流式细胞术在哺乳动物精液质量检测中的应用.docx

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1、流式细胞术在哺乳动物精液质量检测中的应用* 基金项目：国家自然科学基金（39970117）；中国科学院重大项目（KZ952-J1-109）采克俊1,2，司 维1,2，李亚辉1,2,3，季维智1,4 通讯作者（Corresponding author）,Tel: 0871-5139413, E-mail: wjimail.kiz,（1.中国科学院昆明动物研究所，云南 昆明 650223;2.中国科学院研究生院，北京 100039；3.云南农业大学食品科学与技术学院，云南 昆明 650201）摘要：精液检测的首要目标就是快速准确地确定其生育力。同时具备多种特性功能完整的精子才能受精，因而只有同时客

2、观地检测多个指标，才能更好地反映精子的生育力。精子检测的传统方法费时费力，检测精子数量少，指标单一，而且易受操作者的主观影响，不能准确地反映精子功能。流式细胞术(FCM)为精子功能研究提供了一种快速、客观、多指标、大通量的检测手段；利用FCM检测精子的质膜完整性、顶体状态、染色质结构、线粒体功能以及细胞凋亡等，可以得知精子的相关功能情况。随着新的荧光探针、染色方法的不断开发和改进，FCM为精液质量检测提供了一种新的检测平台，应用前景极其广阔。关键词：流式细胞术；精子；检测；荧光探针Evaluation of Mammalian Semen Quality by Flow CytometryCA

3、I Ke-jun1,2, SI Wei1,2, LI YA-hui1,2,3, JI Wei-zhi1,4(1. Kunming Institute of Zoology, the Chinese Academy of Sciences, Kunming 650223, China;2. Graduate School, the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039, China3. College of Food Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 6

4、50201 ,China)Abstract: The primary goal of all semen analyses is to accurately determine the fertilizing potential of a semen sample rapidly. Since a spermatozoon must possess many attributes in order to fertilize an oocyte, the only way that we can more precisely predict the fertility is to develop

5、 unbiased assays that measure several sperm traits simultaneously. Conventional laboratory assays of spermatozoa, using subjective method, many are time consuming, and are necessarily conducted on samples of relatively small size, fall short of predicting the sperm function. Flow cytometry (FCM) per

6、mits us to objectively measure thousands of sperm for multiple characteristics in a short time with minimum preparation. The applications of FCM to evaluation of semen quality including sperm membrane integrity, acrosome status, chromatin structure, mitochondrial function as well as apoptosis etc, p

7、rovide us valuable information regarding sperm function. New fluorescent probes and techniques are continuously being developed. FCM offers powerful tools and exciting opportunities for improving our ability to accurately evaluate semen quality.Key words: Flow cytometry; Spermatozoa; Evaluation; Flu

8、orescent probes精液质量检测在临床治疗不孕症及家畜良种繁殖和育种中具有重要作用。常规的精液检查（精子密度、活力、形态等）重复性差，提供的精子功能的信息非常有限，不能为生育力提供准确评估的依据。其他方法（包括精子染色的显微镜检测、精子-颈粘液相互作用检查、精子穿透去透明带仓鼠卵实验、低渗肿胀实验以及超微结构检查等）虽然可以提供精子功能方面的一些信息，但费时费力；检测精子数量少；指标单一；且易受操作者的主观影响，不能准确反映精子的功能。近年来，随着生殖生物学的发展和人类对辅助生殖技术的迫切需求，基于精子形态学观察为主的传统检测方法已不能满足人们的需要，因而寻找一种快速、准确的精液质量

9、检测方法显得十分迫切。流式细胞术(flow cytometry, FCM)是20世纪70年代发展起来的一种单细胞快速分析技术，已广泛应用于细胞生物学和医学的各个领域。流式细胞术的基本原理是：特异荧光探针标记的单细胞悬液在管道中稳定地流动，细胞一个个依次经过喷嘴，经恒定功率的激光束激发后产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向的光电二极管和侧向的光电倍增管接收，经计算机处理，细胞的一系列特性就被快速准确地测定。在此基础上还可以根据有关参数把所需细胞亚群从整个样品中分选出来。FCM在哺乳动物精子研究中发挥着重要作用：通过分析生精细胞增殖周期研究精子的发生过程；还可根据X、Y精子DNA含量的差异进

10、行精子性别鉴定，即精子分选；检测精液质量。流式细胞仪为精子功能实验提供了快速、客观、多指标、大通量的检测手段，弥补了传统方法的缺陷，成为一种检测精液质量的新平台。随着新的荧光探针和染色方法的不断开发和改进，这一新的检测技术在近20年来应用越来越广泛，也必将在人类辅助生殖技术、畜牧业冻精商业化运作以及珍稀濒危物种的精子冻存研究中展现更加广阔的应用前景。本文就流式细胞仪近年来在检测精子的质膜完整性、顶体状态、染色质结构完整性、线粒体功能、细胞凋亡等方面的应用作一简要综述，并对其应用前景作一展望。1 测定精子的质膜完整性精子的质膜完整性又可称为精子的活力（viability），是检测精液质量的重要指

11、标之一，也是FCM应用最多的领域。对死精子特异的荧光染料有碘化丙锭(propidium iodide，PI)、Hoechst 33258、溴化乙锭(ethidium bromide,EB)、溴乙啡锭二聚体（ethidium homodimer-1,EthD-1）和Yo-Pro-1等，其中PI最为常用。它们是膜不透性的DNA探针，只有质膜破损的精子，染料才能进入细胞与DNA结合。对活精子特异的荧光染料有SYBR-14、羧基荧光素双醋酸盐(carboxyfluorescein diacetate,CFDA)、羧基二甲基荧光素双醋酸盐（carboxy dimethyl fluorescein dia

12、cetate,CMFDA）、Carboxy-SNARF-1和SYTO-17等。它们是膜通透性的染料，能进入细胞膜完整的精子。其中，Carboxy-SNARF-1是一种胞内pH指示剂，在活精子内发橙红色荧光(Pena et al，1999)；SYTO-17标记活精子的细胞核，发红色荧光(Thomas et al,1997)；CFDA和CMFDA是一种非荧光化合物，在活细胞胞内被非特异酯酶水解，形成一种很强的荧光染料，发绿色荧光(Pena et al,1998;Ericsson et al,1989)。这两类染料经常联合使用。对死精子特异的荧光染料虽然可以单独使用，但效果不如联用好。SYBR-14

13、和PI联合使用，可以很好地检测精子活力（Garner et al，1994；Garner & Johnson，1995）。其原理可能是PI进入死精子头部后端，取代了SYBR-14或使SYBR-14的荧光猝灭。样品经流式细胞仪检测可得3种亚群：被SYBR-14染成绿色的活精子，并且比死精子亮得多；被PI染成红色的死精子；同时染上并发出两种荧光的双阳性精子，正处于从活向死的过渡状态。这种方法已用于检测许多物种的精子活力。CFDA、CMFDA、SYTO-17等分别与PI联合染色，通过流式细胞仪检测也可得到类似的3类精子。Carboxy-SNARF-1也可以和PI联合使用，Carboxy-SNARF-

14、1发橙红色荧光,但其荧光值大大低于PI的荧光值，用同一个探测器也能把两者区别开(Pena et al,1999)。这一组合的优点是可以和发绿色荧光的顶体探针结合。否则只用PI测活力，活精子和颗粒较大的杂质（如蛋黄颗粒）都不能被PI标记，也就不能把两者区分开。Hoechst 33342是一种膜通透性活体染料，死精子和活精子都标记，而PI只标记死精子。本研究室发展了一种仅用紫外激光就同时激发这两种探针来检测精子活力的方法：活精子只被Hoechst 33342标记，发蓝色荧光；死精子为PI阳性，同时也被Hoechst 33342标记，故死精子为粉红色。这一染色方法适用于流式和荧光显微镜检测，且可以和

15、发绿色或黄色荧光的其他探针合用，同时检测多个指标。该方法已成功地用于牛、猕猴、食蟹猴、人、大鼠、小鼠精子活力的检测（资料待发表）。一般认为，在精子活力检测的所有方法中，SYBR-14与PI的联合使用效果最佳。该组合染色时间短，对温度要求不严格，且都是核染料。而其他组合染色时间长，标记的细胞器不同，易出现误差。2 检测顶体状态在受精过程中，哺乳动物刚射出的精子在体内要经过获能和顶体反应，才能穿入卵细胞并与其融合，完成受精。因此检测精子的顶体状态，有助于反映精子的受精能力。金霉素(chlortetracycline,CTC)顶体染色法,是荧光显微镜检测的常用方法，可客观而定量地评价精子获能、顶体反

16、应(DasGupta et al,1993)。但这种染料在FCM检测时不能很好地将获能与未获能的精子分开，而且样品要固定，所以CTC染色法不适用于FCM（Rathi et al,2001）。精子在获能和顶体反应过程中，精子膜外源凝集素受体会发生变化。因此可以利用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的凝集素检测精子的顶体状态。已经有多种凝集素被用于精子顶体状态检测，如花生凝集素（PNA）、豌豆凝集素（PSA）、刀豆凝集素（ConA）和植物血凝素（RCA）等。其中PNA和PSA较常用，PNA效果最好。经电子显微镜观察证实，PNA特异结合顶体外膜（Szasz et al,2000）。FITC-PNA检测顶

17、体反应有两种样品处理方法：样品需要固定，FITC-PNA才能穿过质膜和顶体外膜，标记顶体。顶体完整的精子可结合更多的FITC-PNA，故FITC-PNA荧光值变得更高；而顶体反应后，顶体丢失，FITC-PNA的荧光值又较低(Purvis et al,1990)。死亡降解的精子也会出现顶体丢失，但只有活精子的顶体丢失才能称为真正的顶体反应。因而检测顶体反应必须同时检测精子的活力。Tao et al（1993a）先用Hoechst 33258标记，之后加入一定量鲑鱼精子DNA（SS-DNA）结合多余的染料，洗涤后再固定，再用FITC-PNA标记，Hoechst 33258阴性、PNA阳性者为顶体反

18、应的精子。尽管这种方法可以同时测得精子活力和顶体状态，但该方法较烦琐。不经固定，直接用精子活力染料PI（或Hoechst 33258、EthD-1）和FITC-PNA标记。其结果PI+为死精子；PI/PNA+为顶体反应精子；PI/PNA为顶体完整的活精子(Graham et al,1990；Szasz et al,2000)。凝集素对精子有一定毒性，染色时间不宜过长。此外，荧光素标记的顶体特异性单克隆抗体结合Hoechst 33258的双标记也能检测顶体反应(Tao et al,1993b)。完整顶体的活精子呈酸性，可被嗜酸性探针LysoTracker特异标记，呈绿色荧光。经证明，LysoTr

19、acker阳性率与显微镜观察到的正常顶体的百分率相吻合（Thomas et al,1997）。Ca2+内流是精子获能的一种表现形式，因此可用钙离子探针（如fluo-3和indo-1等）检测Ca2+的浓度变化（Harrison et al,1993）。质膜不稳定性加剧也是精子获能的另一种表现形式，因而也可用疏水性染料与膜不透性探针反映精子获能。精子获能后细胞膜流动性增大，染色强，染料分布在质膜的外层。常用部花青540（merocyanine 54，发射光峰值为570590nm）与Yo-Pro-1（发射光峰值509nm）双标记，可检测到死精子、未获能活精子和获能活精子(Harrison et al

20、,1996)。3 检测精子染色质结构完整性精子染色质结构完整性对于精确传递遗传物质至关重要。精子核高度致密，其DNA与鱼精蛋白紧密结合，这样可以将父方遗传信息准确无误地导入卵，继而传给后代。检测精子染色质结构完整性有PI染色和吖啶橙（acridine orange,AO）染色两种方法。Pasteur et al (1991；1994)在研究人鲜精和冻精的PI染色特性时发现，DNA直方图上有一主峰，该主峰右侧还延伸出一小峰，小峰代表的是核凝聚度降低的精子，其染色质结构不稳定，可染性增强；冻精的主峰及小峰荧光值显著高于鲜精，说明冷冻使精子染色质凝聚度降低，DNA可染性增强。异常精子DNA直方图主峰

21、加宽，右移，出现小的附加峰,DNA荧光值与精子正常形态百分率呈显著负相关（Huang & Pan，1998）。用PI染色来检测精子染色质结构完整性报道的还较少，实验方法还不统一，提供的信息也很较少，故应用并不广泛。广为使用的权威方法是精子染色质结构检测（sperm chromatin structure assay，SCSA）。通过热处理，来自低生育力的牛、小鼠和人精子的染色质更容易变性（Evenson et al，1980）；采用酸变性处理对人和动物精液的研究得到相同的结论(Evenson et al,1999，2000；Bochenek et al，2001)。因而利用染色质异常的精子易受

22、热或酸变性成单链DNA，与染料吖啶橙结合发红色荧光；而染色质正常的精子能保持完整DNA双链结构，与吖啶橙结合发绿色荧光这一特性，样品经热或酸变性处理后，若红光值比例增高，则说明染色质结构异常增加。通过专用软件进行数据处理，SCSA可检测下列参数： t（指红色荧光与总荧光的比值，即 t=红/红+绿）；COMPt( cells outside the main population，指主群以外的精子占总数的比例)；SD t(the standard diviation of alpha t，指 t的标准差)；HIGRN(high green stainability，指绿色荧光可染性增加的精子所占

23、百分数)。SCSA主要用于以下方面。3.1评估精子生育力Evenson et al（1999）提出COMPt是预测妊娠成败的最佳指标，COMPt30可作为评估精子的生育力高低的域值，大于该值的实验组无妊娠成功者。Larson et al（2000）对SCSA在体外受精（IVF）和胞质内单精注射（ICSI）妊娠结果的预测效果进行了研究，发现7例妊娠成功者与14例妊娠失败者相比，其精子的COMPt值差异显著（15.44.6）与（31.13.2），P0.01；认为如果精子的COMPt27，妊娠不能成功。3.2评价各种体外处理技术对精子染色质结构完整性的影响精液的体外处理是否会影响精子DNA完整性是需

24、要慎重考虑的问题。Zini et al （1999；2000）发现，Percoll密度梯度离心处理后，不育组精液DNA变性率（COMPt）明显升高，正常组无显著变化；而上游法可明显改善回收精子的DNA完整性。梯度离心法虽然在精子活动率以及正常形态方面优于玻璃纤维过滤法，后者却能提高精子DNA完整性（SD t）和活力（Larson et al,1999）。这要求重新检查目前常用的精液体外处理技术，避免造成对精子染色质结构完整性的破坏。3.3评估癌症治疗以及各种外源因素对精子发生的影响Kobayashi et al（2001）发现绝大多数癌症患者精子的DNA损伤普遍存在，t、COMPt值显著高于正

25、常对照组。术前染色质结构正常的睾丸癌患者，比异常者更易恢复精子发生（Fossa et al,1997）。小鼠睾丸若暴露于高于正常生理温度的环境中，会损伤精子染色质结构完整性，这一指标比精子头部形态检测更灵敏（Sailer et al,1997）。Bonde et al(2002)对带铅环境下作业的工人检测发现，血液中铅浓度高者，精子DNA更易变性。SCSA也能很好的监测各种化疗药物对精子发生的影响（Spano et al,1996）。4 检测精子的线粒体功能线粒体的主要功能是产生能量，为精子运动提供ATP。常用的检测线粒体功能的荧光探针有：Rhodamine 123（R123）、MITO和JC

26、-1。R123是一种能渗透入细胞，带阳离子的荧光探针，发绿色荧光。R123可检测精子线粒体有无功能，但不能区别线粒体膜电位的高低。MITO是一种新型线粒体探针，在水溶液中并不发荧光，而当积聚在线粒体内，不论其膜电位如何皆发绿色荧光。JC-1在检测精子线粒体膜电位方面具有重要作用：在精子线粒体膜电位低时，以单体形式存在，发绿色荧光；当膜电位高时，形成J-聚体，发橙色荧光。Garner et al（1997）对3种染料作了比较研究，发现三者都与镜检活动精子百分率高度相关。其中，JC-1的阳性率最高，MITO的最低；R123和MITO只有一群阳性，而JC-1可反映出线粒体膜电位高低的两群；JC-1染

27、色的特异性最好，仅在线粒体部位发黄色或绿色荧光，R123在精子头部和尾部有非特异性染色，MITO只在精子头部有非特异性染色。目前认为JC-1是检测精子线粒体功能最适合的探针。用JC-1对大鼠精子检测中发现在精子中段线粒体部位发黄色或绿色荧光，反映其膜电位的高低，说明JC-1对精子线粒体染色的特异性很好；流式检测JC-1的染色模式与分组精子的预期结果高度相关（Gravance et al，2001)。在牛、马的精子检测中也得到相似的结果(Garner et al,2001；Gravance et al，2000)。线粒体特异的荧光探针经常和检测精子活力的探针同时使用。Evenson et al(

28、1982)用Rhodamine 123和EB染色，同时检测人精子活力和线粒体功能。发现精子摄取R123到达平衡的速度较快，只需10min；R123阳性率与精子活动性相关，反映线粒体的功能变化。Auger et al（1993）用R123与PI双重染色，流式检测结果为：死精子为PI阳性、R123阴性；有线粒体功能的活精子为PI阴性、R123阳性；已无线粒体功能的活精子为PI、R123双阴性；PI、R123双阳性的精子不记数。Thomas et al(1998)用JC-1和PI联合使用对牛精子线粒体功能进行检测，能分辨出精子死活和线粒体功能的高低，并证明JC-1是检测精子经过冷冻过程后受损程度的最

29、可靠指标。但该方法有一缺陷，JC-1的J-聚体发出的橙色荧光，会与PI的红色荧光部分重叠(Garner & Thomas,1999)。因此，还需要探索新的染色方法，更准确地检测精子的线粒体功能。5 检测精子凋亡尽管精子作为一种终端的不能分裂的细胞，是否存在凋亡目前尚无定论。但研究人员已经采用检测体细胞凋亡的方法来检测精子的质量。而FCM被认为是当今检测凋亡最敏感、最可靠的手段。常用的方法是Annexin V /PI双染法和末端标记法（TUNEL）。Annexin V /PI双染法的原理是：在凋亡的早期阶段，磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内层转移到细胞膜外层；Annexin V为一种依赖于Ca2+

30、的磷脂蛋白（一般用FITC标记），对PS有高度的亲和力，可用来探测PS是否暴露在细胞膜外表面；结合PI染色，可区分坏死和凋亡。凋亡细胞为Annexin V阳性、PI阴性。TUNEL法的原理是：凋亡细胞DNA断裂后，其缺口3端可在末端脱氧核苷酸转移酶作用下结合FITC标记的dUTP，或者结合BrdU，BrdU再与FITC标记的抗体孵育。凋亡细胞为FITC阳性。两种方法相比，Annexin V /PI联染法样品不需固定，更方便易行。Glander et al(1999)的结果表明，Annexin V /PI联染法可很好的用于精子质量检测。精子冷冻后其Annexin V阳性率明显升高，并同精子的不同

31、运动参数高度相关。Oosterhuis et al(2000)用Annexin V /PI联染法和TUNEL法检测了人新鲜精液的凋亡情况，发现两种方法检测到的凋亡率均为20%左右，无显著性差异；Annexin V阴性率与精子浓度和活动率，以及dUTP阳性率与精子浓度，都呈高度负相关。Anzar et al(2002)用上述两种方法检测了牛新鲜精液和冻精的凋亡情况，并与繁殖率作了比较，两种方法都检测到冷冻使精子凋亡率升高，TUNEL法检测到的鲜精凋亡率高于Annexin V/PI双染法。新鲜精液中凋亡精子的出现可能是其低生殖力的原因之一。Annexin V /PI双染法检测到的鲜精活力小于SYB

32、R-14/PI双染的测量值。前者能在分子水平灵敏地检测精子细胞膜的变化，因而是更准确可靠的指标。Sun et al（1997）用TUNEL法检测人精子DNA的片断化，发现DNA的片断化与精子活动率、正常形态、精子浓度、体外受精率、胚胎发育率成反比；吸烟者比不吸烟者精子DNA的片断化比例要高。Muratori et al（2000）也报道精子DNA的片断化与精子前向运动率呈负相关，与精子畸形呈正相关；但电镜观察并未发现DNA片断化的精子出现凋亡相似的形态学变化，即出现凋亡小体。Gadella et al(2002)发现，猪精子获能后可检测到高水平的PS,但TUNEL法检测无显著变化，推测精子不出

33、现凋亡。无论如何，这两种方法都适合检测精子的质量。Annexin V /PI双染法可检测精子质膜的稳定性，TUNEL可检测精子DNA是否断裂。6 测量精子浓度及其他精子浓度是精液的一个基本指标。通常用血球记数仪来计数，但该方法准确性差。由于至今还未发现精子表面的特异标志，故不能像淋巴细胞那样进行流式绝对计数。Evenson et al(1993)曾经介绍过一种用AO或PI标记精子DNA，结合已知浓度的标准荧光微球来计算牛精子浓度的方法。在此基础上，Eustache et al(2001)利用精子的散射光特性反映精子的大小和颗粒度，以及DNA的PI染色，经过两次设门，可以准确地计算人精子的浓度。

34、该方法与血球计数仪检测相比，变异性很小。此外，FCM也用于检测精液中的淋巴细胞和抗精子抗体，精子脂质过氧化以及表面分子的表达，还可进行精子泛素标记免疫检测等。7 总结与展望精子检测的首要目标就是快速准确地确定其生育力。虽然常规检测方法很重要，但其在预测精子生育力方面的缺点显而易见。精子需要同时具备多种特性和功能才能受精，因而任何单独一种参数都无法完全反映其生育力。只能同时检测多个指标，才能更好地反映精子的生育力。FCM的优点是可以快速地同时测定多个指标；只有样品中的颗粒被检测，不必洗掉游离的染料；大多数试验也不需要固定，这种方法很适合自然状态下的精子的检测。由于对精子运动性检查的变异性较大，若

35、不直接测定精子运动参数，而用FCM客观地检测精子的质膜完整性、顶体状态以及线粒体膜电位的变化，即可得知精子功能的情况。精子染色质结构检测是预测精子生育力的最佳指标，这一方法在人类辅助生殖技术和家畜生殖工程中得到了重视和推广，且样品可冷冻待测，运输方便，使SCSA应用非常灵活。随着新的荧光探针的不断开发，染色方法的改进，试剂盒的广泛使用以及激光技术、电脑技术的迅速发展，FCM将更加方便快捷，并可进行多种染料联合使用，进行多色分析，同时检测多个指标，准确反映精子的功能。但FCM应用于精液质量的检测，很多还处于实验室研究阶段。试验主要在人，家畜（牛、羊、马、猪、狗、兔）及实验动物（大鼠、小鼠）中进行

36、，在野生动物方面还未见报道。目前，我室已成功地将FCM用于猕猴（Macaca mulatta）、食蟹猴（Macaca fascicularis）鲜精及冻精质量的检测，利用Hoechst 33342/PI/R123 三色标记，可同时检测精子活力和线粒体功能；利用Hoechst 33342/PI/FITC-PNA三色标记，同时检测精子活力和顶体状态（资料待发表）。FCM要作为常规检测手段，解释须慎重，需要同荧光显微镜结合使用，与传统方法相互验证，积累更多更可靠的数据，最终确证各方法的可靠性和权威性，并使各方法标准化。 图1：SYBR-14阳性为活精子，PI 图2：CFDA/PI双标记测精子活力。

37、图3：SNARF/PI/FITC-PSA 三标记。阳性为死精子，双阳性处于从活到 Region G为活精子（CFDA+/PI-）； 左下角为杂质。可检测出三群：荧光死的过渡状态。 H 为双阳性；E为死精子（CFDA-/PI+） 值低的为活精子；低绿光，高红光的为 死精子；高绿光，高红光的为顶体受损 的死精子 图5：FITC-PNA/PI双标记检测精子顶体状态。 图6 Merocyanin/Yo-pro双标记检测精子获能。B为对照，B为对照，C为诱导顶体反应的检测结果。可 C为诱导获能的检测结果。可分为四群：Mero +/Yo-pro 分为四群：FITC-PNA+/PI 为顶体反应的活精子； 为

38、获能的活精子；Mero +/Yo-pro I +为获能的死精子；FITC-PNA+/PI +为顶体受损的死精子；FITC-PNA/PI Mero/Yo-pro 为未获能的活精子；Mero/Yo-pro +为死精为顶体完整的活精子；FITC-PNA/ PI +为顶体完整 子的死精子。 图4： Hoechst 33342/PI双标记测精子活力。 图8 JC-1/PI双标记检测精子线立体功能。分为三群：Hoechst 33342高染为活精子；PI阳性为死精子； PI阳性为死精子；J-aggregates为线立体功能高中间为过度状态。 的活精子；Monomers为线立体功能低的活精子。 图7：SCSA检测精子染色质完整性。A，C 为生育组精子；图9 Annexin V/PI双标记检测精子凋亡。A为利用散射光B，D为不育组精子。 选出精子。PI阳性为死精子；Annexin V +/PI 为凋亡精子； Annexin V /PI 为活精子。图10 TUNEL检测精子凋亡。A为阴性对照，未表记；B为阳性对照，Dnase 消化； C划线区域为凋亡部分。