差示热量分析ppt课件.ppt

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1、微量热技术(Microcalorimetry),一、热分析技术及分类热分析是在程序控制温度下，测量物质的物理性质随温度变化的一类技术。 程序控制温度：指用固定的速率加热或冷却。 物理性质：包括物质的质量、温度、 热焓、尺寸、机械、升学、电学及 磁学性质等。,热分析历史 1780年英国的Higgins使用天平研究石灰粘结剂和生石灰受热重量变化。 1915年日本的本多光太郎提出“热天平” 概念。 二战以后，热分析技术飞快发展。 40年代末商业化电子管式差热分析仪问世。 1964年提出“差示扫描量热”的概念。 热分析已经形成一类拥有多种检测手段的仪器分析方法。,热分析技术的分类: 等热分析 差热分析

2、 示差扫描量热分析 热重分析 逸出气体分析 热膨胀仪 热力法 热光法 电磁热分析 放射热分析等,热分析技术分类,热分析四大支柱： 等热分析、差热分析、 差示扫描量热分析、热机械分析 用于研究物质的晶型转变、融化、升华、吸附等物理现象以及脱水、分解、氧化、还原等化学现象。 快速提供被研究物质的热稳定性、热分解产物、热变化过程的焓变、各种类型的相变点、玻璃化温度、软化点、比热、纯度、爆破温度和高聚物的表征及结构性能等。,微量热法(包括等温滴定量热和差示扫描量热)是近年来发展起来的一种研究生物热力学与生物动力学的重要结构生物学方法.它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续和准确地监测和记录一个变化过

3、程的量热曲线，原位(in situ)、在线(on-line)和无损伤地同时提供热力学和动力学信息,微量热法具有以下特点： 它不干扰蛋白质和核酸的生理功能，具有非特异性的独特优势，即对被研究蛋白质和核酸体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件。 样品用量小,方法灵敏度高，测量时不需要制成透明清澈的溶液。 量热实验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。 微量热法缺乏特异性。但由于蛋白质和核酸本身具有特异性，因此这种非特异性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果，这有助于发现新现象和新规律。,微量热法在生物大分子研究中的应用主有：酶促反应蛋白质去折叠/折叠抗原-抗体相互作用分子伴侣

4、-底物相互作用药物-核酸相互作用,物质的三个基本性质即能量、结构和动力学性质相互关联例. 水分子中角H-O-H为105，因为这样分子能量最小； 又如，多肽链在溶液中折叠成球蛋白，也是由于要使系统能量最小化。,波谱学方法可以探测不同能级之间的跃迁，即研究样品分子在光的作用下能量状态的变化；而热分析的方法可以直接量测样品分子结构发生变化时能量的变化。,原 理热分析技术在升温或降温的过程中，物质的结构（如相态）和化学性质会发生变化，其质量、尺寸及声、光、电、磁、热、力等物理性质也会发生相应的变化热分析技术就是在温度程序控制的条件下测量物质的物理性质与温度关系的一类技术,在程序控制温度下，测量物质质量

5、的变化，产生了热重法、等压质量变化测定和逸出气检测等技术；测量样品几何尺寸的变化，则有了热膨胀法；测量样品的光学特性，有热光学法；,测量样品的电学特性，有热电学法；测量样品的磁学特性，有热磁学法；测量样品的力学特性，有热机械分析和动态热机械法；测量样品的热力学性质，则有等温滴定量热、差热分析和差示扫描量热法(DSC),差热分析、等温滴定量热和差示扫描量热技术应用得最广泛。差热分析（DTA）是在程序控温下测量样品和参比物的温度差与温度的关系的技术。等温滴定量热（ITC）通过滴定反应热放出或吸收的热力学分析，提供结合反应相关的能量过程的定量特征。差示扫描量热（DSC）技术是在程序控温下测量输入到位

6、置与参比物的功率差与温度的关系的技术。,热分析所测定的热力学参数主要是热焓的变化（H）。由于在给定温度下每个体系总是趋向于达到自由能最小的状态，所以样品升温或降温的过程中，它可转变成具有不同自由能的另一种结构状态。分析伴随着结构变化所发生的热焓变化，就可以得到样品结构变化的某些信息。这就是用差示扫描量热法来分析生物大分子结构变化的基础。差示扫描量热法能精确、快速、方便地同时提供样品物理性质和能量性质相关信息，这是其它技术难以做到的。,热分析既可以用于研究物理性质的变化，也可研究化学变化；不仅可测量热力学参数，也可提供一定的动力学信息。因此热分析在物质组分和结构研究及热力学和动力学研究上都是重要

7、的分析手段。热分析所研究的物质可以是无机物（包括金属、矿物、陶瓷材料等），也可以是有机物；既可以是小分子物质，也可以研究生物大分子；因此，其研究的对象遍及物理、化学、生物、医药、食品、化工、材料、地矿、航天、环保、考古等多个领域。在生物学研究中，研究比较早的是生物膜、膜脂及模拟生物膜的模型膜；随着热分析仪器测量精度的提高，对生物大分子如蛋白质、核酸的研究也越来越普遍，越来越深入。,热量的测量与量热仪热量是不能直接测量的，只能通过热效应间接测量。例如测量温差随时间的变化或温差随地点(位置) 的变化，即T=T(t1)-T(t2)或T=T(x1)T(x2)通过测量不同时间的温差间接测量热量的最古老的

8、方法就是测量一定质量的水的温度变化: Q = Ck TT=T(t1)T(t2)是水温在t1到t2这段时间内的变化，Q是热量，Ck是热容（假定它在测量范围内是不变的）。通过测量不同地点的温差也可以测量热量:QK(T)T(t)dt这里T表示温度，t表示时间，T是时间t时地点x1和x2的温差，TT(x1，t)T(x2，t)， K是比例系数。,不同的量热仪所依据的测量热量的原理千差万别，量热仪的分类也有各种方法。根据测量原理的不同，可以分为相变补偿型、热电效应补偿型、测量温差随时间变化型、测量温差随地点变化型等；根据运行模式不同，可分为等温静态运行、恒温环境静态运行、绝热静态运行、绝热动态扫描运行、恒

9、温环境扫描动态运行等；,根据构造原理分类：如双量热仪、单量热仪等。用人名命名，如Bunsen量热仪、Calvet量热仪等。无论采用哪一种分类方法，都可能会有某些量热仪难以明确归入某一类中去。例如，Calvet量热仪，可用电补偿热效应方式工作在恒温模式下，也可用恒温环境方式测量不同地点的温差。还有某些量热仪不在上述分类的范围以内。,一、等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry，ITC）,等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)是近年来发展起来的一种研究生物热力学与生物动力学的重要方法，它通过高灵敏度、高自

10、动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息。,等温滴定微量量热法（ITC）可以检测滴定反应过程中热量变化，用来表征生物分子间的相互作用，ITC 迅速成为研究生物大分子结合反应的有力工具。,通过滴定反应物到含有反应所必须的另一反应物的样品溶液中。每次滴定后，反应热放出或吸收，这些都可以被ITC所检测到。检测到的热效应的热力学分析提供了结合反应相关的能量过程的定量特征，可以直接测量与常温下发生的反应过程相关的能量学参数。,ITC的用途：获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数KB 、结合位点数（n） 、摩尔结合焓变（H）

11、、摩尔结合熵变（S） 、摩尔恒压热容，和动力学参数(如酶活力、酶促反应米氏常数和酶转换数)等化学热力学参数描述一个结合反应,ITC的应用范围：蛋白质-蛋白质相互作用(包括抗原-抗体相互作用和分子伴侣-底物相互作用)；蛋白质折叠/去折叠；蛋白质-小分子相互作用以及酶-抑制剂相互作用； 酶促反应动力学；药物-DNA/RNA相互作用；RNA折叠；蛋白质-核酸相互作用；核酸-小分子相互作用；核酸-核酸相互作用；生物分子-细胞相互作用；,ITC的特点,ITC能测量到的热效应最低可达125 nJ， 最小可检测热功率2 nW， 生物样品最小用量0.4 g， 灵敏度得到提高，响应时间（小于10 s） ITC不

12、需要固定或改变反应物，因为结合热的产生是自发的。获得物质相互作用完整的热力学数据包括结合常数（Ka）、结合位点数（n），结合焓（H）、恒压热容（Cp）和动力学数据（如酶促反应的Km和kcat）,ITC 结构原理示意图,ITC 获取的结果示意图,峰底与峰尖之间的峰面积为每次注射时释放或吸收的总热量,以产生或吸收的总热量为纵坐标，以加入杯中的两反应物之摩尔比为坐标作图，可得整个反应过程的结合等温曲线,ITC的应用,1）蛋白质-小分子和酶-抑制物相互作用；2）蛋白质-糖类相互作用；3）蛋白质-蛋白质相互作用：如Jacobson等用ITC研究了人细胞RNA聚合酶转录因子TFIID的最大亚单位TAFII

13、250的组蛋白乙酰基转移酶活性(Jacobson et al., 2000)。日本Kanagawa科学技术研究所的Tahirov等利用ITC、CD和UV研究了AML1/Runx-1小结构域识别的DNA结构及CBF控制的构象调整，阐明了CBF与CBF间的相互作用模式及前者调控后者结合到DNA上的机制(Tahirov, et al., 2001)。3）蛋白质-脂质相互作用；4）脂质间以及脂质-小分子相互作用；5）核酸-小分子相互作用；6）蛋白质-核酸相互作用；7）核酸-核酸相互作用；,8）抗体研究：美国Johns Hopkins大学生物系的生物量热学中心是目前世界上从事生物量热学最活跃和处于领先水

14、平的实验室，该中心的Freire小组(Murphy et al., 1993, 1995)应用高灵敏度ITC分别研究了血管紧缩素与其单克隆抗体和酸诱导去折叠细胞色素c与其单克隆抗体的结合，发现上述结合过程均为焓和熵同时驱动的反应，实验结果表明，这些过程中溶剂释放所导致的熵增过量补偿了因结合而引起的构象熵的损失。9）受体相互作用；10）蛋白质折叠和稳定性：如美国的Wright小组应用ITC和核磁共振(NMR)等技术研究了核激素受体蛋白的一个结构域与甲状腺素及类纤维素A受体相互作用的热力学，发现虽然分开的结构域本身很凌乱，但是它们之间有高的亲和力而且是焓驱动的，并以一种独特的协同折叠的机制形成螺旋

15、异二聚体。,11）酶分析：应用等温滴定微量热法(ITC)结合高灵敏度差示扫描量热法(DSC)和分光光度法研究酵母细胞色素C氧化酶催化氧化其生理底物亚铁细胞色素c的热力学和动力学，并分析原盐效应对该酶活性的影响。应用等温微量热法研究了超氧化物歧化酶催化歧化超氧阴离子等反应体系，获得了这些酶促反应的各种热力学和动力学信息,探讨了相关催化机理，同时用该法研究了博莱霉素催化切割DNA的反应，从热力学和动力学的角度严格地证明了博莱霉素在催化机制上类似于DNA切割酶，但其催化效率低于DNA切割酶，并用等温滴定微量热法研究了不同浓度盐酸胍存在时肌酸激酶催化ATP与肌酸间转磷酸化反应的热力学，从热力学的观点确

16、定了该酶促反应为快速平衡的随机顺序反应，还建立了新的肌酸激酶和超氧化物歧化酶活力测定方法微量热测活法。值得指出的是，ITC不仅被应用于研究蛋白质折叠/去折叠，而且被应用于核酸折叠，英国的Hammann等人利用ITC研究了镁离子诱导锤头状核酶折叠的热力学，发现镁离子与天然序列核酶的结合是一个强烈的放热反应，和镁离子与锤头状核酶不同序列变异体的结合有很大的区别，这些工作对于核酸折叠的热力学研究是良好的开端。,ITC 应用示例,ITC法测量结合/解离常数:Christian Herrmann等运用ITC研究了Ras与效应物和Cdc42与效应物的相互作用。Ras是一种在信号转导过程中起重要作用的蛋白质

17、。可以向其下游的许多信号转导途径输送细胞内调控信号。Ras在非激活态，与GDP结合，当GDP被GTP取代时被激活，与其效应物（Raf，RalGDS，3-磷脂酰肌醇激酶）呈现更紧密的结合。Cdc42是一种GTPase，也是信号转导相关的蛋白。它参与细胞增殖调控和肌动蛋白细胞骨架的调控。Cdc42在参与细胞骨架调控的过程中，很重要的一步是与WASP蛋白的相互作用。Ras及其效应物（Raf，RalGDS）的结合方式都很类似，包括富含亲水氨基酸侧链的反平行折叠。Cdc42及其效应物(WASP)的结合区则富含疏水氨基酸，其复合物也比Ras/效应物复合物大得多。,浓度依赖的Ras/RalGDS相互作用,利

18、用基于荧光的GDI法测得Kd2.4 M()和1.2 M(),利用ITC测得Kd1.73 M()和0.83 M(）,ITC可以直接测量焓变H，结合常数Ka，而不对反应体系产生影响，也不引入修饰基团，因此测得的结果更加可信,ITC探测生物分子结构信息: 运用ITC研究了DNA结合蛋白的分子识别一般认为：形成二聚体是酵母转录因子GCN4特异性识别其DNA结合位点的前提。以天然GCN4的碱性区（226252）作为单体肽GCN4M，以二硫键SS连接的肽作为二聚体肽GCN4D，研究他们与天然蛋白GCN4的结合位点AP1和CRE的相互识别作用。发现：单体肽GCN4M与DNA的结合力较弱，但是能够特异性识别D

19、NA结合位点AP1和CRE。 CCN4bZIP：天然肽226281的一段序列； CCN4M：合成的从226252的一段序列，单体肽； CCN4D：合成的从226252的一段序列，二聚体肽； AP1与CRE：GCN4的两个主要识别位点； CONT：非特异性识别，作为参照的寡聚核苷酸序列。,20时GCN4-D和GCN4-M与AP-1的滴定反应和拟合曲线 (a) GCN4-D滴定AP-1； (b) GCN-M滴定AP-1,ITC测定的反应热既包含结合反应又包含折叠反应。肽与DNA结合过程伴随着肽的构象折叠和疏水表面包埋。肽的构象中熵的损失对熵变的不利贡献大于溶剂效应产生的有利贡献，由于包埋疏水表面时

20、所引起的结合水的损失对熵变产生有利贡献，因此肽与DNA结合过程中总的熵变对结合是不利的,产生熵变的因素有：1）疏水作用产生的有利贡献；2）肽与DNA形成复合物由于转动和平移自由度 的减小引起的熵损失；3）结合过程中肽与DNA的折叠或其他构象变化 产生的不利贡献,GCN4和GCN4M与AP1和CRE反应是焓驱动。熵变对反应不利，而负的焓变补偿了不利的熵变。与熵的变化类似，反应自由能也包含肽链折叠所引起的总的自由能的变化和结合反应自由能的变化。结合作用对自由能变化的贡献主要来自于肽与DNA间形成的氢键作用、van der waals作用以及静电作用等,其它应用,美国的Todd小组提出了用功率补偿型

21、ITC测定酶动力学参数的两种新技术：(1) 将底物溶液不断滴入酶溶液中，以维持准一级反应的条件；(2) 将底物溶液一次滴入酶溶液中，连续监测底物被消耗时的热功率变化。这两种技术均基于反应速率和反应热功率成正比的原理，而且只需一次实验即可获得高度精确的动力学参数(如米氏常数、酶转换数和抑制常数)。这些技术被成功应用于测定二氢叶酸还原酶的氧化还原活力、己糖激酶的转换酶活力、幽门螺杆菌脲酶、胰蛋白酶和HIV-1蛋白酶的水解活力、肝素酶的裂解酶活力、丙酮酸羧化酶的连接酶活力,DSC &ITC 在药物研发中的应用,药物研究开发周期简单划分为初筛、分析、设计、合成和复筛，一个成功的新药上市平均需要15 年

22、的时间和巨额资金投入，约为8.8 亿美元。在开发过程中，许多药物在临床II 期和III 期惨遭淘汰，其主要原因是药物没有到达预期的靶点，从而产生毒副作用。 在药物设计过程中,提前对药物的热力学性质进行合理的评估和筛选,避免在开发过程中、后期才发现问题,以减少药物开发成本。DSC 和ITC 在新药的研发过程中许多环节发挥筛选功能,差示扫描量热技术（Differential Scanning Calorimetry）,差示扫描量热法是六十年代以后研制出的一种分析方法 年，美国的Waston和ONeill在分析化学杂志上提出了差示扫描量热法（DSC）的概念，并自制了DSC仪器不久， 美国Perkin

23、-Elmer公司生产了DSC商品仪器目前， DSC堪称热分析三大技术中的主要技术之一,差示扫描量热技术:在样品和参比同时程序升温度或降温且保持两者温度相等的条件下，测量流入或流出样品和参比物的热量差与温度关系的一种技术通过对试样因热效应而发生的能量变化进行及时补偿，保持试样与参比物之间温度始终保持相同，无温差、无热传递，使热损失小，检测信号大。灵敏度和精度大有提高，可进行定量分析,DSC仪器结构：1. 温度程序控制系统；2. 测量系统，用于样品物理量转换成电信号并放大；3. 数据记录、处理和显示系统；4. 样品室，提供适当环境,DSC分析生物大分子结构变化的基础： 在给定温度下每个体系总是趋向

24、于达到自由能最小的状态，样品升温或降温的过程中，它可以转变成具有不同自由能的另一种结构状态。分析伴随着结构变化所发生的焓变化，就可以得到样品结构变化的某些信息,两种主要类型(根据测量方法)：热流型（heat flow) DSC功率补偿型(power compensation)DSC,用炉子控制环境温度，测量通过康铜片流向试样和参比物的热流之差。热流型DSC是属于热交换型的量热计，与环境的热量交换是通过热阻进行测量，测量的信号是温差，其值表示交换的强度，并与热流速率 (=dQ/dt) 成正比。,热流式差示扫描量热仪(heat flow DSC)：,将试样焓变的热通量几乎没有什么损失地被多重热电偶

25、所测得,热通量式差示扫描量热仪(heat flux DSC),Calvet热通量DSC在试样支架和参比物支架附近的薄壁氧化铝管壁上安放几十对乃至几百对互相串联着的热电偶，一端紧贴着管壁，另一端则紧贴着银均热块，将试样侧多重热电偶与参比物侧多重热电偶反接串联,在普通DSC的程序控制加热的基础上，是在线性升、降温的基础上叠加一个正弦振荡温度程序，产生与之相应的循环热流。按此种方式，不仅可以测定总热流，并可将其分解成可逆成分与不可逆成分两部分。总热流是传统DSC的热流信号，可逆热流是热流的热容成分,温度调制型差示扫描量热仪(Temperature Modulated DSC, TMDSC)：,按试样

26、相变(或反应)而形成的试样和参比物间温差的方向来提供电功率，以使温差低于额定值，通常是小于0.01 K功率补偿型DSC是属热补偿型量热计，待测的热量几乎全部是由电能来补偿的,功率补偿型差示扫描量热仪(power compensation DSC)：,热流型DSC热流型量热仪的起源可以追溯到1899年Roberts-Austen开发的DTA。DTA技术是将样品和一种热惰性参比物一起承受同样的温度变化，在温度变化的时间范围内连续测量样品和参比物的温度差。1955年，Boersma将热电偶装在仪器中(而不是样品中)，得到了可重复的定量结果。样品产生的热通过一个仪器内部的固定的热通路流动，热量通过温度

27、差来计算得到。,杜邦910热流型DSC,杜邦910热流型DSC是以Boersma的设计原理为基础的热流型DSC。该仪器的特点是样品和参比物平台都在一个完整的康铜盘上，在相同的功率下由一个热源加热，利用康铜盘把热量传输到样品和参比物，康铜盘同时还作为测量温度的热电偶结点的一部分（一极）。传输到样品和参比物的热流差通过样品和参比物平台下的镍铬板与康铜板的结点所构成的镍铬-康铜热电偶进行监控记录样品和参比物的温差。样品温度由镍铬板下方的镍铬-镍铝热电偶直接监控。,这样热流型DSC实际上测定的量是样品与参比物的温差（T=TS-TR），然后根据热流方程，将T换算成dH/dt （热功率差）作为信号的输出

28、热流型DSC特点：基线稳定；高灵敏度,图 杜邦910型DSC的原理图1.康铜板； 2.热电偶结点；3.镍铬合金板；4.镍铝丝；5.镍铬丝；6.加热块。,这种热流型DSC的等效热路示于下图。R为样品和参比物的臂热阻，Rb为桥式热阻，Rg为通过净化气体的泄漏热阻，iS和iR分别为样品和参比物的热流,杜邦910型DSC的等效热路,根据Kirchoff定律，可得下列方程式:,式中，T为炉温，TS、TR分别为样品和参比物的温度。,由上面两个式子可推出： 其中T=TR-TS 从上式可以看出，样品和参比物的温度差T与热流差成正比。这样，经过适当的标定，即可从测量到的温差推算出热流差。,Calvet DSC也

29、是一类有代表性的热流型DSC。在Calvet DSC中，样品和参比样品室均由温差电堆环绕，这两个温差电堆连接在一起，方向相反，即可直接测量热流。特点：样品与参照物之间的热通路及样品和环境之间的通路都是由测量温度的传感器热电堆构成的。环境和样品及环境和参照样品间的热流由热电堆分别测量。这两个等同的系统放在一个均热块中，按照差热成对原则来使用位于测量系统和块之间的温差电堆，以此来抵销均热块的温度波动，并通过降低基线的波动来提高仪器的灵敏度。,温差电堆本身既可以作为系统和环境之间的热传导通道，又可以从其接点的温差电势得到产生沿线圈的热流的温度差，由温度差求出热流。实际仪器中使用了大量的(上千的)温差

30、电堆，这样不仅可以减少热阻，而且可以从一系列温差电堆热流的总和得到总热流，提高信号强度。在新型的Calvet DSC中，大量的半导体温差电偶均匀分布在样品和参比样品室周围，半导体温差电偶同时起温度测量和温度控制的作用。Calvet量热仪的分辨率高(对应于105K的T ，分辨率为105W或102J以上)，其缺点是时间常数比较大。其详细的测量原理这里就不再介绍了。,功率补偿型DSC功率补偿型DSC的主要特点是分别用独立的加热器和传感器来测量和控制样品和参比物的温度并使之相等。或者说，根据样品和参比的温度差对流入或流出样品和参比的热量进行功率补偿使之相等。它所测量的参数是两个加热器输入功率之差d(Q

31、)/dt或dH/dt。,功率补偿型DSC的结构,功率补偿式差示扫描量热仪示意图,零点平衡原理：,功率补偿型DSC 工作基于 “零位平衡”原理 零位平衡的原理: DSC 热系统可分为两个控制环路，其中一个环路作为平均温度控制，以保证按照一定的速率去升高样品和参比物的温度；第二个环路是用来保证当样品和参比物之间一旦出现温度差时能够调 节功率输入以消除 这种温度差,试样在加热的过程中，由于热效应与参比物之间出现温差时，通过差热放大电路和差热补偿放大器，使得流入补偿电热丝的电流发生变化： 当试样吸热时，补偿放大器使得试样一边的电流立即增大；反之则是参比物一边的电流增大，直到两边的热量平衡，试样与参比物

32、的温差消失为止。 这样通过连续不断地自动调节加热器的功率，总是可以使样品托架的温度与参比托架的温度保持相同。 这时，有一个与输入到样品池的热流和输入到参比池的热流之间的差值成正比的信号dH/dt 被馈送到记录仪中，同时记录样品和参比物的平均温度，将信号dH/dt 对时间或平均温度作图就得到了功率补偿型DSC 曲线。 功率补偿型DSC特点：精确的温度控制和测量；更快的响应时间和冷却速度；高分辨率,整个仪器由两个控制系统进行监控。（1）控制温度，使样品和参比物在预定的速率下升温或降温。（2）用于补偿样品和参比物之间所产生的温差，这个温差是由样品的放热或吸热效应产生的。通过功率补偿使样品和参比物的温

33、度保持相同W=dQs/dtdQR/dt=dH/dt其中， W为所补偿的功率; Qs为样品的热量；QR 为参比物的热量; dH/dt为单位时间内的焓变，即热流率，单位一般为mJ/s。,仪器样品和参比物的加热器电阻相等，RS=RR，当样品没有任何热效应时IS2RSIR2RR如果样品产生热效应，样品和参比物之间产生温差，仪器立即进行功率补偿。所补偿的功率为:W=IS2RSIR2RR令RS=RR=R，即得:W=R(IS + IR)( IS IR),定义IS + IR = IT上式化为W= IT(ISR IRR)W= IT(VS VR)=IT V式中， IT为总电流， V为电压差。如果IT为常数，则W与

34、V成正比。因此用V可直接表示dH/dt。,热量变化与曲线峰面积的关系,考虑到样品发生热量变化（吸热或放热）时，此种变化除传导到温度传感装置（热电偶、热敏电阻等）以实现样品（或参比物）的热量补偿外，尚有一部分传导到温度传感装置以外的地方，因而差示扫描量热曲线上吸热峰或放热峰面积实际上仅代表样品传导到温度传感器装置的那部分热量变化。 样品真实的热量变化与曲线峰面积的关系为mH=KA m样品质量； H单位质量样品的焓变； A与H相应的曲线峰面积； K修正系数，称仪器常数。,典型的差示扫描量热（DSC）曲线以热流率（dH/dt）为纵坐标、以时间（t）或温度（T）为横坐标，dH/dt-t（或T）曲线。

35、曲线离开基线的位移即代表样品吸热或放热的速率（mJs-1），而曲线中峰或谷包围的面积即代表热量的变化。 因而差示扫描量热法可以直接测量样品在发生物理或化学变化时的热效应。,典型的DSC曲线,在DSC 分析中蛋白质变性过程的基本参数有: 蛋白质的变性温度Tm ,蛋白质变性的热容Cp,蛋白质变性的焓H（见右图）。 此外,曲线上峰面积与峰高的比值可用于表示蛋白质结构中间态的情况,DSC曲线图,差示扫描量热仪结构热分析仪大致由下列几部分组成：温度程序控制系统：整个实验过程中温度变化的顺序、变温的起始温度和终止温度、变温速率、恒温温度及恒温时间等的控制测量系统(物理性能的测量)：将样品的某种物理量转换成

36、电信号，进行放大，用来进一步处理和记录数据记录、处理和显示系统：把所测量的物理量随温度和时间的变化记录下来，并可以进行各种处理和计算，再输出到输出和打印设备显示和打印。,样品室：样品室除了提供样品本身放置的容器(样品杯或样品管)、样品容器的支撑装置、进样装置等外，还包括提供样品室内各种实验环境的系统，如维持环境气氛所需气氛（氮气、氧气、氢气、氦气等）的输入测量系统、压力控制系统、环境温度控制系统等。现在的仪器一般由一台计算机执行仪器的温度控制、测量控制、进样控制和环境条件控制等控制功能并进行数据记录、处理和显示。样品池：,为了得到精确的测量结果，DSC必须经常进行温度和量热的校正。温度校正常采

37、用已知相变温度较均匀地分布在所测量温度范围内且相变温度比较温定、相变峰比较尖锐的物质如高纯铟(其熔融温度为157C)和三苯甲烷作为标准。量热校正可采用已知相变热焓的标准物质。测定有机物时，应采用有机标准物进行校正。,一些影响实验结果的因素 差示扫描量热法的影响因素与具体的仪器类型有关。一般来说，影响DSC测量结果的主要因素大致有下列几方面： 实验条件：例如起始和终止温度、升温速率、恒温时间等；样品特性：样品用量、固体样品的粒度、装填情况，溶液样品的缓冲液类型、浓度及热历史等；参比物特性：参比物用量、参比物的热历史等。,实验条件的影响影响实验结果的主要实验条件是升温速率：降低升温速率会提高分辨率

38、，降低灵敏度；反之，提高升温速率会提高灵敏度，降低分辨率。实验中常常会遇到这种情况：对于某种蛋白质溶液样品，升温速率高于某个值时，某个热变性峰根本无法分辨，而当升温速率低于某个值后，就可以分辨出这个峰。说明升温速率可能影响DSC测量的分辨率。,升温速率对分辨率的影响可以解释如下：如果两个热过程发生的温度比较接近，当升温速率较低时，第二个过程还没有开始，第一个过程已经结束了，因此这两个过程能够分辨开来。升温速率较高时，第一个热变化过程中还没有达到平衡，第二个过程就开始了。这样，两个过程就无法分辨了,升温速率对灵敏度的影响样品熔融时会吸收热能,样品的温度基本不变而参照物的温度会按照设定的升温程序继

39、续升高。熔融过程结束后，样品和参照物之间的温度要重新达到平衡。升温速率较低时，样品相对于参照物的温度滞后较少，样品曲线偏离参照物曲线的部分的面积（图中的A ,速率峰面积）较小，而升温速,率较高时，这个面积比较大（图中的A）,峰形也会变得尖锐。而这个面积与熔融过程中的热流成正比。因此，升温速率较高时熔融过程中的热流较大，即信号较强，在这种意义上也可以说灵敏度较高。,升温速率不仅影响峰温的位置和峰形,也会影响峰面积的大小.事实上，改变升温速率也是获得有关样品的某些重要参量的重要手段升温过快也使试样分解偏离平衡条件得程度也会相应升高，因此会出现基线漂移，更可能会导致相邻两峰的重叠而导致分辨率的下降。

40、然而较慢的升温速度基线漂移相对较小，整个体系也更接近平衡的条件，可以得到宽而浅的峰，相邻的两峰也能很好的分离，分辨率也会相对较高,样品特性的影响样品量一般来说，样品量太少，仪器灵敏度不足以测出所要得到的峰。而样品量过多，又会使样品内部传热变慢，使峰形展宽，分辨率下降。实际中发现，样品用量对不同物质的影响也有差别。一般要求在得到足够强的信号的前提下，样品量要尽量少一点，且用量要恒定，保证结果的重复性。,固体样品的几何形状 样品的几何形状如厚度、与样品盘的接触面积等会影响热阻，对测量结果也有明显影响。为获得比较精确的结果，要增大样品盘的接触面积，减小样品的厚度，并采用较慢的升温速率。样品池和池座要

41、接触良好，样品池或池座不干净，或样品池底不平整，会影响测量结果,样品池在样品座上的位置 样品池在样品座上的位置会影响热阻的大小，应该尽量标准化。 固体样品的粒度 样品的粒度太大，热阻变大，样品熔融温度和熔融热焓偏低；但粒度太小，由于晶体结构的破坏和结晶度的下降，也会影响测量结果。带静电的粉状样品，由于静电引力使粉末聚集，也会影响熔融热焓。总的来看，粒度的影响比较复杂，有时难以得到合理的解释。,粒度对于峰形的影响 A:粒度最大，三个峰重叠；b :粒度适中，三个峰可以明显区分； c :试样粒度过小，只出现两个峰,样品的热历史许多材料往往由于热历史的不同而产生不同的晶型和相态(包括某些亚稳态)，对D

42、SC测量结果也会有较大的影响。溶液样品中溶剂或稀释剂的选择 溶剂或稀释剂对样品的相变温度和热焓也有影响，特别是蛋白质等样品在升温过程中有时会发生聚沉的现象，而聚沉产生的放热峰往往会与热变性吸热峰发生重叠，并使得一些热变性的可逆性无法观察到，影响测量结果。选择适当的缓冲液系统有可能避免聚沉。,从DSC获得的信息与主要参量DSC直接记录热流量随时间和温度变化的曲线，从曲线中可以得到一些重要的参数。 如：转变温度、焓变、熵变、自由能、比热，还可以分析出纯度、协同性、结合/解离常数、酶促反应常数等,转变温度 如果样品在升温或降温的过程中结构发生变化，样品就可能吸热或放热，如果样品分子发生结构变化的协同

43、性比较高，DSC曲线上就会出现一个吸热峰或放热峰，从DSC曲线上可以找到结构发生转变的温度即转变温度。首先需要确定基线，一般是将热效应发生前后的基线连接起来作为基线。一般采用两种转变温度，一是转变峰的起始边的切线与基线的交点处的温度即外推始点Te，二是将转变峰温(Tp)作为转变温度。现在DSC仪器本身都带有计算峰温的程序。,图 由DSC曲线确定转变温度,热 焓热焓是一个重要的热力学参数，样品分子的物理变化(如相变)和化学变化(如物质的分解、键的断裂等)都与热焓有关，因此热焓的测定也就具有很重要的意义.根据定义，焓HEPV，这里E是系统的内能，P、V分别为系统的体积和压力。我们所说的DSC测量的

44、热焓，确切地说应是焓变，即样品发生热转变前后的H。对于压力不变的过程，H等于变化过程所吸收的热量Q。所以，有些文献中常常将焓变H与热量Q等同起来。要比较不同物质的转变焓，还需要将H归一化，即求出1摩尔样品分子发生转变时的焓变。实际测量时，只要将样品发生转变时吸收或放出的热量除以样品的摩尔数就可以了。,差示扫描量热仪直接记录的是热流量随时间变化的曲线，该曲线与基线所构成的峰面积与样品热转变吸收或放出的热量成正比。根据已知相变焓的标准物质的样品量(摩尔数)和实测标准样品DSC相变峰的面积，就可以确定峰面积与热焓的比例系数。这样，要测定未知转变焓样品的转变焓，只需确定峰面积和样品的摩尔数就可以了。如

45、果峰的前后基线有变化，要准确定出峰面积是不太容易的，对于复杂的峰形就更难了。下图给出了一些确定峰面积的参考原则。现在DSC的计算机中都有按照某种默认的原则计算峰面积的程序。,图 一些确定峰面积的方法,比热 DSC的灵敏度高，热响应速度快，操作简便；与常规的量热计热容测定法相比，样品用量少，测定速度快，操作简便。在DSC中，样品是处在线性的程序温度控制下，流入样品的热流速率是连续测定的，并且所测定的热流速率dH/dt与样品的瞬间比热成正比，因此热流速率可用下列方程式表示：dH/dt=mCpdT/dt 式中H为热焓，m为样品质量，Cp为样品比热。样品的比热即可通过上式测定。,在比热的测定中通常是以

46、某种比热已精确测定的样品作为标准样品。样品比热的具体测定方法加下：先用两个空样品池在较低温度(T1)下恒温记录一段基线，然后转入程序升温，然后在一较高温度(T2)下恒温，由此得到从温度T1到T2的空载曲线或基线。T1到T2即我们测量的范围。然后在相同条件下使用同样的样品池依次测定已知比热的标准样品和样品的DSC曲线，测得结果如下图所示。,图 比热的测量,y=dH/dt=mCpdT/dt， y=dH/dt=mCpdT/dt样品在任一温度下的比热Cp可通过下列方程式求出： Cp、m、y分别为已知比热的标准样品的比热、质量和标准样品DSC曲线与基线之间的y轴量程差，而Cp、m和y分别为样品的相应值。

47、 为了提高测量的精确度，应选用较高的灵敏度，且样品和标准样品的样品制备条件和测量条件应尽量相同。,样品纯度根据样品和杂质的性质，纯度分析的方法可以是各种各样的。用差示扫描量热法进行纯度分析，具有快速、精确、样品用量少等优点。,用DSC进行纯度测定的理论基础是范得华方程，由范得华方程可以导出熔点降低与杂质含量的关系：T0为平衡时纯样品的熔点(K)；Tm为平衡时含杂质样品的熔点(K)；H为纯样品的摩尔熔融热焓，单位为卡/克分子；X为样品中所含杂质的克分子数；R为气体常数(1.987卡/克分子 K)；F为样品在融化过程中的熔融分数： 这里Ts是熔化过程中样品的温度。,由 ，可得出根据DSC曲线，H由

48、峰面积求得。在DSC曲线上选择若干个点，分别得到相应的Ts并算出F值，Ts对1/F作图，得到一条直线，其斜率为RT20X/H，截距为T0。这样，从斜率就可以求出样品中所含杂质的克分子数X,用DSC测定纯度时，必须满足范得华方程要求的条件：1.样品和杂质形成低共熔体，而不能形成固熔体。2.液相中样品和杂质应互溶为一理想溶液，即其活度系数为1。3.杂质浓度小，即溶液为稀溶液。4.固相与液相应处于热力学平衡状态。5.杂质应该不挥发、不分解、不离解、不缔合，不与样品发生化学反应。,用DSC测定物质熔融峰时，样品的纯度对DSC曲线的峰高和峰宽有明显的影响。因此，通过简单的峰形对比也可简便地估计样品的纯度

49、。右图所示的是不同纯度的乙酰对氨苯乙醚的DSC曲线。,图 不同纯度的乙酰对氨苯乙醚的DSC曲线,对于具体的样品和具体的反应，根据一定的理论模型，人们还可以从DSC曲线中计算出一些其它的热力学参数如协同性、熔融熵等。,DSC分析生物大分子结构变化基础,由于在给定温度下每个体系总是趋向于达到自由能最小的状态，所以样品升温或降温的过程中，它可以转变成具有不同自由能的另一种结构状态。分析伴随着结构变化所发生的焓变化，就可以得到样品结构变化的某些信息,DSC在生物系统中的应用 近年来，由于高灵敏度热分析仪器的出现，热分析在生物学中的应用得到很快的发展，所研究的样品既有从脂、生物膜、蛋白质到核酸等生物分子

50、及其复合体系，也包括生物组织等混合物的系统。由于样品的热性质和热力学数据与它们的结构的对应关系，人们常可以通过生物样品的热力学特性来了解其结构的变化。下面我们不准备系统介绍DSC在生物学中的应用，只准备用DSC在生物膜与蛋白质研究中应用的几个例子来说明用DSC研究生物样品的一些思路。,生物膜与膜脂的研究生物膜是由膜脂、膜蛋白及少量多糖组成的一种薄膜结构。可以粗略地把生物膜看成是在流动的脂双层中镶嵌着膜蛋白的一种流体镶嵌结构。生物体系以生物膜将自己与外界环境分隔开来，同时又通过生物膜这个界面与外界联系，进行物质、能量和信息的交换。各类生物大分子中，用DSC方法研究较早的是膜脂。,仅用少量样品即可