化妆品的微生物学检查ppt课件.ppt

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1、化妆品的微生物学检查,主要内容,化妆品的卫生标准化妆品微生物学检查基础知识化妆品中微生物总数检查化妆品中控制菌检查,化妆品原料中的微生物,0级 酸、碱、醇等，本身具有杀菌功能，无需检测1级 无水脂类、矿物油、凡士林、硬脂酸等，含极少量微生物，本身中等抗菌能力，只需一次检查；2级 原料含少量微生物，被水稀释后能成为微生物营养物，如甘油、山梨醇等，一年检查一次；3级 具有微生物污染风险。表面活性剂、增泡剂、水解蛋白溶液、芦荟胶。需防腐体系。每批抽样检查4级 极高微生物污染风险，去离子水。,化妆品微生物污染途径,一级污染二级污染,防止微生物污染的措施,3个操作因素：消毒、清洁措施、员工培训；5个工程

2、因素：设备、厂房、仓库、水系统和空气系统的良好的可消毒设计。执行HACCP，消毒标准的建立赢包括工厂的每一个区域和相关的功能设施。,化妆品微生物检验,原料和产品中的微生物数量是否达到执行标准；检验用于化妆品和药品中的防腐剂的防腐效能,检验方法,APC法：好样平板计数法防腐剂效能实验,检验方法可靠性,精确性实验人员的实验技能灵敏性、准确性试验方法的合理性,目前参照执行的方法,USP法（美国药典）CTFA法（美国化妆品、盥洗用品及香料协会）ASTM法（美国检验方法及材料协会）英国药物学方法GB7918.1-87相同点：测试微生物种类和恢复系统、测定APC方法相同。不同点：培养温度、接种物的制备程序

3、、培养时间,一、2007版“化妆品卫生规范”,二、检查的必备知识,1.采样采样应具有代表性。从两个包装单位以上的样品中共取10g 或10mL作为检验量。样品应严格保持原有的包装状态。容器不应有破裂，在检验前不得打开，防止样品被污染。接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。及时检验的样品应放在室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻。若样品需同时做多种分析，如细菌、毒理、化学等，则宜先取出部分样品做细菌检验，再将剩余样品做其它分析。在检验过程中，从打开包装到全部检验操作结束，均须防止微生物的再污染和扩散，所用器皿及材料均应事先灭菌，全部操作应在无菌室内进行，或在相应条件下，按无菌操作规

4、定进行。,如检出粪大肠菌群或其它致病菌，自报告发出之日起该菌种及被检样品应保存一个月。,2.供检样品（供试品）的制备,水溶性液体样品,样品,10mL,90mL生理盐水,1:10供试液,2.供检样品（供试品）的制备,油性液体样品,5mL灭菌液体石蜡,1:10供试液,10mL灭菌吐温80,4044,10mL样品,混匀,10min,75mL 4044灭菌生理盐水,4044,乳化,均质器,2.供检样品（供试品）的制备,亲水性半固体（膏、霜、乳剂）样品,振荡,90mL生理盐水,10g样品,15min,上清液作为1:10供试液,2.供检样品（供试品）的制备,疏水性半固体样品,5mL灭菌液体石蜡,1:10供

5、试液,10mL灭菌吐温80,4044,10mL样品,混匀,10min,75mL 4044灭菌生理盐水,4044,乳化,均质器,2.供检样品（供试品）的制备,固体样品,振荡,90mL生理盐水,上清液作为1:10供试液,10g样品,15min,三、细菌、真菌总数检查,1.意义测定总数主要是作为判定化妆品被细菌、霉菌及酵母菌污染程度的标记，也可以观察化妆品中细菌、霉菌及酵母菌的性质和在化妆品中的繁殖动态，以便对样品进行卫生学评价时提供科学依据。,3.平皿法,操作注意事项,1.尽量使菌细胞分散开，使每个菌细胞生成一个菌落，否则将会导致重大的技术误差。2.为防止细菌增殖及产生菌苔，制成供试液后，应尽快稀

6、释，注皿。一般稀释后应在1小时内操作完毕。3.使用吸量管时，应小心沿管壁加入，不用触及管内溶液，以防吸管尖端外侧黏附的溶液混入其中。4.注意抑菌现象。由于防腐剂未被中和，往往使平板计数结果受影响，如低稀释时菌落少。而高释释度时菌落数反而增大。遇此情况应重复检验，以确定是防腐剂影响还是操作技术误差。,操作注意事项,5.为检查和控制灭菌效果，应做空白对照，以检验所使用的物品是否彻底灭菌及检验过程是否无菌操作。6.为便于区别化妆品中的颗粒与菌落，可在每100mL 卵磷脂吐温80 营养琼脂中加入1mL0.5的TTC 溶液，如有细菌存在，培养后菌落呈红色，而化妆品的颗粒颜色无变化。,菌落计数及报告方法,

7、宜选取细菌、酵母菌平均菌落数30300之间、霉菌平均菌落数550之间的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。 （1）当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数乘其稀释倍数; （2）若有两个稀释度，其平均菌落数均在30 个300 个之间，则应求出两菌落总数之比值来决定，若其比值小于或等于2，应报告其平均数，若大于 2 则报告其中稀释度较低的平皿的菌落数,菌落计数及报告方法,（3）若所有稀释度的平均菌落数均大于300 个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之; （4）若所有稀释度的平均菌落数均小于30 个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之; （5）若

8、所有稀释度的平均菌落数均不在30 300 个之间，其中一个稀释度大于300 个，而相邻的另一稀释度小于30 个时，则以接近30 或300 的平均菌落数乘以稀释倍数报告之； （6）若所有的稀释度均无菌生长，报告数为每g 或每mL 小于10CFU;,控制菌检查,（1）阴性对照试验：应无菌生长。（2）阳性对照试验：供试品+阳性对照菌，应检出相应的阳性对照菌。 （3）供试品控制菌检查：依相应的检查方法进行。,1.增菌培养目的,使被检药物中的被检菌增殖，避免出现漏检。,2.分离培养目的,经增殖培养后,被检菌大量繁殖，同时其他一些杂菌也出现增殖。因此分离培养能使目的菌从混合菌中分离出来。,3.纯培养目的,

9、只是大量增殖被检菌，用于后面的进一步检验。,4.染色镜检目的,初步鉴定，观察细菌的形态大小。,5.生化试验目的,最终的鉴定依据，结合染色镜检得出实验结果，填写检验报告。,粪大肠菌群,粪大肠菌群系一群需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌，在44.50.5培养24h48h 能发酵乳糖产酸并产气。粪大肠菌群主要存在于温血动物粪便中，随粪便排出体外后可直接污染化妆品，若产品中检出该菌群，表明该产品受到粪便污染，可能存在肠道致病菌并引起疾病，是评价化妆品卫生质量的重要指标之一。,靛基质试验,粪大肠菌群检查结果报告,根据发酵乳糖产酸产气，平板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阴性短杆菌，靛基质试验阳性，则可报告

10、被检样品中检出粪大肠菌群。,铜绿假单胞菌,铜绿假单胞菌属于假单胞菌属，为革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素。此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在421条件下能生长。,铜绿假单胞菌在特殊情况下可引起皮肤化脓感染、泌尿道感染、中耳炎等。外伤及烧伤患者感染后最易引起化脓，并引起败血症。为保证消费者安全，化妆品中不得检出铜绿假单胞菌。,最终结果判断,增菌培养,供试液的制备,书写检验记录单,分离纯化,无菌落或无特征菌落,配培养基和稀释液,361,1824h,361,1824h,灰白色湿润,黄绿色菌膜,粉红/紫红色,十六烷三甲基溴化铵平板,SCDLP培养基,氧化酶试验,绿脓菌素试验,盐酸层呈

11、粉紫色氯仿层呈蓝绿色,硝酸盐还原产气试验,明胶液化,明胶培养基（高层）,明胶液化试验,铜绿假单胞菌检查结果报告,被检样品经增菌分离培养后，经证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者，即可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌；如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和42生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌。,金黄色葡萄球菌,金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，呈葡萄状排列，无芽胞，无荚膜，能分解甘露醇，血浆凝固酶阳性。,金黄色葡萄球菌在外界分布较广，抵抗力也较强，能引起人体局部化脏性病灶，严重时可导致败血症，因此化妆品中检验金黄色葡萄球菌有重要意义。,革兰染色、镜检

12、 生化试验:血浆凝固酶试验 甘露醇发酵试验,最终结果判断,增菌培养,供试品的处理,书写检验记录单,分离纯化,无菌落或无特征菌落,配培养基和稀释液,361,361,242h,2448h,金黄色葡萄球菌检查流程图,灰/黑色,Baird Parkers平板,甘露醇发酵试验,血浆凝块,液态血浆,血浆凝固酶试验,金黄色葡萄球菌检查结果报告,凡在上述选择平板上有可疑菌落生长，经染色镜检，证明为革兰氏阳性葡萄球菌，并能发酵甘露醇产酸，血浆凝固酶试验阳性者，可报告被检样品检出金黄色葡萄球菌。,霉菌和酵母菌,霉菌和酵母菌数测定（Determination of molds and yeast count）是指化

13、妆品检样在一定条件下培养后，1g 或1mL 化妆品中所污染的活的霉菌和酵母菌数量，藉以判明化妆品被霉菌和酵母菌污染程度及其一般卫生状况。本方法根据霉菌和酵母菌特有的形态和培养特性，在虎红培养基上，置282培养72h，计算所生长的霉菌和酵母菌数。,操作步骤,样品稀释 同菌落总数测定,取1：10、1：100、1：1000 的检液各1mL 分别注入灭菌平皿内，每个稀释度各用2个平皿，注入融化并冷至451左右的虎红培养基，充分摇匀。凝固后，翻转平板，置281培养72h2h，计数平板内生长的霉菌和酵母菌数。若有霉菌蔓延生长，为避免影响其它霉菌和酵母菌的计数时，于48h2h 应及时将此平板取出计数。,计算方法：先点数每个平板上生长的霉菌和酵母菌菌落数，求出每个稀释度的平均菌落数。判定结果时，应选取菌落数在5 个50 个范围之内的平皿计数，乘以稀释倍数后，即为每g（或每mL）检样中所含的霉菌和酵母菌数。其它范围内的菌落数报告应参照菌落总数的报告方法报告之。 每g（或每mL）化妆品含霉菌和酵母菌数以CFU/g（mL）表示。,