基因工程载体课件.ppt

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1、基因工程常用载体,1,-,基因工程常用载体1-,2,-,2-,3,-,3-,4,-,4-,5,-,5-,6,-,6-,7,-,7-,8,-,8-,9,-,9-,10,-,10-,11,-,11-,12,-,12-,13,-,13-,14,-,14-,15,-,15-,16,-,16-,17,-,17-,18,-,18-,19,-,19-,20,-,20-,21,-,21-,22,-,22-,23,-,23-,24,-,24-,25,-,25-,26,-,26-,27,-,27-,28,-,28-,29,-,29-,30,-,30-,31,-,31-,32,-,32-,33,-,33-,34,-

2、,34-,35,-,35-,36,-,36-,37,-,37-,38,-,38-,39,-,39-,40,-,40-,41,-,41-,42,-,42-,43,-,43-,44,-,44-,45,-,45-,46,-,46-,47,-,47-,48,-,48-,49,-,49-,50,-,50-,51,-,51-,52,-,52-,53,-,53-,END!,THANDS FOR YOUR COMING!,54,-,END!THANDS FOR YOUR COMING!54-,在大肠杆菌的各种菌株中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较洋尽研究的主要有F成粒、R质粒和C。l质位由于这些成

3、粒的存在，寄主细胞便获得了各自不同的性状特征，根据这些特征来鉴别这三种不同类型的质粒； F质粒 又叫 F因子或性质粒（Sex plasmid)。它们能够使寄主染色淬上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。 R质粒 通称抗药性因子。它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺乏该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌索抗性能力。 Col质粒 即所谓产生大肠杆菌素因子。它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌素是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。,大肠杆菌菌株中不同类型的质粒,55,-,在大肠杆菌的各种菌株中找到了许多

4、种不同类型的质粒，其中已经作,噬菌体载体的构建,野生型噬菌体DNA全长约50kb，上有65种限制酶酶切点，除Apa、Nae、Nar、Nhe、Sna B、Xba和Xho等7种限制酶各有一个切点外，其余都多于2个。有些酶切点在增殖所必需的基因区域内。因此，噬菌体必须经过改造才能用作载体。现在用的载体大都除去了某种限制酶的酶切点。因此，作为载体的噬菌体都短于野生型。,56,-,噬菌体载体的构建野生型噬菌体DNA全长约50kb，上有,噬菌体载体有两种类型,插入型。由于改建后的噬菌体DNA都短于野生型，所以可插入外源DNA。只要插入的位置不影响噬菌体增殖。而且噬菌体DNA缺失越长，插入片段就可越大。置换

5、型。噬菌体的基因组可分为三个区域，左侧区包括使噬菌体DNA成为一个成熟的、有外壳的病毒颗粒所需的全部基因，全长约20kb。右侧区内包含所有的调控因子、与DNA复制及裂解宿主菌有关的基因，这个区域约长12kb。中间区域约长18kb，这一段DNA可以被外源置换而不会影响噬菌体裂解生长的能力。置换型噬菌体是使用最广泛的载体。,57,-,噬菌体载体有两种类型插入型。由于改建后的噬菌体DNA都,噬菌体裂解生长的能力同包装在头蛋白中的DNA的大小有关。当DNA的长度短于野生型的78%或超过105%时，噬菌体的活性就急剧下降。因此要求载体DNA和外源DNA长度之和在3953kb之间。,58,-,噬菌体裂解生

6、长的能力同包装在头蛋白中的DNA的大小有关。,置换型载体DNA用选定的限制酶完全酶切后，要设法除去中间片段，只留下左臂和右臂以便用外源DNA片段连接，包装成重组噬噬体。这是因为左臂和右臂与中间片段间都有单链“粘性末端”，在连接酶作用下可以重新恢复原来的结构，从而影响了同外源DNA的连接。区分重组噬菌体形成的噬菌斑和重新恢复的载体噬菌体形成的噬菌斑的方法是用Xgal蓝色噬菌斑试验。有些噬菌体载体的中间片段带有编码半乳糖苷酸的基因。当这种噬菌体感染lac宿主细胞并在含有Xgal(5溴4氯3吲哚D半乳糖苷)的培养基上生长时，半乳糖苷酸与Xgal反应的产物为不溶性的靛蓝染料。因此，含有中间片段的重新恢

7、复的噬菌体形成蓝色噬菌斑；而同外源DNA连接的重组噬菌体形成的噬菌斑是无色透明的。,59,-,置换型载体DNA用选定的限制酶完全酶切后，要设法除去中间片段,单链噬菌体载体(M13),最常用的单链噬菌体载体是M13和它的改建噬菌体。M13是丝状噬菌体，有长约6500个核苷酸的闭环DNA基因组。M13附着在大肠杆菌的F性菌毛上，所以它们只能感染雄性细菌，即F或Hfr细菌。当噬菌体进入细菌细胞后，单链的噬菌体DNA转变成双链复制型(RF)。从细胞中分离的RF可用作克隆双链DNA的载体。当每个细菌细胞里积聚了200到300份RF型拷贝时，M13开始不对称的合成，即只大量合成DNA双链中的一条链。单链D

8、NA掺入成熟的噬菌体颗粒，颗粒不断地从感染细胞上芽生。M13感染虽不杀死细胞，但细胞的生长受到一定的抑制，所以形成混浊的噬菌斑。,60,-,单链噬菌体载体(M13)60-,M13的基因组中除有一段507个核苷酸，其余都含有与其复制有关的遗传信息。因此，只有在这一段中可插入外源DNA而不致影响噬菌体的活性。用M13作为分子克隆载体的优点是从细菌中释放出来的噬菌体颗粒只含单链DNA，其中包含了克隆DNA片段的二条互补链中的一条，因此可用来作为对DNA测序的模板。另外，可用来产生单链的DNA探针以选择和分离互补的RNA。M13的RF型是双链DNA，便于限制酶的识别和切割，克隆进双链的外源DNA。从细菌培养液中大量抽取单链DNA。问题是插入M13的外源DNA超1000bp时就不稳定，在噬菌体增殖时会出现缺失。一般说，插入300400bp是相当稳定的。,61,-,M13的基因组中除有一段507个核苷酸，其余都含有与其复制有,