DNARNA合成常见问题解答.docx
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1、DNA/RNA合成 常见问题解答处理和保存1. 如何保存寡核苷酸?2. 如何重悬寡核苷酸?3. 如果寡核苷酸在室温中放置超过一星期,还可以使用吗?4. 荧光染料标记的寡核苷酸,在储存和使用过程中必须特殊处理吗?纯化和浓缩5. 如何定量合成的寡核苷酸?6. 如何通过紫外吸光度值来定量寡核苷酸?7. 如一个18个碱基的寡核苷酸包括3个dG,4个dC,5个dA和6个dT, OD值是0.7,那 么它的量是多少?8. 如何计算寡核苷酸的分子量?9. 如何测定寡核苷酸的质量?10. 如何测定寡核苷酸的质量?11. 如何测定合成的寡核苷酸的Tm值?12. 为什么Bioneer提供的Tm值和我们的Tm值不同?
2、13. 用什么方法调整寡核苷酸的浓度?14. 单位换算表合成与订购15. 如何合成寡核苷酸?16. 标准寡核苷酸结构17. Bioneer能合成的最长的寡核苷酸是多长?18. 当我预订50nmol的寡核苷酸,产品却不足50 nmol,为什么?19. 能合成出高百分比“G”的寡核苷酸吗?20. 能提供寡核糖核酸(RNA)合成吗?21. 合成的寡核苷酸在3 或5位有磷酸基吗?22. 简并引物及通用引物是什么?纯化方法23. 怎样纯化合成的寡核苷酸?24. 用于芯片分析的60 mer寡核苷酸如何被纯化呢?修饰寡核苷酸25. 修饰寡核苷酸26. 作为反义脱氧寡核苷酸的硫磷酰化寡核苷酸实验27. 怎样制
3、备双链DNA?Q1. 如何保存寡核苷酸? TOP 通常,寡核苷酸应该-20保存,该温度下能稳定保存一年以上。寡核苷酸在溶液中较为稳定,但易被污染的核酸酶降解,因此我们建议应干燥储存。若要以溶液形式储存,最好将其分装在几管中分别保存,反复冻融会使寡核苷酸降解。另外,酸性条件下,DNA会因为脱嘌呤作用而降解;碱性条件会使磷酸二酯键水解断裂。Q2. 如何重悬寡核苷酸? TOP 为便于长期保存,我们建议使用TE缓冲液(10 mM Tris-HCl,1 mM EDTA, pH8.0),而不用无菌水来溶解寡核苷酸。重悬后,寡核苷酸应该在-20癈保存以长期使用。寡核苷酸在无菌水中很难溶解,加一定量的NaOH
4、有助于寡核苷酸在水中溶解。Q3. 如果寡核苷酸在室温中放置超过一星期,还可以使用吗? TOP 脱水的寡核苷酸是长期稳定的。即使在溶液状态寡核苷酸也相当稳定,通常情况(没有引入使寡核苷酸降解的污染物)即使在室温中放置超过一星期也能使用。Q4. 荧光染料标记的寡核苷酸,在储存和使用过程中必须特殊处理吗? TOP 如果暴露在光线下,荧光染料标记的寡核苷酸比未标记的寡核苷酸更易降解,荧光强度会逐渐降低。为了保持其荧光效能,荧光染料标记的核苷酸应避光-20保存。由于Cy3和Cy5在pH大于9时易被降解,所以Cy3和Cy5修饰Q5. 如何定量合成的寡核苷酸? TOP 合成的寡核苷酸的量非常少,不能直接称重
5、来定量。通常通过测量紫外吸光度值(OD值)来定量。Q6. 如何通过紫外吸光度值来定量寡核苷酸? TOP 寡核苷酸的量经常用OD值来描述。1个OD值是体积1ml寡核苷酸溶液,在内径1cm的比色杯中的吸光度值,约为33 mg寡核苷酸,序列不同的寡核苷酸OD值有所不同。因为在260nm处单个碱基的吸光度值是已知的,所以序列已知的寡核苷酸的浓度就可以测定。dT: 8.8 ml/moldG: 11.7 ml/mol dC: 7.3 ml/mol dA: 15.4 ml/mol 对于一段寡核苷酸,它的吸光度等于每个碱基的数目乘以它的吸光系数,然后将4种碱基的结果加起来就是整个寡核苷酸的吸光度。它的浓度可通
6、过下式来计算 :O.D. =C (内径1 cm的比色杯)Q7. 如一个18个碱基的寡核苷酸包括3个dG,4个dC,5个dA和6个dT, OD值是0.7,那么它的量是多少? TOP首先,用下面公式计算18个碱基的寡核苷酸的吸光度是多少 : = 11.7 3 + 7.3 4 + 15.4 5 + 8.8 6 = 194.1 (ml/ mmole)然后,通过下式来计算寡核苷酸的浓度:O.D. =C,C = O.D./CC = 0.7 /194.1 = 0.0036 (mol/ml) = 3.6 (nmol/ml)最后,OD值为0.7的18个碱基寡核苷酸的浓度是3.6nmol。Q8. 如何计算寡核苷酸
7、的分子量? TOP寡核苷酸的分子量可以通过下式进行计算:M.W. =(NA 249.2) + (NC 225.2) + (NG 265.2) + (NT 240.2) + (寡核苷酸长度-1) 63.98 + 2.02NA =总 A数NC = 总C数NG = 总G数NT = 总T数Q9. 如何测定寡核苷酸的质量? TOP 通常,合成的寡核苷酸的质量用摩尔数来描述,常用nmol。用寡核苷酸的摩尔数或寡核苷酸的分子量可以计算寡核苷酸的量: 寡核苷酸质量(ng) =分子量(M.W.)摩尔数(nmol)Q10. 如果不知道寡核苷酸的碱基组成,有什么办法来定量合成的寡核苷酸? TOP 1 OD值 的单
8、链寡 核苷酸大约33 mg,双链 寡 核 苷 酸 约为 50.mg。然而对于较短的寡核苷酸,上述值偏差较大。因此,最 好 用 Q6 中 提 到 的 适合于短 寡 核 苷 酸 质 量的计算方法,可以 得 到 更 精 确的 结 果。Q11. 如何测定合成的寡核苷酸的Tm值? TOP Tm(解链温度)是指50%双链被解开成单链时的温度。寡核苷酸浓度和盐浓度会影响Tm值的大小。Tm 值 有 多 种 计 算 方 法 。我 们 使 用 近 邻 法 ( P N A S 8 3 ,3 7 4 6- 5 0 )来计算。用这种方法计算前,也有多种方法来估测。如果是15个碱基以下,那么有一种好的方法来估算,对于A和
9、T,可以乘以2癈,对于C和G,可以乘以4癈然后相加,这叫做Wallace法则。 Tm= 2 (A + T) + 4 (G + C)另一种方法来估计长链中GC含量Tm = 81.5 + 0.41(%GC) - 500/L + 16.6 logM(L:寡核苷酸的长度;M:1价阳离子的浓度) 但这些方法不能消除碱基堆积的影响,结果并不准确,所以近邻法被广泛的应用。但是,对于在60-70 bp或15bp以下的寡核苷酸的测定,近邻法还是有缺点。 Bioneer使用的近邻法具有新的特点。它考虑到在退火过程中不同的碱基序列的影响,并且通过热力学来测定,可以更有效的测定Tm值。比如5 -GC-3 和5 -CG
10、-3的序列用热力学方法测定结果是不同的。计算方法如下: 依靠热力学方法,焓和熵通过两个碱基来确定。salt是指一价阳离子的浓度,Oligo是指反应过程中的寡核苷酸浓度。R是指气体常数(1.987 calK-1mol-1)。Bioneer用近邻法计算Tm值时,使用的是50 mM的盐浓度和1 nM的寡核苷酸的浓度。 Bioneer会给每一个用户提供Tm值,但这只是估计值,我们不能保证精确性,因此这个值仅供用户参考。如果没有扩增出产物,你可以把退火温度降到Tm值以下45癈。如果有许多非特异性的产物,你需要改变实验条件如提高退火温度以得到正确的产物。Q12. 为什么Bioneer提供的Tm值和我们的T
11、m值不同? TOP Bioneer使用的Tm值的计算方法和我们通常的计算方法是不同的。我们通常只是简单的乘以A、G、C、T的数目,但序列不同碱基的Tm值亦会不同。如Tm值取决于序列中的每一个碱基,即使碱基数相同但序列不同时,Tm值也将不同。Q13. 用什么方法调整寡核苷酸的浓度? TOP 首先,在Bioneer提供的数据表或报告单中的100 pmol/靗,是用来加入TE缓冲液或无菌水,以使管中寡核苷酸的终浓度达到100 pmol/靗。例如,数据表或报告单中是189.0和209.2时,则应向两个管中分别加入相应量的无菌水,即可使每个管中的寡核苷酸浓度达到100 pmol/l。每一个管中寡核苷酸含
12、量通过下式可以计算如下:189.0l100 pmol/l = 18,900 pmol = 18.9 nmol,209.2l100 pmol/l = 20,920 pmol = 20.92 nmol如果所要的终浓度是0.5M,pmol/l需要换M。100 pmol/l = 100 106pmol/106l = 100106 10-12mol/L = 10-4mol/L= 10-4106 mol/L= 102mol /L= 100 M终浓度换算为100M,如果需要的浓度是0.5M的,加入终体积的1/200的引物量,以使引物终浓度为0.5M。PCR反应的终体积是50l,所以需要加50/200 = 0
13、.25l的引物,以使终浓度达到0.5M。Q14. 单位换算表 TOP科学系统单位: 10-1 = deci d 101 = deca da 10-2 = centi c 102 = hecto h 10-3 = milli m 103 = kilo k 10-6 = micro m 106 = mega M 10-9 = nano n 109 = giga G 10-12 = pico p 1012 = tera T 10-15 = femto f 1015 = peta P 10-18 = atto a 1018 = exa E 10-21 = zepto z 1021 = zetta Z
14、10-24 = yocto y 1024 = yotta Y-寡核苷酸单位换算的例子:1 pmol/l= 110-12 mol/110-6L= 110-6 mol/L= 1mol/L= 1MQ15. 如何合成寡核苷酸? TOP 目前最流行的用于合成寡核苷酸的方法是通过使用“亚磷酸三脂”方 法 将 单 体 连 接 ,形 成 天 然的 3-5磷 酸 二 脂 键 。Koster发现了-氰乙基亚磷酰胺并作为构建单体,现在普遍的用于寡核苷酸的合成(Nucl. Acids Res. 1984, 12,4539; Tetrahedron Lett. 1983, 24,5843)。通过“亚磷酸三脂”的方法使用
15、-氰乙基亚磷酰胺,合成效率能够达到(98%)而合成时间比其它寡核苷酸的合成方法更短。而且,由于单体-氰乙基亚磷酰胺在激活以前很稳定,这是对合成寡核苷酸来说所必需的,他们能储存更长的时间。当寡核苷酸共价的连接在固相载体上就可以使其不被过量溶解-氰乙基亚磷酰胺和结合试剂的作用下,寡核苷酸被合成。在各种各样的固相载体中,可控孔度玻片已经在近年广泛使用了,这种玻片是由均匀的玻璃基质组成,上面有固定尺寸的孔。 整个寡核苷酸的合成通过一系列的反应完成,其中包括四个循环反应:脱保护,连接,氧化,加帽。脱保护 通过第一个循环脱保护,CPG裂解出5保护基团DMT。酸性条件对于脱保护是必需的,通常使用3三氯乙酸。
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