天然产物的提取分离和结构鉴定ppt课件.ppt

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1、天然产物的提取分离和结构鉴定,Chapter 2,教学目的与要求：,了解天然产物化学的预实验与提取掌握天然产物化学成分提取分离的原理及方法,掌握色谱分离方法了解天然产物化学结构的测定方法,主要内容,一、天然产物化学成分的预实验与提取二、色谱分离分析方法三、结晶和重结晶四、天然产物化学成分的结构鉴定,2.1天然产物化学成分的预实验与提取,提取：将有效成分从天然物质中提出的过程分离：将提取中混合的性质相同或不同的成分进一步分开的过程,研究天然产物化学成分的基本步骤,原材料,单体化合物,总提取物,不同部位,目的化合物,结构修饰人工合成,提取,初步分离,精细分离纯化,一、天然产物化学成分的预实验,1.

2、基本原理： 根据各成分极性的不同，先系统地分成几个不同部分，然后利用显色反应或沉淀反应，或结合纸色谱、薄板色谱，定性判断各部分中可能含有的化合物类型。,2.选择合适的极性溶剂（相似相溶）,石油醚环己烷苯氯仿乙醚乙酸乙酯 正丁醇丙醇，乙醇甲醇水含盐水极性：小 大 亲脂性：大 小 亲水性：小 大,适用于极性从小到大的预实验,采用石油醚、水、95%乙醇的三段法进行粗分，提高工作效率,二、天然产物化学成分的系统分离,1.系统分离： 选择一系列分离措施，将性质相近的组分集中在一起提取出来，以便分别与临床、动物试验、检测等相配合，确定该部分是否有效目的：对无效部分暂不追踪，对有效部分视具体情况再进行分离，

3、找出关键成分。,2.系统分离阶段粗分阶段：又称部位分离，大类物质的分离，如皂苷、蛋白质等；细分阶段：组分分离,对于水提取液，采用离子交换树脂将其分为碱、酸和中性三部分：,三、提取天然产物的常用方法,1.溶剂法2.水蒸气蒸馏法3.分馏法4.吸附法,5.沉淀法6盐析法7.透析法8.升华法,1、溶剂提取法及其原理,溶 剂 法,溶剂提取法：是根据天然产物中各种成分在溶剂中的溶解性质，选用对活性成分溶解度大，对不需要溶出成分溶解度小的溶剂，而将有效成分从药材组织内溶解出来的方法。,原理：根据“相似相溶”原理，选择与化合物极性相当的溶剂将化合物从植物组织中溶解出来，同时，由于某些化合物的增溶或助溶作用，其

4、极性与溶剂极性相差较大的化合物也可溶解出来。,2、常用溶剂的特点,石油醚,环己烷, 苯,氯仿,乙醚,乙酸乙酯,正丁醇,丙酮,乙醇,甲醇,极性：小 大,亲脂性：大 小,亲水性：小 大,比水重的有机溶剂：氯仿,与水分层的有机溶剂：环己烷 正丁醇,能与水分层的极性最大的有机溶剂：正丁醇,与水可以以任意比例混溶的有机溶剂：丙酮 甲醇,极性最大的有机溶剂：甲醇,极性最小的有机溶剂：石油醚,常用来从水中萃取苷类、水溶性生物碱类成分的有机溶剂：正丁醇,溶解范围最广的有机溶剂：乙醇,选择溶剂要注意以下三点：溶剂对有效成分溶解度大，对杂质溶解度小；溶剂不能与中药的成分起化学变化；溶剂要经济、易得、使用安全等。,

5、3、溶剂的选择,4、各种溶剂提取法,连续回流提取法等,浸渍法,渗漉法,煎煮法,回流提取法,浸渍法：浸渍法系将天然产物粉末或碎块装入适当的容器中，加入适宜的溶剂（如乙醇、稀醇或水），浸渍药材以溶出其中成分的方法。,渗漉法：渗漉法是将天然产物粉末装在渗漉器中，不断添加新溶剂，使其渗透过药材，自上而下从渗漉器下部流出浸出液的一种浸出方法。,01 溶剂罐02 变频物料泵 03 快速渗漏机 04 流量计 05 渗滤液罐 06 可调试电加热水箱 07 热水泵 08 高效旋转薄膜蒸发器 09 浓缩液罐 10 冷凝器 11 冷却器 12 受却器 13 真空泵 14 控制柜,SLNS-快速渗漉提取浓缩机组工艺流

6、程图,SLNS-快速渗漉提取浓缩机组,煎煮法： 煎煮法是我国最早使用的传统的浸出方法。所用容器一般为陶器、砂罐或铜制、搪瓷器皿，不宜用铁锅，以免药液变色。直火加热时最好时常搅拌，以免局部药材受热太高，容易焦糊。有蒸汽加热设备的药厂，多采用大反应锅、大铜锅、大木桶，或水泥砌的池子中通入蒸汽加热。还可将数个煎煮器通过管道互相连接，进行连续煎浸。,回流提取法： 应用有机溶剂加热提取，需采用回流加热装置，以免溶剂挥发损失。小量操作时，可在圆底烧瓶上连接回流冷凝器。溶剂浸过药材表面约12cm。在水浴中加热回流，一般保持沸腾约1小时后放冷过滤，再在药渣中加溶剂，作第二、三次加热回流分别约半小时，或至基本提

7、尽有效成分为止。此法提取效率较冷浸法高，大量生产中多采用连续提取法。,连续回流提取法：应用挥发性有机溶剂提取天然产物有效成分，不论小型实验或大型生产，均以连续提取法为好，而且需用溶剂量较少，提取成分也较完全。实验室常用脂肪提取器或称索氏提取器。连续提取法，一般需数小时才能提取完全。提取成分受热时间较长，遇热不稳定易变化的成分不宜采用此法。,5、溶剂萃取法分以下几种情况,采取几种不同极性的溶剂分步提取先用极性低，与水不相混溶的有机溶剂（如石油醚，苯等），再用与水相溶的有机溶剂（如丙酮，乙醇等），最后用水提取。目前采用的两种系统为： 乙醇-乙醚-甲醇-水 己烷-二氯甲苯-甲醇-水 常用作提供生物试

8、验的样品用,单一溶剂提取用水提取，杂质较多，常加入少量戊醇或辛醇如果植物中含胺型生物碱、苷类及有机酸等含有亲水性基团，并能溶于水，可直接用水提取（如：小檗碱，芸香苷，甘草酸）如果植物中含的成分较为简单或某一成分含量较高时，可估计其极性大小或溶剂性能，选择一种适当的溶剂提取（如：细辛素石油醚，橙皮苷甲醇或乙醇）。,两种或两种以上溶剂利用植物中所含成分在某种溶剂中溶解度大差异而达到分离的目的 如： 川楝素：苯石油醚溶解脂类，川楝素难溶而分出 60%乙醇减压浓缩氯仿提取,液-液分配萃取利用混合物中的各成分在两种互不相溶的溶剂中，由于分配系数不同而达到的分离目的分配系数相差越大，分离效果越高。,反应溶

9、剂萃取常用于内酯化合物，因为内酯环遇碱水解成为羧酸盐而溶于水，再加酸酸化，可重新形成内酯环，不溶于水，即分开。,6、强化溶剂提取的新方法,超临界流体萃取SCFE超声波强化提取技术微波萃取技术酶法萃取技术,超临界流体萃取SCFE,超临界流体萃取： 是以某一介质作为萃取剂，在其临界温度和临界压力之上的条件下，从液体或固体物料中萃取出待分离的组分的一种方法。 超临界流体： 由于接近液体的密度使之具有较高溶解度,由于接近气体的粘度, 使之具有良好的流动性能,扩散系数介于气液之间,使之对待萃取的物料组织有良好的渗透性,这些特征大大提高了溶质进入超临界流体的传质速率。,超临界流体萃取的特点,萃取过程在较低

10、温度范围内进行,特别适用于具有热敏性或易氧化的成分。萃取介质通常选用二氧化碳,二氧化碳化学性质稳定,无腐蚀性、无毒性、不易燃、不易爆,萃取后容易从分离成分中脱除,不会造成污染,适用于食品和医药行业。,工艺条件容易控制,通过对温度和压力进行调节, 可以实现选择性萃取和分离。,萃取产物的理化性质保持良好,产品质量好,且无溶剂残留问题,萃取介质循环利用,无环境污染问题。,超临界流体萃取需要冷媒和高压支持且生产量较小,操作成本大。,超临界流体萃取的应用,由于超临界流体萃取技术上有许多不可替代的优点,近年来获得高度的重视和广泛的应用,例如中药有效成分的提取；菌体生成物的分离；香精香料色素的提取；动植物脂

11、肪、脂溶性成分、植物碱、甾醇类物质等成分的提取；有机溶剂以及有害有毒物质的脱除等。,超声波强化提取技术,原理：利用超声波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取。优点：提取时间短，收率高，避免高温对有效成分的破坏缺点：对容器壁的薄厚，放置位置要求较高,微波萃取技术,原理：在微波场中，利用吸收微波能力的差异，被提取物质的某些区域或萃取体系中某些成分选择性加热分离优点：提取速度快缺点：要求药材含一定的水分，微波对某些化合物有一定降解作用，只适宜对热稳定的产物,酶法萃取技术,原理：利用酶破坏植物的细胞壁，使有效成分溶出是一种最大限度从植物体内提取有效成分的方法之一中药提取中多用纤维素酶,水蒸气蒸馏法,水

12、蒸气蒸馏法，适用于能随水蒸气蒸馏而不被破坏的天然产物成分的提取。此类成分的沸点多在100以上，与水不相混溶或仅微溶，且在约100时存一定的蒸气压。当与水在一起加热时，其蒸气压和水的蒸气压总和为一个大气压时，液体就开始沸腾，水蒸气将挥发性物质一并带出大蒜素、丹皮酚、麻黄碱,分 馏 法,利用沸点不同进行分馏，再精制纯化如：在分离毒芹总碱中的毒芹碱和羟基毒芹碱时，利用沸点不同进行常压或减压分馏,吸附法,吸附目的：1.吸附除去杂质，常指鞣质色素2.吸附所需物质常常用氧化铝、酸性白土、活性炭,沉 淀 法,利用某些试剂产生沉淀的性质而得到分离或除去“杂质”。,盐析法:加易溶无机盐至一定浓度或饱和，降低成分

13、溶解度，常用氯化钠、氯化铵、硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁透析法：小分子可通过半透膜，大分子不能通过，常用于纯化皂苷、蛋白质、多肽和多糖等化合物。,升 华 法,固体物质受热直接气化，遇冷后又凝固为固体化合物，称为升华。天然产物中有一些成分具有升华的性质，故可利用升华法直接自天然产物中提取出来。例如樟木中升华的樟脑（camphor），在本草纲目中已有详细的记载，为世界上最早应用升华法制取药材有效成分的记述。茶叶中的咖啡碱在178以上就能升华而不被分解。游离羟基蒽醌类成分，一些香豆素类，有机酸类成分，有些也具有升华的性质。,四、天然产物的分离与精制,根据物质溶解度差别进行分离根据物质在两相溶剂中的分配系数

14、不同进行分离根据物质的吸附性差别进行分离,根据物质溶解度差别进行分离 利用不同温度，不同溶解度。eg结晶，重结晶加入另一溶剂，改变混合剂的极性，使一部分沉淀析出溶剂沉淀对酸、碱或两性有机化合物，常加酸碱来调节PH值，改变分子存在状态（游离型或离解型），从而改变溶解度而实现分离沉淀剂沉淀酸或碱性的化合物可通过加入沉淀剂，使之生成不溶性的盐类析出。盐析沉淀,根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行 分离液-液萃取与分配系数K值K=CU/CLCU-溶质在上相溶剂中的浓度CL-溶质在下相溶剂中的浓度,分离难易与分离因子分离因子表示 A、B 两种溶质在同一溶剂系统中分配系数的比值。即： =KA/KB( 注：

15、KA KB )100，仅作一次简单萃取就可实现基本分离；100 10,萃取10-12次 2，须100次以上萃取才基本分离 1,不能分离,分配比与PH值 一般 pH12,则酸性物质呈离解状态(A-)、碱性物质则呈非离解状态(B)存在。据此,可采用图2-5所示在不同pH的缓冲溶液与有机溶剂中进行分配的方法,使酸性、碱性、中性及两性物质得以分离。,液-液萃取与纸色谱50，简单萃取50，采用逆流分溶法如果不知道分配比，可以借助纸色谱（PPC）求值作业：逆流分溶法的原理和内容 什么是色谱，色谱的分类,逆流分溶法,液-液萃取分离中经常遇到的情况是分离因子值较小, 故萃取及转移操作常须进行几十次乃至几百次。

16、此时简单萃取已不能满足需要, 而要采用逆流分溶法( countercurrent distribution,简称CCD)。,逆流分溶法,【逆流分溶法】又称逆流分配法、逆流分布法或反流分布法。利用不同物质在两个互不相溶的溶剂中溶解度不同的原理使混合物分离的方法。此法相当于多次萃取。利用此原理制成了连续、自动的逆流分溶仪。该仪器可使两种性质相似、即使分溶常数很接近的化合物，经过一定次数振摇、转移的操作，亦可达到分离的目的。用于分离抗生素、脂肪酸、蛋白质、核酸以及激素等，也用于测定溶质的分溶常数。,CCD 法因为操作条件温和、试样容易回收,故特别适于中等极性、不稳定物质的分离。另外,溶质浓度越低,分

17、离效果越好。但是,试样极性过大或过小,或分配系数受浓度或温度影响过大时则不易采用此法分离。易于乳化的萃取溶剂系统也不宜采用。,色谱法,色谱法（chromatography）又称层析法，是一种分离和鉴定化合物的有效方法，其最大的优点在于分离效能高、快速简便。对一些结构性质相似化合物的分离，用经典的萃取法、沉淀法和结晶法等难以达到分离目的时，用色谱法往往可以收到很好的分离效果。 基本原理：利用混合物各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（即分配）的不同，或其它亲和作用性能的差异，混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组分分开。,分类:按流动相的分子聚集状态分类:GC、LC、SF

18、C 等按固定相的分子聚集状态分类:GSC、GLC、LSC、LLC等按操作形式分类:柱色谱法、平面色谱法、毛细管电泳法等按色谱过程的分离机制分类:分配色谱法、吸附色谱法、离子交换色谱法、 空间排阻色谱法、毛细管电泳法等,实现色谱操作的基本条件是必须具备相对运动的两相，固定相(stationary phase)和流动相(mobile phase)。色谱过程是组分的分子在流动相和固定相间多次“分配”的过程。组分的结构和性质微小差异 与固定相作用差异 随流动相移动的速度不等 差速迁移 色谱分离。,液-液分配柱色谱 将两相溶剂中的一相涂覆在硅胶等多孔载体上,作为固定相,填充在色谱管中,然后加入与固定相不

19、相混溶的另一相溶剂 (流动相)冲洗色谱柱。这样,物质同样可在两相溶剂中相对作逆流移动,在移动过程中不断进行动态分配而得以分离。这种方法称之为液-液分配柱色谱法。,正相色谱：分离水溶性或极性较大的成分如生物碱、苷类、糖类、有机酸等化合物时,固定相多采用强极性溶剂,如水、缓冲溶液等,流动相则用氯仿、乙酸乙醋、丁醇等弱极性有机溶剂,称之为正相色谱；反相色谱:但当分离脂溶性化合物,如高级脂肪酸、油脂、游离甾体等时,则两相可以颠倒,固定相可用石蜡油,而流动相则用水或甲醇等强极性溶剂,故称之为反相分配色谱 (reverse phase partition chromatography)。,加压液相柱色谱特

20、点：加压液相色谱用的载体多为颗粒直径较小、机械强度及比表面积均大的球形硅胶微粒，因而柱效率大大提高。分类：快速色谱FC，低压液相色谱LPLC，中压液相色谱MPLC，高压液相色谱HPLC,根据物质的吸附性差别进行分离,固-液吸附：物理吸附（主要）化学吸附半化学吸附,物理吸附 (physical absorption) 也叫表面吸附,是因构成溶液的分子(含溶质及溶剂)与吸附剂表面分子的分子间力的相互作用所引起。 特点：是无选择性、吸附与解吸过程可逆、 可快速进行。故在实际工作中用得最广。如采用硅胶、氧化铝及活性炭为吸附剂进行的吸附色谱即属于这一类型。,化学吸附(chemical absorptio

21、n),如黄酮等酚酸性物质被碱性氧化铝吸附,或生物碱被酸性硅胶吸附等吸附质与吸附剂之间要发生化学反应的一类吸附。特点：具有选择性、 吸附十分牢固、有时甚至不可逆,故用得较少。,半化学吸附(semi-chemical absorption),如聚酰胺对黄酮类、醌类等化合物之间的氢键吸附,力量较弱,介于物理吸附与化学吸附之间的一类吸附。,1 物理吸附基本规律,（2）被分离的物质与吸附剂、洗脱剂共同构成吸附过程中的三要素，彼此紧密相连。,（1）物理吸附过程一般无选择性，但吸附强弱大体遵循“相似者易于吸附” 的经验规律。,硅胶、氧化铝因均为极性吸附剂,故有以下特点:(1)对极性物质具有较强的亲和能力,极

22、性强的溶质将被优先吸附。(2)溶剂极性越弱,则吸附剂对溶质将表现出较强的吸附能力。溶剂极性增强,则吸附剂对溶质的吸附能力即随之减弱。(3)溶质即使被硅胶、氧化铝吸附,但一旦加入极性较强的溶剂时,又可被后者置换洗脱下来。,活性炭因为是非极性吸附剂, 对非极性物质具有较强的亲和能力,在水中对溶质表现出强的吸附能力。溶剂极性降低,则活性炭对溶质的吸附能力也随之降低。故从活性炭上洗脱被吸附物质时,洗脱溶剂的洗脱能力将随溶剂极性的降低而增强。,2 极性及其强弱判断,极性强弱是支配物理吸附过程的主要因素。所谓极性乃是一种抽象概念,用以表示分子中电荷不对称(asymmetry)的程度，并大体上与偶极矩(di

23、pole moment)、极化度（polarizability）及介电常数（dielectric constant）等概念相对应。,（1）官能团的极性按下列官能团的顺序增强： CH2CH2，CH2=CH2，OCH3，COOR， C=O，CHO，NH2，OH，COOH,（2）化合物的极性则由分子中所含官能团的种类、数目及排列方式等综合因素所决定。,（3）大体上溶剂极性的大小可以根据介电常数()的大小来判断。介电常数越大，则极性越大。一般溶剂的介电常数按下列顺序增大： 环己烷（1.88），苯（2.29），无水乙醚（4.47），氯仿（5.20），乙酸乙酯（6.11），乙醇（26.0），甲醇（31.2

24、），水（81.0）,3.简单吸附法进行物质的浓缩与精制,简单吸附，如在结晶及重结晶过程中加入活性炭进行的脱色、脱臭等操作，在物质精制过程中应用很广。,4. 吸附柱色谱法用于物质的分离,吸附色谱法中硅胶、氧化铝柱色谱在实际工作中用得最多。有关注意事项如下:,(1) 硅胶、氧化铝吸附柱色谱过程中,吸附剂的用量一般为试样量的3060倍。试样极性较小、难以分离者,吸附剂用量可适当提高至试样量的100200倍。,据此可选用适当规格的色谱管, 实验室中常用色谱管的规格如下所示，其高度与直径比约为(15:1) (20:1)。,色谱管内径(cm):0.5 1.0 1.5 2.0 3.0 4.0 6.0 8.0

25、 10 长度 (cm):10 15 30 45 60 75 90 120 150,(2) 硅胶、氧化铝吸附柱色谱,应尽可能选用极性小的溶剂装柱和溶解试样,以利试样在吸附剂柱上形成狭窄的原始谱带。(3) 洗脱用溶剂的极性宜逐步增加,但跳跃不能太大。实践中多用混合溶剂,并通过巧妙调节比例以改变极性,达到梯度洗脱分离物质的目的。(4) 为避免发生化学吸附,酸性物质宜用硅胶、碱性物质则宜用氧化铝进行分离。(5) 如液-液分配色谱中所述,吸附柱色谱也可用加压方式进行,溶剂系统可通过 TLC进行筛选。,5. 聚酰胺吸附色谱法,聚酰胺(polyamide)吸附属于氢键吸附,是一种用途十分广泛的分离方法,极性

26、物质与非极性物质均可适用,但特别适合分离酚类、醌类、黄酮类化合物。,(1) 聚酰胺的性质及吸附原理,一般认为是通过分子中的酰胺羰基与酚类、黄酮类化合物的酚羟基,或酰胺键上的游离胺基与醌类、脂肪羧酸上的羰基形成氢键缔合而产生吸附。至于吸附强弱则取决于各种化合物与之形成氢键缔合的能力。通常在含水溶剂中大致有下列规律:,形成氢键的基团数目越多,则吸附能力越强。, 成键位置对吸附力也有影响。易形成分子内氢键者,其在聚酰胺上的吸附即相应减弱。,分子中芳香化程度高者,则吸附性增强；反之,则减弱。如：,以上是仅就化合物本身对聚酰胺的亲和力而言。但吸附因为是在溶液中进行,故溶剂也会参加吸附剂表面的争夺,或通过

27、改变聚酰胺对溶质的氢键结合能力而影响吸附过程。显然,聚酰胺与酚类或醌类等化合物形成氢键缔合的能力在水中最强,在含水醇中则随着醇浓度的增高而相应减弱,在高浓度醇或其它有机溶剂中则几乎不缔合。,（2）聚酰胺柱的洗脱,在聚酰胺柱上的洗脱能力由弱至强,可大致排列成下列顺序:水甲醇丙酮氢氧化纳水溶液甲酰胺二甲基甲酰胺尿素水溶液,(3) 聚酰胺色谱的应用,聚酰胺对一般酚类、黄酮类化合物的吸附是可逆的,分离效果好,加以吸附容量又大,故聚酰胺色谱特别适合于该类化合物的制备分离。此外,对生物碱、萜类、甾体、糖类、氨基酸等其它极性与非极性化合物的分离也有着广泛的用途。,6. 大孔吸附树脂,(1) 大孔吸附树脂的吸

28、附原理,大孔吸附树脂是吸附性和分子筛性原理相结合的分离材料,它的吸附性是由于范德华引力或产生氢键的结果。分子筛性是由于其本身多孔性结构的性质所决定。,(2) 影响吸附的因素,比表面积、表面电性、能否与化合物形成氢键,（3）大孔吸附树脂的应用,大孔吸附树脂现在已被广泛应用于天然化合物的分离和富集工作中,如苷与糖类的分离、生物碱的精制。在多糖、黄酮、三萜类化合物的分离方面都有很好的应用实例。,（4）洗脱液的选择,洗脱液可使用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙脂等。根据吸附作用强弱选用不同的洗脱液或不同浓度的同一溶剂。对非极性大孔树脂,洗脱液极性越小,洗脱能力越强。对于中等极性的大孔树脂和极性较大的化合物来说

29、,则选用极性较大的溶剂为宜。,四、根据物质分子大小差别进行分离,1、凝胶过滤法（Gel filtration）,凝胶过滤法也叫凝胶渗透色谱(Gel permeation chromatography)、分子筛过滤（molecular sieve filtration）、排祖色谱（exclusion chromatography），系利用分子筛分离物质的一种方法。其中所用载体，如葡聚糖凝胶，是在水中不溶、但可膨胀的球形颗粒，具有三维空间的网状结构。,（1）原理：分子筛原理。即利用凝胶的三维网状结构的分子筛的过滤作用将化合物按分子量大小不同进行分离。,（2）出柱顺序：按分子由大到小顺序先后流出并得

30、到分离。,（3）常用的溶剂：,碱性水溶液（0.1mol/L NH4OH）含盐水溶液（0.5mol/L NaCl等）醇及含水醇，如甲醇、甲醇水其他溶剂：如含水丙酮，甲醇-氯仿,（4）凝胶的种类与性质,种类很多，常用的有以下两种： Sephadex-G：葡聚糖凝胶，只适用于水中应用，且不同规格适合分离不同分子量的物质。 Sephadex LH-20：羟丙基葡聚糖凝胶，为Sephadex G-25经羟丙基化后得到的产物，具有以下两个特点：具有分子筛特性，可按分子量大小分离物质；在由极性与非极性溶剂组成的混合溶剂中常常起到反相分配色谱的作用，适合于不同类型有机物的分离。应用最广。,交联葡聚糖的化学结构

31、,五、 根据物质离解度不同进行分离,具有酸性、碱性、两性基团的化合物在水中多呈解离状态，据此可用离子交换法进行分离。,固定相：离子交换树脂,1、离子交换法分离物质的原理,流动相：水或含水溶剂,洗脱液：强酸性阳离子交换树脂（H型）稀氨水洗脱 强碱性阴离子交换树脂（OH型）稀氢氧化钠洗脱,原理：离子交换原理,2、离子交换树脂的结构及性质,强酸性阳离子交换树脂的结构,苯乙烯通过二乙烯苯交联而成的大分子网状结构,根据交换基团不同分为：阳离子交换树脂 强酸性（SO3-H+） 弱酸性（COO-H+）阴离子交换树脂 强碱性N+（CH3）3Cl 弱碱性（NH2及仲胺、叔胺基）,3、分类,4、应用,用于不同电荷

32、离子的分离，如水提取物中的酸性、碱性、两性化合物的分离。用于相同电荷离子的分离，如同为生物碱，但碱性强弱不同，仍可用离子交换树脂分离。,色谱是研究并应用于分离分析领域的一门科学技术，比较公认的色谱定义是：由于物质的吸着程度不同，在外加流体的作用下引起微分的滞留作用的差异。根据移流相的不同，可分为气相色谱，液相色谱，超临界流体色谱。根据固定相的不同，分离机理的不同，再分为气液色谱、气固色谱、填充柱色谱、毛细管柱色谱，凝胶色谱、纸色谱、薄层色谱、毛细管电泳、逆流色谱及场流色谱（单相色谱）等。,2.2色谱分离分析方法,一、纸色谱,纸色谱法，系以纸为载体，以纸上所含水分或其他物质为固定相，用展开剂进行

33、展开的分配色谱。供试品经展开后，可用比移值(R)表示其各组成成分的位置（比移值原点中心至斑点中心的距离原点中心至展开剂前沿的距离）作为化合物的鉴别时，供试品在色谱中所显主斑点的颜色（或荧光）与位置，应与对照品在色谱中所显的主斑点相同。作为化合物的纯度检查时，可取一定量的供试品，经展开后，按各药品项下的规定，检视其所显杂质斑点的个数或呈色（或荧光）的强度。作为化合物的含量测定时，将主色谱斑点剪下洗脱后，再用适宜的方法测定。,(1) 下行法将供试品溶解于适当的溶剂中制成一定浓度的溶液。用微量吸管或微量注射器吸取溶液，点于点样基线上，溶液宜分次点加，每次点加后，俟其自然干燥、低温烘干或经温热气流吹干

34、，样点直径为24mm，点间距离约为1.52.0cm，样点通常应为圆形。将点样后的色谱滤纸上端放在溶剂槽内并用玻棒压住，使色谱纸通过槽侧玻璃支持棒自然下垂，点样基线在支持棒下数厘米处。展开前，展开室内用各品种项下规定的溶剂的蒸气使之饱和，一般可在展开室底部放一装有规定溶剂的平皿或将浸有规定溶剂的滤纸条附着在展开室内壁上，放置一定时间，待溶剂挥发使室内充满饱和蒸气。然后添加展开剂使浸没溶剂槽内的滤纸，展开剂即经毛细管作用沿滤纸移动进行展开，展开至规定的距离后，取出滤纸，标明展开剂前沿位置，待展开剂挥散后按规定方法检出色谱斑点。(2) 上行法点样方法同下行法。展开室内加入展开剂适量，放置俟展开剂蒸气

35、饱和后，再下降悬钩，使色谱滤纸浸入展开剂约0.5cm,展开剂即经毛细管作用沿色谱滤纸上升，除另有规定外，一般展开至约15cm后，取出晾干，按规定方法检视。展开可以向一个方向进行，即单向展开；也可进行双向展开,即先向一个方向展开,取出，俟展开剂完全挥发后，将滤纸转动90,再用原展开剂或另一种展开剂进行展开;亦可多次展开、连续展开或径向展开等。,二、薄层色谱,1定义：将固定相均匀涂布在表面光滑的平板上， 形成薄层而进行色谱分离和分析的方法2操作过程：铺板 活化 点样 展开 定位(定性)/洗脱(定量)3分离机制：吸附（分配，离子交换，空间排阻）4特点：分析快速、灵敏、显色方便5应用：化合物杂质检查、

36、纯度测定,Rf值：是样品在流动相与固体相中运动的状况，也就是溶质移动和流动相移动的关系Rf=展开后原点与斑点的距离 原点与溶剂前沿间距离,三、柱色谱法,1.吸附柱色谱 A.吸附剂的填装 干法 湿法 B.样品的加入 C.洗脱2.分配柱色谱,柱色谱,柱色谱常用的有吸附色谱和分配色谱类。前者常用氧化铝或硅胶为吸附剂。后者以硅胶，硅藻土和纤维素为支持剂，以吸收大量的液体为固定相,当加入的洗脱剂流下时，由于不同化合物吸附能力不同，因而以不同的速度沿柱向下流动，继续洗脱时，吸附能力弱的组分随溶剂首先流出。在连续洗脱过程中，不同组分或不同色带就能分别收集，从而达到分离纯化的目的。,柱色谱的吸附剂常用的吸附剂

37、：氧化铝，硅胶，氧化镁，碳酸钙，活性炭或纤维素粉。选择吸附剂的首要条件：不与被分离物或展开剂发生化学反应。吸附能力与以下几点有关：（1）吸附剂颗粒大小（2）吸附剂含水量,柱色谱溶剂通常根据被分离物中各组分的极性、溶解度和吸附活 性等来考虑。先将带分离的样品溶于尽量少的非极性溶剂中，从柱顶流入柱中，依次增大溶剂的极性，将不同化合物依次洗脱。常用洗脱剂的极性：石油醚 环己烷 四氯化碳 甲苯 苯 二氯甲烷 氯仿 乙醚 乙酸乙酯 丙酮 乙醇甲醇 水 乙酸,四、快速柱色谱,狭义的快速色谱是指用压缩气体产生压力，加速流动相洗脱速度的低压短柱制备液相色谱系统，广义的快速色谱系统是指一切输液方式的中低压液相色

38、谱系统。快速色谱有人还译为“闪式色谱”“FLASH色谱”。优点：1、速度快，一般为开口柱色谱分离时间的1/8，节省时间，样品变化分解慢2、制备量大，比同样直径的HPLC制备柱，至少可多上一倍量样品。3、成本低，首先仪器设备低于HPLC；其次，使用溶剂比玻璃柱节省，硅胶柱可多次使用，节省硅胶用量。4、使用简单，不需要特殊溶剂处理，样品可以干法上样，人员不需要经过特殊培训。,五、真空液相色谱（VLC）,优点：操作快速简便，高效低廉，样品处理大，特别适用于天然有机化合物以及多量有机反应产物的纯化与分离,六、制备薄层色谱法七、逆流色谱法八、高效毛细管电泳九、高效液相色谱法十、气相色谱法,2.3结晶和重

39、结晶（自学）,结晶的目的是为了进一步分离纯化，便于进行化学鉴定及结构测定纯化合物的结晶有一定的熔点和结晶学特征，这有利于化合物性质的判断，所以结晶是研究分子结构的重要步骤,1、结晶,结晶是利用温度不同引起溶解度的改变而使有效成分以晶体的形式析出以达到分离物质的目的。,（1）杂质的除去：天然产物经过提取分离所得到的成分，大多仍然含有杂质，或者是混合成分。有时即使有少量或微量杂质存在，也能阻碍或延缓结晶的形成。所以在制备结晶时，必须注意杂质的干扰，应力求尽可能除去。,（2）溶剂的选择：制备结晶，要注意选择合宜的溶剂和应用适量的溶剂。合宜的溶剂，最好是在冷时对所需要的成分溶解度较小，而热时溶解度较大

40、。溶剂的沸点亦不宜太高。,（3）结晶溶液的制备 ：制备结晶的溶液，需要成 为过饱和的溶液。,（4）制备结晶操作：溶解，过滤，浓缩，放置，析出,（5）重结晶及分步结晶：晶态物质可以用溶剂溶解再次结晶精制。这种方法称为重结晶法。结晶经重结晶后所得各部分母液，再经处理又可分别得到第二批、第三批结晶。这种方法则称为分步结晶法或分级结晶法。,（6）结晶纯度的判定：化合物的结晶都有一定的结晶形状、色泽、熔点和熔距，一可以作为鉴定的初步依据。,检查纯度的方法： 外观、颜色、形态是否均一； 测定各种物理常数，如熔点、沸点、比旋光度、折光率等，这些物理常数都反映了化合物的纯度。 如果可能是已知物，用已知结构的对

41、照品进行对照 测定或测定它们的共熔点等，也可对照文献报导值（注意各种测定条件的一致性） 薄层层析（三种展开系统和三种显色方法） 高效液相层析，,作业：结晶的条件结晶溶剂的选择制备结晶的方法不易结晶或非晶体化合物的处理结晶纯度的判断,结晶最适宜的温度为什么是形成结晶的关键结晶形成过程包括哪两部分什么是诱导晶核形成的有效手段如果没有晶种时,可用什么方法诱导形成结晶化合物不结晶的两个原因：单纯化合物结晶的熔点熔距应在 左右，因结构原因可允许 内 哪些化合物具有双熔点的特性最简便的纯度检查方法,结晶最适宜的温度为 5-10什么是形成结晶的关键 选择合适的溶剂结晶形成过程包括哪两部分 晶核的形成与结晶的

42、生长什么是诱导晶核形成的有效手段 加晶种如果没有晶种时，可用什么方法诱导形成结晶 用玻璃棒摩擦玻璃容器内壁化合物不结晶的两个原因： 本身性质，纯度不够单纯化合物结晶的熔点熔距应在 左右，因结构原因可允许 内 0.5， 1-2哪些化合物具有双熔点的特性 与糖结合的苷类化合物最简便的纯度检查方法 薄层色谱法,2.4天然产物化学成分的结构鉴定,天然产物化学成分的一般鉴定方法结构研究中采用的主要方法一些天然产物结构的光谱特征,一、天然产物化学成分的一般鉴定方法,1.已知化合物鉴定的一般程序测定样品熔点，与已知品的文献值对照，比较是否一致或接近。测定样品与标准品的混溶点，所测值不下降。将样品与标准品共薄

43、层色谱或纸色谱，比较其Rf值是否一致。测样品的红外光谱或标准谱图进行比较，是否完全一致。,2.未知化合物的结构测定方法测定样品的物理常数，如熔点或沸点，比旋度或折光率等，查文献，初步判断样品是已知还是未知物，若是未知物，按以下程序：进行检识反应，确定样品是哪个类型的化合物，如生物碱、黄酮、强心苷等分子式的测定，通过元素分析和分子量的测定，计算其分子式。MS结构分析，测样品的UV、IR、MS、NMR结构验证,结构测定的一般程序,纯度鉴定,推测母体结构类型功能基情况,分子量分子式的确定,波谱、化学方法推测出结构式,人工合成进行确认,结构测定,化学方法辅助手段,某些成分或功能基，可以和一些特定试剂产

44、生各种颜色或沉淀，有助于判断化合物类型和功能基： 生物碱类大都能和生物碱沉淀试剂产生沉淀； 羟基蒽醌类遇碱呈红色； 盐酸一镁粉试剂能和许多黄酮类化合物呈色，鉴别功能基的化学反应：三氯化铁反应、三氯化铝反应等等。 利用在酸水或碱水中的溶解度情况，提示该化合物碱性功能基或酸性功能基的存在以及有无内酯、内酰胺结构。,化学方法辅助手段, 化学降解法-将复杂分子通过氧化、还原等化学反应，降解为几个结构比较简单又稳定的小分子化合物，通过对降解产物的结构鉴定，再按降解机理合理地推导出原来可能的化学结构式； 特点： 需用化合物量大； 反应剧烈； 主要产物得率少又费时； 现在较少应用，仅保留一些比较简单规律性又

45、较强的降解反应 衍生物制备-用化学方法研究结构的一种常用手段，对结构推定有一定意义；,二、结构研究中采用的主要方法,1确定分子式并计算不饱和度A元素定量分析配合分子量测定B同位素峰度比法C高分辨质谱,波谱方法主要手段,UV：判断分子结构中是否存在共轭体系IR：确定分子结构中的官能团MS：可确定分子量，计算分子式，解析分子结构NMR 1H-NMR：可以得知共振原子的相对数目及化学环境 13C-NMR：推导化合物的基本骨架,光谱,紫外光谱：用波长在200-400nm之间的连续光扫描记录下来的图谱，吸收带比较宽；红外光谱：用波长在800nm-20m之间的连续光扫描记录下来的图谱，谱线比较尖锐；,紫外

46、光谱(Ultra-Violet, UV),测定范围：波数200400nm 之间，作用： 提供基本骨架信息; 样品中杂质的测定 定量分析特点： 液态样品才能测定； 常规紫外光谱仪价格低廉；,生色团：产生紫外吸收的不饱和基团，如C=C, C=O, O=N=O等；助色团：其本身是饱和基团（常含有杂原子），它连到生色团上时，能使后者吸收波长变长或吸收强度增加，如-OH, -NH2, -Cl等；深色位移：由于基团取代或溶剂效应，最大吸收波长变长，也叫红移（red shift）；浅色位移：由于基团取代或溶剂效应，最大吸收波长变短，也叫蓝移（blue shift）；,紫外光谱(Ultra-Violet, U

47、V)的重要概念,具有相同基本骨架化合物的UV光谱相同，但并非是同一化合物；,红外光谱(Infra-Red, IR),测定范围：波数6254000cm -1之间，其中1500cm-1以上为化合物的特征基团区，1500-600cm-1为指纹区。作用：主要用于定性分析，功能基的确认，芳环取代类型的判断等。优点： 任何气态、液态、固态样品均可测定； 每种化合物都有红外吸收； 常规红外光谱仪价格低廉；,特征基团区,指纹区,三要素：位置、强度、峰形,-OH,CH3OH,C=O, 如果被测定物是已知物，只要和已知对照品做一张共红外光谱图，二者红外光谱完全一致则为同一物质； 如无对照品也可检索有关红外光谱数据

48、图谱文献。,核磁共振谱(Nuclear Magnetic Resonance, NMR), 1945年，F. Bloch和E. M. Purcell 几乎同时发现了核磁共振现象，获得1952年诺贝尔物理奖核磁共振：天然药物化学成分以有机物为主，分子结构中必然有C、H原子，它们的结合类型、化学环境不同，均可用NMR测定，是天然化合物结构测定的重要手段。,氢核磁共振（1H-NMR)谱,碳核磁共振（13C-NMR)谱, 氢核磁共振（1H-NMR)谱： 化学位移范围：在020 ppm 三大要素：化学位移(H)、偶合常数(J)及峰面积。 灵敏度高，样品用量少（1-5 mg），测试时间短碳核磁共振（13C

49、-NMR)谱： 化学位移范围：在0250 ppm 要素：化学位移(C) 灵敏度较低，样品用量较多（5-20 mg），测试时间长,C=O,C=C-O,CH2,溶剂,C=C,二维核磁共振谱,适用范围：信号过于复杂、重叠严重时，而对结构推断产生困难时，可以简化谱图，有助判断；特点： 对测试仪器要求比较高（超导核磁共振仪）； 谱图测试价格比较贵； 测试时间长，样品用量比较多（只需5-20 mg）,NOESY,HMQC,质谱（MS）,作用： 用于确定分子量； 求算分子式； 提供其他的结构信息；特点： 适宜测定极性偏小和中等极性的化合物； 常规质谱仪价格比较便宜，一些特殊质谱仪很昂贵；,1243.8M+Na+,1219.7M-H-,ESI-MS,MW=1218,C58H94O27,三、一些天然产物的光谱特征,