基因在大肠杆菌酵母中的高效的表达培训课件.ppt
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1、基因在大肠杆菌酵母中的高效的表达,基因在大肠杆菌酵母中的高效的表达,最佳的基因表达体系:目的基因的表达产量高;表达产物稳定;生物活性高;表达产物容易分离纯化。,第一节基因的表达系统与表达策略,基因在大肠杆菌酵母中的高效的表达,2,最佳的基因表达体系:第一节基因的表达系统与表达策略基因在大肠,宿主细胞的选择,一、适合目的基因表达的宿主细胞的要求: 1、容易获得较高浓度的细胞; 2、能利用易得廉价原料; 3、不致病、不产生内毒素; 4、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态; 5、容易进行代谢调控; 6、容易进行DNA重组技术操作; 7、产物的产量、产率高, 8、产物容易提取纯化。,基因在大肠
2、杆菌酵母中的高效的表达,3,宿主细胞的选择一、适合目的基因表达的宿主细胞的要求:基因在大,二、宿主细胞分为两大类:1、原核细胞:常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、 链霉菌等;2、真核细胞:常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。,基因在大肠杆菌酵母中的高效的表达,4,二、宿主细胞分为两大类:基因在大肠杆菌酵母中的高效的表达4,大肠杆菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。优越性:对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解。有各类菌株和载体系列。目前以实现多种基因的高效表达。表达基因产物形式多样:细胞内不溶性表达(包含体)、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等。
3、易培养,成本低。,基因在大肠杆菌酵母中的高效的表达,5,大肠杆菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。基因在,缺点:大肠杆菌中的表达不存在信号肽,产品多为胞内产物,提取困难。因分泌能力不足,真核蛋白质常形成不溶性的包含体,表达产物需经变性复性才恢复活性。蛋白质不能糖基化。产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基。其内毒素很难除去。,基因在大肠杆菌酵母中的高效的表达,6,缺点:基因在大肠杆菌酵母中的高效的表达6,酵母 酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。其基因组小,世代时间短,有单倍体双倍体两种形式,繁殖迅速,无毒性。能外分泌,产物可糖基化。已有不少真核基因成功表达。,基因在大肠杆菌酵
4、母中的高效的表达,7,酵母 酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。其基,基因表达的基本过程,基因在大肠杆菌酵母中的高效的表达,8,基因表达的基本过程基因在大肠杆菌酵母中的高效的表达8,基因表达的基本过程,基因的表达主要涉及到两个过程:转录和翻译。 首先,目的基因通过转录(transcription)形成mRNA(信使RNA, messenger RNA );,然后, tRNA (转运RNA, transfer RNA)将各种氨基酸运送到核糖体并按照mRNA的密码子顺序将各种氨基酸连接成特定的氨基酸序列(translation) 最终得到基因的表达产物(蛋白质)。,基因在大肠杆菌酵母中的
5、高效的表达,9,基因表达的基本过程 基因的表达主要涉及到两个过程,Transcription(转录): making an RNA copy of a DNA sequence . RNA polymerase opens the part of the DNA to be transcribed. Only one strand of DNA (the template strand, antisense strand) is transcribed.,转录的具体过程,基因在大肠杆菌酵母中的高效的表达,10,Transcription(转录): making an R,启动子(promote
6、r):在基因序列中,标志着转录起始的可被RNA聚合酶识别的位点(DNA区段),一般位于基因的上游。 终止子(terminator):位于基因的编码序列之外(一般在下游)的一段标志着转录停止的RNA聚合酶识别位点。,有效转录的基本条件,基因在大肠杆菌酵母中的高效的表达,11,启动子(promoter):在基因序列中,标,正确翻译的基本条件,1、具备起始密码子2、具备终止密码子3、具有正确的阅读框,基因在大肠杆菌酵母中的高效的表达,12,正确翻译的基本条件1、具备起始密码子基因在大肠杆菌酵母中的高,基因表达的基本过程,基因在大肠杆菌酵母中的高效的表达,13,基因表达的基本过程基因在大肠杆菌酵母中的
7、高效的表达13,根据表达蛋白用途选择基因的表达策略,一、生物化学和分子生物学研究二、表达蛋白质用作抗原三、结构研究,基因在大肠杆菌酵母中的高效的表达,14,根据表达蛋白用途选择基因的表达策略一、生物化学和分子生物学研,真核基因表达的特点,一条成熟的mRNA只能翻译成一条多肽,不存在象原核生物那样的多基因操纵子模式;基因转录调节区很大,而且往往远离启动子达几百个甚至上千个碱基,它们并不直接影响RNA聚合酶与启动子区的结合,而是通过改变基因5上游区DNA的构型来影响RNA聚合酶与启动子区的结合;mRNA合成后穿过核膜进入细胞质中后才进行翻译工作,而且通常都有复杂的成熟和剪接过程;基因的启动子区和原
8、核基因差异很大,而且有增强子序列存在。,基因在大肠杆菌酵母中的高效的表达,15,真核基因表达的特点一条成熟的mRNA只能翻译成一条多肽,不存,原核体系中表达真核基因的困难,细菌的RNA聚合酶不识别真核基因的启动子;真核基因转录的mRNA在原核细胞中不能结合到核糖体上;真核基因一般含有内含子,而原核细胞没有象真核细胞那样的转录后加工系统,所以mRNA中的内含子部分不能被切除,不能形成成熟的RNA,也就不能表达出有功能的真核蛋白;表达的真核蛋白在原核细胞中很不稳定,容易被细菌蛋白酶降解破坏。,基因在大肠杆菌酵母中的高效的表达,16,原核体系中表达真核基因的困难细菌的RNA聚合酶不识别真核基因,将真
9、核基因克隆到一个强大的原核启动子和SD序列的下游,使得真核基因处于原核调控体系中。采用真核基因的cDNA序列作为构建表达载体的目的基因,这样就解决了原核细胞没有RNA剪接功能的问题。构建载体时,将真核基因插在几个原核密码子的后面,翻译后就得到了原核多肽和真核多肽的融合蛋白,这样就可以避免被原核蛋白酶的识别和降解,最后可以将融合多肽切除。,构建表达载体的策略,基因在大肠杆菌酵母中的高效的表达,17,构建表达载体的策略基因在大肠杆菌酵母中的高效的表达17,基因在大肠杆菌酵母中的高效的表达培训课件,大肠杆菌表达载体的成份,启动子 要求是:强启动子是诱导性的,如热诱导和化学诱导。转录终止子 使转录终止
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