核酸分子杂交与应用课件.ppt
《核酸分子杂交与应用课件.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《核酸分子杂交与应用课件.ppt(85页珍藏版)》请在三一办公上搜索。
1、核酸分子杂交,核酸分子杂交,核酸分子杂交:来源相同或不同的DNA甚至DNA与RNA分子变性后,在合适的条件下通过碱基互补形成双链杂交体的过程称核酸分子杂交(molecular hybridization)。核酸分子杂交技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术之一,也是临床分子检验的重要技术。,核酸分子杂交:来源相同或不同的DNA甚至DNA与RNA分子变,核酸分子杂交与应用课件,核酸探针的标记,探针(probe)是指用放射性核素或其它标记物标记的核酸片段。,标记物,放射性标记,非放射性标记,生物素标记,地高辛标记,荧光素标记,核酸探针的标记探针(probe)是指用放射性核素或其它标记
2、物,探针的种类,DNA探针:双链或单链DNA探针是最常用的核酸探针。长度在几百碱基对以上。DNA探针又分为:基因组DNA探针:有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针,多为某一基因的全部或部分序列,或某一非编码序列。cDNA探针:以mRNA为模板经过逆转录酶催化产生的互补于mRNA的DNA链。,探针的种类DNA探针:双链或单链DNA探针是最常用的核酸探针,探针的种类,DNA探针优点:1、一般克隆在质粒载体中,可以无限繁殖;2、DNA探针不易降解3、DNA的标记方法比较成熟。,探针的种类DNA探针优点:,探针的种类,RNA探针:可以是标记分离的RNA,也可以是重组质粒在RNA聚合酶作用
3、下的转录产物。其优点是:RNA探针为单链,复杂性低,与靶序列杂交反应效率极高因不存在重复序列,因此特异性高本底低缺点:,探针的种类RNA探针:可以是标记分离的RNA,也可以是重组质,探针的种类,寡核苷酸(oligo)探针:由1750mer组成的短探针。优点:可根据需要人工合成相应的序列;因片段短,只有一个核苷酸突变,其Tm值也有明显变化,特别适用于点突变的检测杂交速度快特异性强缺点:所带标记物少灵敏度低;片段短杂交体不稳定,探针的种类寡核苷酸(oligo)探针:由1750mer组成,探针的标记,切口平移法标记原理:是目前实验室是最常用的一种脱氧核糖核酸探针标记法。利用大肠杆菌DNA聚合酶1的多
4、种酶促活性将标记的dNTP掺入新合成DNA链中使探针被标记。 带缺口(nick)的线状、超螺旋及环状双链DNA均可作为切口平移法的模板。,探针的标记切口平移法,DNase I,DNA Pol I,-32P-dNTP,DNase IDNA Pol I,-32P-dNTP,核酸分子杂交与应用课件,标记步骤,1、取1gDNA溶于少量无菌蒸馏水中2、加入l10 x切口平移缓冲液,混匀 10 x切口平移缓冲液 0.5mol/L Tris.Cl(pH7.2) 0.1mol/L MgSO4 1mmol/L 二硫苏糖醇(DTT) 500g/ml 牛血清白蛋白,标记步骤1、取1gDNA溶于少量无菌蒸馏水中,标记
5、步骤,3、加入除标记核苷酸外的其他三种脱氧核糖核苷酸溶液(也可以是多种标记核苷酸),20mmol/L溶液各1l。 以下操作要在同位素工作室中有防护措施的情况下进行操作4、加入100Ci(10l)标记的核苷酸溶液。注:应贮存在20oC冰箱中,使用前在室温下放置1530分钟融化。要尽量减少冻融次数。,标记步骤3、加入除标记核苷酸外的其他三种脱氧核糖核苷酸溶液(,标记步骤,5、加入无菌蒸馏水,至终体积为46.5l,混匀6、加入0.5l稀释的DNase I溶液,混匀7、加入1l(5U)DNA聚合酶I溶液,混匀 注:以上操作均在冰浴中进行8、置1416oC水浴中保温12小时9、加入2l 0.5mol/L
6、 EDTA终止反应10、纯化标记的DNA探针,标记步骤5、加入无菌蒸馏水,至终体积为46.5l,混匀,单链DNA探针的标记,单链DNA探针的标记,探针的标记,随机引物法标记原理:随机引物是含有各种可能排列的寡聚核苷酸片段的混合物,可以与任何核酸序列杂交,起到聚合酶促反应的引物作用。将待标记的探针模板与随机引物一起退火,合成标记探针。,探针的标记随机引物法,核酸分子杂交与应用课件,标记步骤,1、冰浴中,在一微量离心管内顺序加入下列溶液,并混匀 20mmol/L DTT 1l 5mmol/L dATP、dGTP、dTTP 1l 10 x随机引物缓冲液 1l 标记dCTP 3l 水 1l,标记步骤1
7、、冰浴中,在一微量离心管内顺序加入下列溶液,并混匀,标记步骤,2、取200ng双链DNA溶于1l蒸馏水中,在蜡膜上与1l随机引物充分混匀,吸入一毛细玻璃管中,用火封严两端。置沸水浴中30分钟并迅速置冰水浴中1分钟。将DNA转入上述离心管中3、加入1l(5U)DNA聚合酶Klenow片段,混匀并离心,室温反应3小时以上,标记步骤2、取200ng双链DNA溶于1l蒸馏水中,在蜡膜,标记步骤,4、取10l终止缓冲液,置20oC保存备用 终止缓冲液 50mmol/L Tris.Cl(pH7.5) 50mmol/L NaCl 5mmol/L EDTA 0.5% SDS,标记步骤4、取10l终止缓冲液,置
8、20oC保存备用,随机引物标记法特点,1、除能进行双链DNA标记外,也可用于单链DNA或RNA探针的标记。当用RNA为模板是,操作方法同上,但必须采用反转录酶。2、标记活性高,只需25ng样品DNA,可在3小时内使4060以上甚至90的标记dNTP掺入到探针DNA链上3、操作方便,随机引物标记法特点1、除能进行双链DNA标记外,也可用于单链,核酸分子杂交与应用课件,3末端标记,末端标记属于部分标记。特点是可得到全长DNA片段,但标记活性不高。3末端标记法包括限制酶切和聚合酶合成两个过程,3标记有两种方式:,大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末端标记法,T4DNA聚合酶标记法,3末端标记末
9、端标记属于部分标记。特点是可得到全长DNA片段,大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末端标记法:,标记反应步骤:,(1)在反应管中依次加入下列试剂并混匀,DNA 1g,10 xKlenow片段缓冲液 2l,2mmol/L3种dNTP(无dATP) 1l,-32PdATP 30Ci,加水至 25l,10 xKlenow片段缓冲液 2l,0.5mol/L Tris.Cl(pH7.2),0.1mmol/L MgSO4,1mmol/L DTT(二硫苏糖醇),500g 牛血清白蛋白,大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末端标记法:标记反应,(2)加入1单位Klenow聚合酶片段,室温反应30mi
10、n。,(3)加入12l0.5mol/LEDTA以终止反应。酚/氯仿抽提1次。,(4)Sephadex G50柱层析或乙醇沉淀法分离标记的DNA片段。,大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末端标记法:,(2)加入1单位Klenow聚合酶片段,室温反应30min。,注意事项:,(1)要根据不同限制酶产生的不同粘性末端选择不同的标记核苷酸。,(2)选择适当的限制酶及-32P-dNTP,利用DNA聚合酶I Klenow片段的末端填充活性,可以选择性地将DNA双链之中一条链特异地标记。,(3)此方法不能直接用于3凸出末端DNA的标记。,注意事项:(1)要根据不同限制酶产生的不同粘性末端选择不同的,加
11、入DNA聚合酶,dNTP(其中一种为标记核苷酸),AATTC,CCTAGG,CCTAGGAATTCAATTCCCTAGG,T4DNA聚合酶标记法,T4DNA聚合酶具有两种功能,53聚合活性 和35外切活性。当反应体系中缺乏dNTP时,T4DNA聚合酶主要表现为外切酶活性。利用这一特性可产生5凸出的DNA片段,然后加入dNTP,其中之一为标记核苷酸,在T4DNA聚合酶活性的作用下,合成出标记探针。,T4DNA聚合酶标记法T4DNA聚合酶具有两种功能,53,T4DNA聚合酶,加入dNTP,其中一种为标记核苷酸,标记反应步骤:,(1)在反应管中加入下列试剂并混匀,DNA 0.20.5g,1xT4DN
12、A聚合酶缓冲液 2l,加水至 20l,(2)加入所需的限制酶,并在适当条件下温育,(3)加入适量T4DNA聚合酶。,(4)当切除了所需数量的核苷酸后,加入 1l2mmol/L四种核苷酸(其中一种为标记核苷酸),37oC保温一小时。,(5)Sephadex G50柱层析或乙醇沉淀法分离标记的DNA片段。,标记反应步骤:(1)在反应管中加入下列试剂并混匀,5末端标记,标记原理:在T4多核苷酸激酶的催化下,可使 ATP分子上的磷酸基团转移到DNA或RNA分子的5OH基团上。因此采用-32P-ATP为底物,即可将DNA样品5端标记。但核酸样品5端必需是去磷酸的。,5末端标记标记原理:在T4多核苷酸激酶
13、的催化下,可使 AT,PP磷酸酶T4多核苷酸激酶PP,标记反应步骤:,(1)碱性磷酸酶的预处理:碱性磷酸酶(CIP)硫酸铵悬液4oC下在Eppendorf离心管中离心1分钟。弃上清,沉淀重溶于少量水中。4oC下此溶液可保存一个月以上。,(2)将DNA样品溶解于少量10mmol/L tris.Cl(pH8.0)溶液中,然后加入:,标记反应步骤:(1)碱性磷酸酶的预处理:碱性磷酸酶(CIP),10 xCIP缓冲液 5l,CIP缓冲液 适量,加水至 48l,置37oC30分钟。加入第二份CIP,继续保温30分钟,即可脱去5端磷酸基团。0.01U的CIP,可脱去1pmol5磷酸基团(1.6g4kb线性
14、DNA的5端数相当于1pmol)。,10 xCIP缓冲液 Tris.Cl(pH9.0),10mmol/L MgCl2,1mmol/L ZnCl2,10mmol/L 亚精胺,10 xCIP缓冲液,(3)加入40l H2O,10l 10 xSTE,5l 10SDS。加热至68oC,15分钟。,10 xSTE,100mmol/L Tris.Cl(pH8.0),1mol/L NaCl,10mmol/L EDTA,酚/氯仿及氯仿各抽提两次除CIP,SephadexG50层析脱盐后乙醇沉淀。取脱盐后的脱5磷酸DNA150pmol溶于少量水中,然后加入下列试剂进行5末端标记:,(3)加入40l H2O,10
15、l 10 xSTE,5l,加水至50ul,混匀,37oC保温1小时。加入2ul0.5mol/LEDTAz终止反应,酚/氯仿抽提后乙沉淀。SephadexG50层析分离后得5标记的DNA探针。,-32P-ATP 50pmol(150uCi),T4多核苷酸激酶 1020U,10 x激酶缓冲液 10ul,加水至50ul,混匀,37oC保温1小时。加入2ul0.5m,注意事项:,(1)T4多核苷酸激酶对多种杂质非常敏感,要求必需达到一定的纯度;脱磷酸后要用SephadexG50层析除去小分子及离子。,(2)亚精胺即可促进-32P-ATP的掺入,又能抑制核酸酶的活性 。,(3)脱磷酸的DNA样品最好经电
16、泳纯化以除去其中存在的低分子质量的核酸,否则会竞争性抑制目标DNA的标记 。,注意事项:(1)T4多核苷酸激酶对多种杂质非常敏感,要求必需,探针的线纯化,凝胶过滤柱层析法,利用凝胶的分子筛效应,将标记的DNA与小分子彼此分开。因标记的探针量很小,一般用离心柱层析法。,乙醇沉淀法,探针的线纯化凝胶过滤柱层析法利用凝胶的分子筛效应,将标记的D,核酸分子杂交的种类和方法,核酸分子杂交的基本原理:DNA分子由两条互补的单链形成的双螺旋结构。维持结构稳定的力有三:1、两条链间互补碱基的氢键;2、碱基间的堆积力(范德华力);3、中和链内的负电荷。,变性:在理化因素作用下,双螺旋结构间的氢键断裂,两条链解开
17、形成单链的过程。,核酸分子杂交的种类和方法核酸分子杂交的基本原理:DNA分子由,核酸分子杂交与应用课件,变性温度(Tm):核酸分子热变性时,从开始变性到变性结束,是在一个很窄的温度范围内进行的,当变性进行到核酸分子解链一半时的温度,称变性温度,也称融解温度。,变性温度(Tm):核酸分子热变性时,从开始变性到变性结束,是,核酸分子杂交与应用课件,影响变性的因素:,1、碱基组成 DNA分子中GC含量越高Tm越高。在1SSC溶液中,两者之间的关系可以用经验公式表示:,Tm(G+C)%0.41+69.3,其中,69.3为无GC存在时的Tm值。(G+C)%每增加1,Tm约上升0.41oC。,影响变性的因
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 核酸 分子 杂交 应用 课件
链接地址:https://www.31ppt.com/p-1640509.html