gene replacement）,要实现基因置换，需要采用同源重组技术使相应的正常基因定向导入受体细胞的基因缺陷部位。,定向导入的发生率约1/100万，采用胚胎干细胞培养的方法，这种同源重组的检出率最高可达1/10。,基因治疗的原理专业知识,6,要实现基因置换，需要采用同源重组技术使相应的正常基因定向导入,（二） 基因添加,基因添加或称基因

3、增补（gene augmentation）: 通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。,类型:在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因，而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。,基因治疗的原理专业知识,7,（二） 基因添加 基因添加或称基因增补（gen,（三）基因干预基因干预（gene interference）: 采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。,基因治疗的原理专业知识,8,（三）基因干预基因治疗的原理专业知识8,

4、（四）自杀基因治疗自杀基因治疗:恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。原理:将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。,基因治疗的原理专业知识,9,（四）自杀基因治疗基因治疗的原理专业知识9,（五）基因免疫治疗,通过将抗癌免疫增强细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。,基因治疗的原理专业知识,10,（五）基因免疫治疗 通过将抗癌免疫增强细胞因子或MH,二、基因转移技术,基因治疗的原理专业知识,11,二、基因转移技术基因治疗的原理专业知识11,基因治疗的两种途径,载体,目

5、的基因,in vivo,ex vivo,靶细胞,基因治疗的原理专业知识,12,基因治疗的两种途径载体目的基因in vivoex vivo靶,基因转移(gene transfer)技术,1.病毒介导的基因转移系统。 2.非病毒介导的基因转移系统。,基因治疗的原理专业知识,13,基因转移(gene transfer)技术,1.病毒介导的基因转移系统,病毒载体介导的基因转移效率较高，因此它也是使用最多的基因治疗载体。据统计，有72%的临床实验计划和71%的病例使用了病毒载体，其中用得最多的是逆转录病毒载体。,基因治疗的原理专业知识,14,1.病毒介导的基因转移系统 病毒载体介导的基因转,Retrov

6、irus,逆转录病毒,基因治疗的原理专业知识,15,Retrovirus逆转录病毒 基因治疗的原理专业,逆转录病毒介导的基因转移系统由两部分组成：,(1) 逆转录病毒载体,(2) 辅助细胞株(如PA317),基因治疗的原理专业知识,16,逆转录病毒介导的基因转移系统由两部分组成： (,逆转录病毒载体的特点,逆转录病毒包膜上由env编码的糖蛋白，能够被许多哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别，从而使逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。,逆转录病毒结构基因gag、env和pol的缺失不影响其他部分的活性。,前病毒可以高效整合至靶细胞基因组中，有利于外源基因在靶细胞中的永久表达。,包装好的假病毒颗

7、粒（携带目的基因的重组逆转录病毒载体）以芽生的方式分泌至辅助细胞培养的上清液中，易于分离制备。,基因治疗的原理专业知识,17,逆转录病毒载体的特点逆转录病毒包膜上由env编,逆转录病毒载体的主要缺点,随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危险； 逆转录病毒载体的容量较小，只能容纳7 kb以下的外源基因。,基因治疗的原理专业知识,18,逆转录病毒载体的主要缺点 基因治疗的原,（2）腺病毒(adenovirus，AV)载体 腺病毒是一种大分子(36 kb)双链无包膜DNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。 腺病毒是

8、人类呼吸道感染的病原体，但目前尚未发现与肿瘤发生有关联。宿主细胞范围广，可感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。,基因治疗的原理专业知识,19,（2）腺病毒(adenovirus，AV)载体基因治疗,腺病毒的优点,1.基因导入效率高，对人类安全；,2.宿主范围广；,3.基因转导与细胞分裂无关；,4.重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注；,5.腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb外源基因；,基因治疗的原理专业知识,20,腺病毒的优点1.基因导入效率高，对人类安全；2.宿主范围广；,腺病毒载体缺点,2.宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。,3.有两个环节可能产生复制型腺病

9、毒。,4.靶向性差。,1.不能整合到靶细胞的基因组DNA中。分裂增殖快的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂而丢失的机会增多，表达时间相对较短。,(1)腺病毒产生过程中与293辅助细胞内E1区序列发生同源重组；(2)腺病毒载体与被治疗的患者体内已感染的野生型腺病毒，甚至乳头瘤病毒、巨细胞病毒发生重组。,基因治疗的原理专业知识,21,腺病毒载体缺点2.宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。,（3）腺病毒相关病毒载体 腺病毒相关病毒(adenovirus associated virus，AAV)是一类单链线状DNA缺陷型病毒。其基因组DNA小于5 kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。AAV不能独

10、立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。,基因治疗的原理专业知识,22,（3）腺病毒相关病毒载体AAV Virus P,AAV的特点, 以潜伏感染为主； 病毒基因组与细胞共存； 只要宿主细胞正常，AAV基因表达就处于抑制而维持潜伏状态； 若细胞受刺激，表达应激基因，AAV基因表达从而使AAV病毒复制； 产生子代病毒并释放，又感染新的细胞，建立新的潜伏状态。,基因治疗的原理专业知识,23,AAV的特点 以潜伏感染为主；基因治疗的原理专业知识23,AAV载体是目前正在研究的一类新型安全载体，它对人类无致病性。 AAV

11、可以高效定点整合至人19号染色体的特定区域19q13.4中，并能较稳定地存在。这种靶向定点整合可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性，而且外源基因可以持续稳定表达，并可受到周围基因的调控，兼具逆转录病毒载体和腺病毒载体两者的优点。,基因治疗的原理专业知识,24,AAV载体是目前正在研究的一类新型安全载体，它对,AAV载体的缺陷：,基因治疗的原理专业知识,25,AAV载体的缺陷：AAV载体容量小，目前最多只能,2.非病毒载体介导的基因转移系统 （1）脂质体介导的基因转移技术 脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。 基本原理:利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可以

12、自动形成包埋外源DNA的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源DNA（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。,基因治疗的原理专业知识,26,2.非病毒载体介导的基因转移系统基因治疗的原理专业知识26,（2）受体介导转移技术,将DNA与细胞或组织亲和性的配体偶联，可使DNA具有靶向性。这种偶联通常通过多聚阳离子（如多聚赖氨酸）来实现。多聚阳离子与配体共价连接后，又通过电荷相互作用与带负电荷的DNA结合，将DNA包围，只留下配体暴露于表面。这样形成的复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮，从而将外源DNA导入靶细胞。,基因治疗的原理专业知识,27,（2）受体介导转移技术 将DNA与细

13、胞或组织亲和,（3）基因直接注射技术 不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露基因DNA注入动物肌肉或某些器官组织内。 动物实验表明：接受注射外源DNA的小鼠能够按其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。 1.将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加30%40%； 2.将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素； 3.肌内注射凝血因子基因，可产生血友病所需的凝血因子等等。,基因治疗的原理专业知识,28,（3）基因直接注射技术基因治疗的原理专业知识28,基因治疗的原理专业知识培训课件,三、基因干预,基因治疗的原理专业知识,30,三、基因干预

14、基因治疗的原理专业知识30,基因干预的种类：,1.反义RNA (antisense RNA)2.干扰RNA (RNA interference)3.核酶 (ribozyme),基因治疗的原理专业知识,31,基因干预的种类：1.反义RNA (antisense RNA,（一）反义RNA 1. 反义RNA与基因表达调控 利用反义RNA对体外培养的细胞进行基因表达调控，通常采用的方法有两种： （1）体外合成反义RNA，直接作用于培养细胞，细胞吸收RNA后，发挥作用。 （2）构建能转录反义RNA的重组质粒，将质粒转入细胞，转录出反义RNA而发挥作用。,基因治疗的原理专业知识,32,（一）反义RNA基因

15、治疗的原理专业知,2.受体介导反义RNA技转移术,受体介导的RNA转移十分专一，而且效率高；被转移的RNA是被保护的，与周围环境之间存在多聚赖氨酸的保护层, 可以抵抗环境中的核酸酶的降解作用。,将脱唾液酸血清类粘蛋白（ASGP）与多聚赖氨酸（PL）共价连接，得到ASGP-PL复合物，成为运载核酸的工具。ASGP-PL反义RNA复合物可以专一性地被肝细胞表面的ASGP受体所识别，并吞噬到肝细胞中，反义RNA进入肝细胞后，可被逐渐释放出来发挥作用。,借助受体介导DNA转移方法把DNA换成反义RNA，就可以实现受体介导的反义RNA的转移。,基因治疗的原理专业知识,33,2.受体介导反义RNA技转移术

16、 受体介导的RNA转移十分,3. 反义RNA的应用前景,受体介导的反义RNA基因治疗有其自身的优点，而在一定程度上补充了转基因治疗的不足。,（l）安全性高,（2）反义RNA设计和制备方便,（3）具有剂量调节效应,（4）能直接作用于一些RNA病毒,反义RNA只作用于特异的mRNA分子，不改变所调节基因的结构。反义RNA分子无论怎样修饰，最终将在细胞内部被降解，不留“残渣”。,在治疗RNA病毒感染性疾病时，受体介导的反义RNA基因治疗比一般的DNA基因治疗有更大的优势。利用反义RNA可以直接作用于病毒RNA，阻断RNA病毒的繁殖。,基因治疗的原理专业知识,34,3. 反义RNA的应用前景 受体介导

17、的反义RNA,（二）干扰RNA,实验结果显示，有义链RNA（sense RNA）或反义链RNA（antisense RNA）均能抑制线虫基因的表达，双链RNA比单链RNA更为有效。将特异的双链RNA注入线虫体内可抑制有同源序列的基因的表达。得到的结果是有义链RNA和反义链RNA都同样阻断基因表达途径。这与传统上对反义RNA技术的解释正好相反。而且其抑制基因表达的效率比反义RNA至少高2个数量级。,1.RNA干扰现象,RNA干扰（RNA interference， RNAi）是一种由双链RNA诱发的基因沉默现象。在此过程中，与双链RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，从而抑制该基因的表

18、达。,对RNA干扰的认识来源于用线虫（C. elegans）和果蝇所进行的实验。,基因治疗的原理专业知识,35,（二）干扰RNA 实验结果显示，有义链RNA（se,2.RNA干扰的机制,RNA干扰过程主要有2个步骤：,（1）小干扰性RNA（siRNA）,（2）siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex, RISC)。,该复合体可识别与siRNA有同源序列的mRNA，并在特异的位点将该mRNA切断。,长双链RNA被细胞内的双链RNA特异性核酸酶Dicer切成21-23个碱基对的短双链RNA，称为小干扰性RN

19、A（small interfering RNA，siRNA）。,基因治疗的原理专业知识,36,2.RNA干扰的机制RNA干扰过程主要有2个步骤：（1）小,3.RNA干扰的应用前景 RNA干扰研究目前已经在功能基因组学研究、微生物学研究、基因治疗和信号转导等广泛领域取得了令人瞩目的进展，使其在医学、生物学领域的应用有着广阔的前景。,基因治疗的原理专业知识,37,3.RNA干扰的应用前景基因治疗的原理专业知识37,（1） 研究基因功能的新工具,由于 RNA干扰技术具有高度的序列专一性和有效的干扰能力，可以使特定基因沉默或功能丧失，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。,RNA干扰技术能够

20、在哺乳动物中抑制特定基因的表达，建立多种表型；抑制基因表达的时间可以控制在发育的任何阶段，产生类似基因敲除的效应。,基因治疗的原理专业知识,38,（1） 研究基因功能的新工具 由于 RNA干扰技,（2） 肿瘤的基因治疗,传统反义RNA技术诱发的单一癌基因的阻断，不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，而RNA干扰技术可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一区段序列的双链RNA分子，只使用一种双链RNA即可以产生多个基因同时剔除的表型，也可以同时使用多种双链RNA而将多个序列不相关的基因同时剔除。RNA干扰技术可用于治疗有异常基因表达的恶性肿瘤。,K-RAS蛋白为

21、肿瘤发生所必需，bcr/ab1融合基因与人白血病有关，用RNA干扰技术可以阻碍K-RAS蛋白的表达从而抑制肿瘤发生，或杀死有bcr/ab1的人白血病细胞系。 通过RNA干扰抑制某些内源性基因的表达，能促进白血病细胞系的细胞凋亡或增加其对化疗药物的反应性。 应用RNA干扰技术成功地阻断了MCF-7乳腺癌细胞中一种异常表达的与细胞增殖分化相关的核转录因子基因Sp1的功能。,基因治疗的原理专业知识,39,（2） 肿瘤的基因治疗 传统反义RNA技术诱,（3） 病毒性疾病的基因治疗 RNA干扰可以被看成是一种与免疫系统类似的防御机制。用siRNA抑制人类免疫缺陷病毒（HIV）某些基因的表达，如P24、V

22、if、nef、tat或rev，阻碍HIV在细胞内复制。用RNA干扰技术抑制HIV的受体（CD4）或辅助受体（CXCR4或CCR5）在细胞内表达，可阻碍HIV感染细胞。也可通过RNA干扰抑制其他病毒在细胞内复制，如脊髓灰质炎病毒、人乳头状瘤病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒等。,基因治疗的原理专业知识,40,（3） 病毒性疾病的基因治疗 基因治疗的原理专业知,siRNA在病毒感染的早期阶段能有效地抑制病毒的复制，病毒感染能被针对病毒基因和相关宿主基因的siRNA所阻断，RNA干扰技术将成为一种有效的抗病毒治疗手段。这对于许多严重的病毒性疾病的防治具有十分重大的意义。,基因治疗的原理专业知识,41,

23、siRNA在病毒感染的早期阶段能有效地抑,（三）核酶(ribozyme),天然核酶多为单一的RNA分子，具有自我剪切作 用。但核酶也可以由两个RNA分子组成。,在基因治疗时，利用核酶分子结合到靶RNA分子中适当的邻位，形成锤头核酶结构，将靶RNA分子切断，通过破坏靶RNA分子达到治疗疾病（如清除病毒基因组RNA）的目的。 只要两个RNA分子通过互补序列相结合，形成锤头状的二级结构（3个螺旋区），并能组成核酶的核心序列（13个或11个保守核苷酸序列），就可在锤头右上方产生剪切反应。,基因治疗的原理专业知识,42,（三）核酶(ribozyme) 天然核酶多为,1. 核酶的设计,核酶是通过靶RNA分

24、子与核酶分子共同组成酶活性结构域，要从靶分子和核酶分子两个方面来设计核酶。,（1）选择合适的靶部位，该部位具有核酶切割位点，能与核酶分子结合并组成酶活性结构域。,（2）核酶的基本组成：用于基因治疗的核酶分子由三个部分组成，中间是保守序列（能够组成酶活性结构域），两端是引导序列。,在基因治疗中，主要是根据治疗的靶基因序列的特点，设计和合成特定的核酶。设计的基本原则是核酶分子与靶部位结合后能形成酶活性结构域。,基因治疗的原理专业知识,43,1. 核酶的设计 核酶是通过靶RNA分子与核酶分,核酶的作用机制,基因治疗的原理专业知识,44,核酶的作用机制 基因治疗的原理专业知识44,2.核酶的应用,与一般的反义RNA相比，核酶具有较稳定的空间结构，不易受到RNA酶的攻击。更重要的是，核酶在切断mRNA后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合和切割其它的mRNA分子。,基因治疗的原理专业知识,45,2.核酶的应用 与一般的反义RNA相比，核,Good night!,基因治疗的原理专业知识,46,Good night!基因治疗的原理专业知识46,