第九章维生素的测定ppt课件.ppt

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1、第九章 维生素的测定,第一节 概 述第二节 脂溶性维生素的测定第三节 水溶性维生素的测定,一、维生素的故事,人类对维生素的认识始于3000多年前。当时古埃及人发现夜盲症可以被一些食物治愈，虽然他们并不清楚食物中什么物质起了医疗作用，这是人类对维生素最朦胧的认识。,第一节 概述,1519年，葡萄牙航海家麦哲伦率领的远洋船队从南美洲东岸向太平洋进发。三个月后，有的船员牙床破了，有的船员流鼻血，有的船员浑身无力，待船到达目的地时，原来的200多人，活下来的只有35人，人们对此找不出原因。,1734年，在开往格陵兰的海船上，有一个船员得了严重的坏血病，当时这种病无法医治，其他船员只好把他抛弃在一个荒岛

2、上。待他苏醒过来，用野草充饥，几天后他的坏血病竟不治而愈了。诸如此类的坏血病，曾夺去了几十万英国水手的生命。1747年英国海军军医林德总结了前人的经验，建议海军和远征船队的船员在远航时要多吃些柠檬，他的意建被采纳，从此未曾发生过坏血病。但那时还不知柠檬中的什么物质对坏血病有抵抗作用。,第一节 概述,1912年，波兰科学家丰克，经过千百次的试验，终于从米糠中提取出一种能够治疗脚气病的白色物质。这种物质被丰克称为 “维持生命的营养素”，简称Vitamin(维他命），也称维生素。随着时间的推移，越来越多的维生素种类被人们认识和发现，维生素成了一个大家族。人们把它们排列起来以便于记忆，维生素按A、B、

3、C一直排列到L、P、U等几十种。,第一节 概述,维生素是维持人体正常生命活动所必需的一类天然有机化合物。其种类很多，目前已确认的有30余种，其中被认为对维持人体健康和促进发育至关重要的有20余种。这些维生素结构复杂，理化性质及生理功能各异，有的属于醇类，有的属于胺类，有的属于酯类，还有的属于酚或醌类化台物。,维生素的结构复杂： 分为： 胺类（B1） 醛类（B6） 醇类（A） 酚 醌类等,维生素的命名,多根据发现的时间顺序以英文字母排序，如维生素A、维生素B1、B2，维 生 素C， 维生素E等。根据特定生理功能，如抗干眼病因子、抗坏血酸、生育酚等。按照其化学结构如视黄醇、硫胺素、烟酸、叶酸等。,

4、维生素都具有以下共同特点：,化合物或其前体化合物都在天然食物中存在；不能供给机体热能，也不是构成组织的基本原料，主要功用是通过作为辅酶的成份调节代谢过程，需要量极小；一般在体内不能合成，或合成量不能满足生理需要必须经常从食物中摄取；长期缺乏任何一种维生素都会导致相应的疾病。,维生素A缺乏时的具体表现为：,影响视觉，眼睛的结膜、角膜干燥，暗适应减弱，乃至夜盲。 皮肤干燥、脱屑，上皮组织改变，腺体分泌减少。 免疫力降低，反复呼吸道感染、腹泻。 头发干枯、易断，指甲无光泽。 牙质萎缩，骨骼发育不良。 味觉、嗅觉不佳、食欲差，生长发育停滞。 影响智力发育。,测定食品中维生素含量的意义,评价食品的营养价

5、值； 寻找富含维生素的食品资源； 指导人们合理调整膳食结构，防止维生素缺乏症或维生素中毒； 研究维生素在食品加工、贮存等过程中的稳定性，指导人们制定合理的加工工艺及贮存条件； 监督维生素强化食品的强化剂量，防止因摄入过多而引起维生素中毒。,脂溶性维生素 ：溶于脂肪或脂溶剂，在食物中与脂类共存的一类维生素，包括A、D、E、K 各小类，其共同特点：是摄入后存在于脂肪组织中，不能从尿中排除，大剂量摄入时可能引起中毒；由于可储藏在脂肪中，故不需每天供给。 水溶性维生素 ：溶于水，包括B、C 各小类，其共同特点：是一般只存在于植物性食品中，满足组织需要后都能从机体排出。需要每天供给。,维生素的分类,维生

6、素的分析方法,第二节 脂溶性V的测定,VA、VD、VE、与类脂类物质一起存于食物中，摄食时可吸收，可在体内积贮。 脂溶性维生素具有以下理化性质： 1溶解性：脂溶性维生素不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂。 2耐酸碱性：维生素A、D对酸不稳定， 对碱稳定，维生素E对碱不稳定，但在抗氧化剂存在下或惰性气体保护下，也能经受碱的煮沸。,3耐热性、耐氧化性： 耐热性 氧化性VA 好，能经受煮沸 易被氧化 （光、热 促进其氧化）V D 好，能经受煮沸 不易被氧化 V E 好，能经受煮沸 在空气中能慢慢被化 （光、热、碱促进其 氧化）,根据上述性质测定脂溶性维生素时，通常：皂化样品

7、水洗去除类脂物 有机溶剂提取脂溶性维生素(不皂化物) 浓缩 溶于适当的溶剂 测定。 在皂化和浓缩时，为防止维生素的氧化分解，常加入抗氧化剂(如焦性没食子酸、维生素C等)。 对于A、D、E共存的样品，或杂质含量高的样品，在皂化提取后，还需进行层析分离。,国际单位： IU （International Unit) 1 IU = 0.3g VA = 0.025 VD = 1.79 g-胡萝卜素 = 1.1mg - VE = 3 g VB,一、维生素A的测定 维生素A存在于动物性脂肪中，主要来源于肝脏、鱼干油、蛋类、乳类等动物性食品中。植物性食品中不含VA，但在深色果蔬中含有胡萝卜素，它在人体内可转变

8、为VA，故称为VA原。,维生素A的性质, 因有许多不饱和链，故见光易分解； 在缺氧情况下，对热较稳定，对光特别敏感。 对碱稳定。,目前维生素A都是合成的，来源：（1）从动物肝脏中得到；（2）从维生素前体而得到（维生素前体：主要指类胡萝卜素，主要是-胡萝卜素） 维生素A的测定常用的方法有: 三氯化锑比色法 紫外分光光度法 荧光分析法 液相色谱法。,比色法测定VA的含量（GB/T 5009.822003中第二法）（一） 原理 在氯仿溶液中，VA与三氯化锑可生成蓝色可溶性络合物，在 620 nm 波长处有最大吸收峰，其吸光度与VA的含量在一定的范围内成正比，故可比色测定。,（二）适用范围及特点本法适

9、用于维生素A含量较高的各种样品(高于 510gg)，对低含量样品，因受其他脂溶性物质的干扰。不易比色测定。该法的主要缺点是生成的蓝色络合物的稳定性差。比色测定必须在 ，否则蓝色会迅速消退，将造成极大误差。,6秒钟内完成,2.仪器 实验室常用设备 分光光度计 回流冷凝装置 3.试剂 本实验所用试剂皆为分析纯，所用水皆为蒸馏水 （1） 无水硫酸钠 Na2SO4 （2） 乙酸酐 （3） 乙醚 （不含有过氧化物） （4） 无水乙醇 （不含有醛类物质） （5） 三氯甲烷 （不含分解物，否则会破坏维生素A ）,检查方法：三氯甲烷不稳定，放置后易受空气中氧的作用生成氯化氢。检查时可取少量三氯甲烷置试管中加水

10、振摇，使氯化氢溶到水层。加入几滴硝酸银溶液，如有白色沉淀即说明三氯甲烷中有分解产物。 （6） 25%三氯化锑-三氯甲烷溶液 用三氯甲烷配制25%三氯化锑溶液，储于棕色瓶中（注意避免吸收水分） （7） 50%氢氧化钾溶液（KOH） W/V （8） 维生素A标准液 视黄醇（纯度85% Sigma）用脱醛乙醇溶解维生素A标准品，使其浓度大约为1ml相当于1mg视黄醇。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。（9） 酚酞指示剂 用95%乙醇配制1%溶液,4. 操作步骤 维生素A极易被光破坏，实验操作应在微弱光线下进行。 4.1样品处理：根据样品性质，可采用皂化法或研磨法。 (1)皂化法：皂化：根据样品中

11、维生素A含量的不同，称取0.5g5g样品于三角瓶中，加入2040mL无水乙醇及10mL50%氢氧化钾，于电热板上回流30min至皂化完全为止。（皂化法适用于维生素A含量不高的样品，可减少脂溶性物质的干扰，但全部实验过程费时，且易导致维生素A 损失）,提取：将皂化瓶内混合物移至分液漏斗中，以30mL水洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗。如有渣子，可用脱脂棉漏斗滤入分液漏斗内。用50mL乙醚分二次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。振摇并注意放气，静置分层后，水层放入第二个分液漏斗内。皂化瓶再用约30mL乙醚分二次冲洗，洗液倾入第二个分液漏斗中。振摇后，静置分层，水层放入三角瓶中，醚层与第一个分液漏斗合并。重复

12、至水液中无维生素A为止。,洗涤： 用约30mL水加入第一个分液漏斗中，轻轻振摇，静置片刻后，放去水层。加15 20mL 0.5mol/L氢氧化钾液于分液漏斗中，轻轻振摇后，弃去下层碱液，除去醚溶性酸皂。继续用水涤，每次用水约30mL，直至洗涤液与酚酞指示剂呈无色为止（大约洗涤3次）。醚层液静置1020min，小心放出析出的水。,浓缩： 将醚层液经过无水硫酸钠滤入三角瓶中，再用约25mL乙醚冲洗分液漏斗和硫酸钠两次，洗液并入三角瓶内。置水浴上蒸馏，回收乙醚。待瓶中剩约5mL乙醚时取下，用减压抽气法至干，立即加入一定量的三氯甲烷使溶液中维生素A含量在适宜浓度范围内。,(2)研磨法：研磨：精确称25

13、g样品，放入盛有35倍样品重量的无水硫酸钠研钵中，研磨至样品中水分完全被吸收，并均质化。（研磨法适用于每克样品维生素A含量大于510g样品的测定，如肝样品的分析。步骤简单，省时，结果准确） 提取：小心地将全部均质化样品移入带盖的三角瓶内，准确加入50100ml乙醚。紧压盖子，用力振摇2min，使样品中维生素A溶于乙醚中。使其自行澄清（大约需12h），或离心澄清（因乙醚易挥发，气温高时应在冷水浴中操作。装乙醚的试剂瓶也应事先置于冷水浴中）。 浓缩：取澄清提取乙醚液25mL，放入比色管中，在7080水浴上抽气蒸干。立即加入1mL三氯甲烷溶解残渣。,4.2标准曲线的制备: 准确取一定量的维生素A标准

14、液于45个容量瓶中，以三氯甲烷配制标准系列。再取相同数量比色管顺次取1mL三氯甲烷和标准系列使用液1mL，各管加入乙酸酐1滴，制成标准比色系列。于620nm波长处，以三氯甲烷调节吸光度至零点，将其标准比色列按顺序移入光路前，迅速加入9mL三氯化锑-三氯甲烷溶液。于6秒内测定吸光度，将吸光度为纵坐标，以维生素A含量为横坐标绘制标准曲线图。,4.3样品测定: 于一比色管中加入10mL三氯甲烷，加入一滴乙酸酐为空白液。另一比色管中加入1mL三氯甲烷，其余比色管中分别加入1mL样品溶液及1滴乙酸酐。其余步骤同标准曲线的制备。,注意：维生素A见光易分解，整个实验应在暗处进行，防止阳光照射，或采用棕色玻璃

15、避光。2. 三氯化锑腐蚀性强，不能沾在手上，三氯化锑遇水生成白色沉淀。因此用过的仪器要先用稀盐酸浸泡后再清洗。,说明：,1，本法为国家标准方法，适用于食品中维生素的测定。2，乙醚为溶剂的萃取体系，易发生乳化现象，在提取前，洗涤操作中，不要用力过猛，若发生乳化，可加几滴乙醇消除乳化。3，所用氯仿中不应含有水分，因三氯化锑遇水会出现深沉，干扰比色测定。故在每1mL氯仿中应加入乙酸酐滴，以保证脱水。,，由于三氯化锑与维生素所产生的蓝色物质很不稳定，通常6s以后便开始褪色，因此要求反应在比色皿中进行，产生蓝色后立即读取吸光度值。5，如果样品中含胡萝卜素（如奶粉、禽蛋等食品）干扰测定，可将浓缩蒸干的样品

16、用正己烷溶解，以氧化铝为吸附剂，丙酮己烷混合液为洗脱剂进行柱层析。,二、维生素D的测定,维生素D是指含有抗佝偻病活性的一类物质，又称钙化醇，是类固醇的衍生物，是一类关系钙、磷代谢的活性物质。具有维生素D活性的化合物约有10种，其中最重要的是维生素D2、维生素D3及其维生素D原。维生素D2无天然存在，维生素D3只存在于某些动物性食物中。但它们都可由维生素D原(麦角固醇和7一脱氢胆固醇)经紫外线照射形成。 维生素D2 药片吃多了中毒。,分析方法中较好的是比色法和高效液相色谱法。,(一)三氯化锑比色法 (二) 高效液相色谱法 它的灵敏度较比色法高30倍以上，且操作 简便，精度高，分析速度快。是目前分

17、析维生素D的最好方法。,三氯化锑比色法原理 在三氯甲烷溶液中，维生素D与三氯化锑结合生成一种黄色化合物，呈色强度与维生素D含量呈正比。食品中维生素D含量较低，其他维生素严重干扰其测定，因此测定前必须经柱层析除去干扰成分。层析介质为硅藻土、中性氧化铝,说明,1，食品中维生素D的含量一般很低，而维生素A、维生素E、胆固醇、甾醇等成分的含量往往大大超过维生素的含量，严重干扰维生素的测定，因此测定前必须经柱层析除去这些干扰成分。，此法不能区分维生素2和维生素3，测定值为两者的总量。,第三节 水溶性维生素的测定,水溶性维生素包括： 维生素B1(硫胺素) 维生素B2（核黄素） 维生素B6（吡哆醇、吡哆醛、

18、吡哆胺） 维生素PP（烟酸） 叶酸、泛酸（维生素B3） 生物素（维生素B7） 维生素C 等，,特点： 水溶性维生素都易溶于水, 不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂。 在酸性介质中很稳定，即使加热也不破坏； 但在碱性介质中不稳定，特别在碱性条件下加热，可大部或全部破坏。它们易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响 。,广泛存在于动植物组织中，在食物中常以辅酶的多种形式存在，满足组织需要后，多余的量都能从机体排出。,维生素B2对光，特别是紫外线敏感，易被光线破坏；维生素C对氧、铜离子敏感，易被氧化。,根据上述性质，测定水溶性维生素时，一般都在酸性溶液中进行前处理。,维生素Bl、B2 盐酸水解 酶解

19、 提取 纯化 维生素C通常采用草酸、草酸醋酸、偏磷酸醋酸溶液直接提取。在一定浓度的酸性介质中，可以消除某些还原性杂质对维生素C的破坏作用。草酸价廉，使用方便，对维生素C有很好的稳定作用。,一、维生素B1的测定,维生素B1又名硫胺素、抗神经炎素，通常以游离态，或以焦磷酸酯形式存在于自然界。在酵母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色蔬菜和牛乳、蛋黄中含量较为丰富。 分析方法：GB/T 5009.842003中唯一的方法是荧光计法。,荧光法原理：硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中，被氧化成一种兰色荧光物质，即为硫色素，在给定的条件下，以及没有其他物质干扰时，此荧光强度与硫色素含量成正比。 荧光测定条件： 激发波

20、长 365nm；狭缝 5nm. 发射波长 435nm；狭缝 5nm.,一、维生素B1的测定,维生素B 2的测定,维生素B2即核黄素。在食品中以游离形式或磷酸酯等结合形式存在。膳食中的主要来源是各种动物性食品，其中以肝、肾、心、蛋、奶含量最多，其次是植物性食品的豆类和新鲜绿叶蔬菜。 分析方法：GB/T 5009.852003中第一法为荧光法。第二法为微生物法。,原理 核黄素在440500nm波长光照射下发生黄绿色荧光，在稀溶液中，荧光强度与核黄素浓度成正比。在波长525nm下测定其荧光强度。试液再加入低亚硫酸钠(连二亚硫酸钠 Na2S2O4),将核黄素还原成无荧光的物质，然后再测定试液中残余荧光

21、杂质的荧光强度，两者之差即为食品中核黄素所产生的荧光强度。,维生素B 6的测定微生物法,原理：微生物的生长与它们对某些特定的维生素的需求有关，因此在维生素分析中，将某些微生物在含维生素的样品抽提液中的生长速率，与在含已知量维生素对照溶液中的生长速率进行对比，从而得出样品中该维生素的含量。生长速率可通过测定浊度、产酸量、质量变化或呼吸作用，测定浊度是最常用的方法。维生素B6的含量在2ng/mL以内，其浓度对卡尔斯伯酵母菌的生长速率有良好的线性关系，可以定量测定。,二、维生素C的测定,维生素C是一种己糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以又称作抗坏血酸。维生素C广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特

22、别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑桔等食品中含量尤为丰富。,氧化,氧化,还原型抗坏血酸 脱氢抗坏血酸 2，3二酮古乐糖酸,三、维生素C的测定,维生素C具有较强的还原性，对光敏感，氧化后的产物称为脱氢抗坏血酸，仍然具有生理活性。进一步水解则生成2，3 -二酮古乐糖酸，失去生理作用。食品分析中的所谓总抗坏血酸是指抗坏血酸和脱氢抗坏血酸二者的总量，不包括2，3 -二酮古乐糖酸和进一步的氧化产物。,VC检测技术2，6-二氯靛酚滴定法简便/须脱色、干扰多（深色、其他还原性物质）二甲苯二氯靛酚比色法 深色荧光法：准确度高，较复杂2,4-二硝基苯肼法,还原型VC的测定,总VC的测定,总VC=氧化型VC+

23、还原型VC+二酮古乐糖酸,少,氧化+还原+二酮古乐糖酸,操作复杂，结果易受影响,氧化型+还原型,1原理 还原型抗坏血酸可以还原染料2，6-二氯靛酚。该染料在酸性溶液中呈粉红色(在中性或碱性溶液中呈蓝色)，被还原后颜色消失。还原型抗坏血酸还原染料后，本身被氧化成脱氢抗坏血酸。在没有杂质干扰时，一定量的样品提取液还原标准染料液的量，与样品中抗杯血酸含量成正比。,（一）2，6-二氯靛酚滴定法还原性Vc*,还原型Vc 染料（显色） 氧化型Vc 被还原的染料（不显色）,（一）2，6-二氯靛酚滴定法还原性Vc,2. 试剂2%草酸溶液：称20g草酸，加水至1000mL；维生素C标准液：准确称20mgVC溶于

24、1%草酸中，并稀释至100mL，吸5mL于50ml容量瓶中，加入1%草酸至刻度，此溶液每毫升含有0.02mgVC；0.02%2，6-二氯靛酚溶液：称取2，6-二氯靛酚50mg，溶于200mL含有52mg碳酸氢钠的热水中，冷却后，稀释至250mL，过滤于棕色瓶中，贮存于冰箱内，应用过程中每星期标定一次。,（一）2，6-二氯靛酚滴定法还原性Vc, 0.001N KIO3标液：吸0.1N KIO3溶液5ml于500ml容量瓶内加水至刻度，每毫升相当VC 0.008mg 0.5%淀粉溶液； 6%KI溶液。,标定一：吸标液（VC）5ml于三角瓶加6%KI溶液0.5ml 加2%草酸溶液10ml 加1%淀粉

25、3滴用KIO3标液滴定到淡兰色。计算： 抗坏血酸浓度（mg/ml）=c V1 88/ V2 c- KIO3标液的浓度（mol/L）V1 - 滴定时消耗KIO3标液的体积（ml）V2 -维生素C溶液量,（一）2，6-二氯靛酚滴定法还原性Vc,标定二：吸5ml已知浓度V C标液 加5ml1%草酸 用染料2，6-二氯靛酚滴定至溶液呈粉红色，在15秒不褪色为终点计算：每毫升2，6-二氯靛酚相当于维生素C的毫克数等于滴定度（T） T= （C V1）/ V2C - 维生素C的浓度（mg/ml）V1 -维生素C的体积（ml）V2 -消耗2，6-二氯靛酚的体积（ml）,（一）2，6-二氯靛酚滴定法还原性Vc,

26、（一）2，6-二氯靛酚滴定法还原性Vc,测定过程A. 样品处理新鲜果蔬样品：称取鲜样50.0100.0g，放入组织捣碎机的杯中加入等重量的2%草酸提取液，快速捣碎1分钟，将样品打成浆状。样品处理的整个过程应在10分钟内完成，以免VC被空气氧化。 用小烧杯称取浆状物10.030.0 g（含还原性VC 15 mg），放入100mL容量瓶中，用2%草酸溶液定容，若有泡沫可加2滴辛醇除去。 过滤，如果滤液颜色深，影响滴定终点的判定时，可加入12勺白陶土脱色，不易过滤，可用离心机分离。,多汁果蔬样品：可用纱布压汁后脱脂棉花快速过滤，量取1020mL汁液，立即用2%草酸溶液定容至100mL容量瓶中干样品：

27、称取1.0004.000 g（含还原性Vc 15mg），放入研钵中，加入少许2%草酸溶液研磨成浆状液，洗入100mL容量瓶中，用20g/L草酸溶液定容。含有还原性物质的样品：含有较多Fe2+的样品可用8% 醋酸代替用2%草酸溶液作为浸提剂。亚硫化脱水样品，可于稀释至一定容量之前加入20mL丙酮，以除去SO2的干扰。,（一）2，6-二氯靛酚滴定法还原性Vc,B 滴定：吸取以上制备的无色滤液5.0010mL（含Vc约0.21mg）放入50mL三角瓶中，用棕色半微量滴定管中装的2，6-二氯靛酚标准溶液滴定至浅红色，约在15秒内不褪色为终点, 同时以浸提剂作为空白（空白值为0.080.10 mL）进行

28、滴定。计算： Vc（mg/100g )=(VV0) T/m100式中：x样品中还原型抗坏血酸含量，mg/100g；V滴定时样液消耗染料的体积，mL；V0空白滴定时消耗染料的体积，mL；T用标准还原型抗坏血酸溶液标定染料溶液所得出1mL 染料溶液相当于抗坏血酸的量，mg/mL；m滴定时所取滤液中含有样品的质量，g,（一）2，6-二氯靛酚滴定法还原性Vc,注意事项: 所有试剂的配制最好都用重蒸馏水； 滴定时，可同时吸二个样品。一个滴定，另一个作为观察颜色变化的参考；样品进入实验室后，应浸泡在已知量的2%草酸液中，以防氧化，损失维生素C；2%草酸有抑制抗坏血酸氧化酶的作用，而1%草酸无此作用；贮存过

29、久的罐头食品，可能含有大量的低铁离子（Fe2+），要用8%的醋酸代替2%草酸。这时如用草酸，低铁离子可以还原2，6-二氯靛酚，使测定数字增高，使用醋酸可以避免这种情况的发生；,（一）2，6-二氯靛酚滴定法还原性Vc, 整个操作过程中要迅速，避免还原型抗坏血酸被氧化；滴定开始时，染料溶液应迅速加入直至红色不立即消失，而后尽可能一滴一滴地加入，并不断摇动三角瓶，至粉红色15s 内不消失为止。样品中某些杂质还可以还原染料，但速度较慢，故滴定终点以出现红色15s 不褪色为终点。滴定时，可同时吸二个样品。一个滴定，另一个作为观察颜色变化的参考 在处理各种样品时，如遇有泡沫产生，可加入数滴辛醇消除； 测定

30、样液时，需做空白对照，样液滴定体积扣除空白体积。,（一）2，6-二氯靛酚滴定法还原性Vc,(二)荧光法（GB/T 5009.86-2003 第一法）原理 样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化生成脱氢型抗坏血酸后，与邻苯二胺反应生成具有荧光的喹喔啉。在一定条件下，喹喔啉的荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度成正比，以此测定食物中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。一定条件：激发光：338nm 发射光：420nm,（三）2，4-二硝基苯肼法- Vc总量GB/T 5009.862003 蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸含量测定方法第二法,总抗坏血酸包括： 还原型 脱氢型 二酮古乐糖酸型。 此法是将样品的还原型抗坏血酸氧

31、化为脱氢型抗坏血酸，然后与2，4-二硝基苯肼作用，生成红色的脎。脎的量与总抗坏血酸含量成正比，将红色脎溶于硫酸后进行比色，由标准曲线计算样品中总Vc。,1、原理：样品中还原型的抗坏血酸经活性碳氧化为脱氢型抗坏血酸，再与2，4二硝基苯肼作用，生成红色的脎，其呈色强度与总抗坏血酸含量成正比，进行比色测定。,（三）2，4-二硝基苯肼法 - Vc总量,（三）2，4-二硝基苯肼法 - Vc总量,2、测定步骤(1) 样品提取 同2，6-二氯靛酚滴定法(2) 氧化处理：取25mL样品滤液 + 2g活性炭 振摇1min 过滤收集滤液 + 2% 硫脲10mL(目的：防止Vc继续氧化)(3)显色反应: 取三支试管

32、，每支试管都加入上述氧化稀释液4mL。其中一支试管作空白，另两只试管各加入1.0mL22，4二硝基苯肼溶液，将三支试管放入（370.5）恒温箱或水浴中准确保温3h。取出试管放入冰水中。,空白管冷至室温后加入0.1mL22，4二硝基苯肼溶液，1015min 后也放入冰水中。向每支试管滴加 5mL85硫酸，边加边摇动，滴加时间至少需要1min。加完硫酸后将试管从冰水中取出，室温下准确放置30min 后立即比色。,（三）2，4-二硝基苯肼法 - Vc总量,(4)比色：用1cm 比色杯以空白液调零点，于500nm 波长下测吸光值。,本步已成脎，但显色不稳定用浓硫酸处理，转变为橘红色的双-2，4-二硝基

33、苯,(5) 标准曲线的绘制 取5个50ml容量瓶编号 1 2 3 4 5 加VC标准液 10 20 30 40 50ml 取5个比色管取相应 2 2 2 2 2 加硫脲溶液（滴） 1 1 1 1 1 2，4-二硝基苯肼（ml） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 于37保温箱3小时，取出于冰浴中，然后滴加85%硫酸5ml取出放30分钟在500nm下，测各吸光值绘标准曲线，同时做空白。 计算：每百克食品中抗坏血酸的毫克数=C/W *100,（三）2，4-二硝基苯肼法 - Vc总量,3、注意事项 硫脲可以保护抗坏血酸不被氧化，并且能帮助脎的形成。最终溶液中硫脲的浓度应一致，否则影响色度。 试管从冰中取出后，样品中糖类的存在会造成颜色逐渐加深，因此30分钟后准时比色。 活性C氧化剂+脱色剂（深色样品） 无色或已脱色样品溴或2，6二氯靛酚作氧化剂,课后习题：1，说明三氯化锑比色法测定VA的原理。在测定VA时，皂化的目的是什么？VA与三氯化锑所形成的蓝色络合物稳定时间极短，应如何安排实验操作？测定前，为什么要往比色杯里加1滴乙酸酐？2、简述2，6-二氯靛青测定Vc应注意的问题。3、测定食品中维生素有哪些方法？各有什么优缺点？,