医学免疫学检验 细胞因子测定及应用课件.ppt

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1、2020年10月2日,1,细胞因子及其受体的检测,第一课件网网站,2020年10月2日,2,第一节 细胞因子检测概述,一、细胞因子的类型与作用特点二、细胞因子检测的特点与方法,2020年10月2日,3,由非神经内分泌细胞产生的一大类与免疫应答活动密切相关的低分子蛋白与多肽。,细胞因子,2020年10月2日,4,细胞因子的类型与作用特点,1、细胞因子的分类2、细胞因子的作用特点,2020年10月2日,5,以生物学作用进行划分的分类,白细胞介素（Interleukin） IL-1、IL-2、 IL-18干扰素（Interferon） IFN-、IFN-、IFN-肿瘤坏死因子（Tumor necro

2、sis factor） TNF- 、 TNF- 集落刺激因子（Colony-stimulating factor） M-CSF、G-CSF转化生长因子（Transforming growth factor） TGF- 趋化因子（Chemokine） IL-8、GROs、MCP-1生长因子（Growth factor） EGF、FGF、IGF、PDGF,2020年10月2日,6,TNFs,ILs,IFNs,TGFs,Chemokines,CSFs,各类细胞因子间关系,2020年10月2日,7,1、旁分泌（paracrine）、自分泌（autocrine）性2、多源与同源性3、高效性4、多效性（p

3、leiotropy）5、丰余性（redundancy）6、协同性7、拮抗性8、网络性,2020年10月2日,8,细胞因子,细胞因子,细胞因子受体,细胞因子受体,细胞因子的自分泌与旁分泌性,2020年10月2日,9,I L-2 I FN- TNF-,细胞因子的同源性与多源性,I FN-,T细胞,T细胞,NK细胞,2020年10月2日,10,IL-4,肥大细胞,Th细胞,细胞因子的多效性,2020年10月2日,11,细胞因子的丰余性,IL-2IL-4IL-5,2020年10月2日,12,细胞因子的协同性,IL-4IL-5,2020年10月2日,13,细胞因子的拮抗性,IL-4,I FN-,2020

4、年10月2日,14,细胞因子的网络性,IL-3、IL-5、IL-4、IL-6、 GM-CSF,TNF TGF IL-1 IFN,IL-1 IFN,TNFIL-1 TGF,IFNIL2 IL-4,IFN IL2 IL-4 IL-5 IL-6,TNF IFN IL-1 TGF,TNF IL-1 IFN IL-5 GM-CSF G-CSF M-GSF,TNF,TNF IL-1 TGF,IL-1 IL-6 GM-CSF G-CSF M-GSF,IL-1 IL-6,IL-1 IL-6 GM-CSF G-CSF M-GSF IFN,内皮细胞,成纤维细胞,T,B,2020年10月2日,15,细胞因子检测的特

5、点与方法,1、检测的特点2、检测的方法,2020年10月2日,16,细胞因子检测的特点,免疫原性较弱样品含量低样品具有时效性生物效应特异性差,2020年10月2日,17,细胞因子检测的方法,免疫学检测方法抗原性检测细胞生物学检测方法生物活性检测分子生物学检测方法基因表达检测,2020年10月2日,18,第二节 细胞因子检测的方法与原理,一、细胞因子的细胞生物学检测二、细胞因子的免疫学检测三、细胞因子的分子生物学检测,2020年10月2日,19,细胞因子的细胞生物学检测,1、检测方法与原理2、检测中的操作注意要点,2020年10月2日,20,检测方法与原理,细胞增殖或增殖抑制试验细胞病变抑制试验

6、细胞毒试验细胞趋化试验,2020年10月2日,21,滤膜：计数受趋化细胞,趋化因子,细胞,趋化试验原理示意,2020年10月2日,22,检测中的操作注意要点,靶细胞的选择与培养检测标本的制备显示检测结果,2020年10月2日,23,靶细胞的选择与培养,1、对所测的细胞因子有特异的敏感性2、易培养、保存、生物学特性稳定3、有良好的生长状态4、种属适配,2020年10月2日,24,各类细胞因子检测的常用靶细胞,细胞因子 实验系统 干扰因素IL-1 D10（M）增殖法 IL-2、IL-4 EL-4（M）增殖法 IL-4 A352（H）增殖抑制法IL-2 CTLL（M）增殖法 IL-4IL-3 KG-

7、1（H）增殖法 TF-1（H）增殖法 GN-CSF、IL-5 IL-6、EPOIL-4 CTLL（M）增殖法 IL-2IL-5 BCL-1（M）增殖法 IL-4,2020年10月2日,25,各类细胞因子检测的常用靶细胞,细胞因子 实验系统 干扰因素IL-6 B9（M）增殖法 IL-4、IL-11 BM60（H）增殖法 IL-7 Clone-IXN/2b（M）增殖法 IL-8 中性粒细胞（M、H）趋化法GM-CSF TF-1（H）增殖法 IL-3、IL-5 IL-6、IL-5TNF/ L929 （M、H）细胞毒法IFN wish（H）病变保护法 IFN- 、 IFN- L929（M）病变保护法

8、IFN- 、 IFN- ,第一课件网网站,2020年10月2日,26,检测标本的准备,1、分离特定的产生细胞2、对产生细胞进行诱导、激活3、选择适当的收集时间,2020年10月2日,27,显示检测结果,1、细胞增殖状态的显示： 放射性核素掺入法、 胞内酶活性显示法 活细胞染色法 细胞荧光测定法2、细胞毒或细胞病变状态的显示 活细胞染色法 胞内酶活性显示法 DNA断片测定法,2020年10月2日,28,直接计数法 简便、直观,但费时、主观因素影响大、难以标准化和自动化 细胞代谢活性测定方法 3H-TdR、125I-UdR掺入法或MTT等比色法细胞代谢产物测定法 代谢产物荧光强度测定法和指示细胞表

9、面标记或可溶性分子测定法,细胞增殖检测方法分类,2020年10月2日,29,通过检测细胞DNA合成的增加或减少来判断细胞增殖的方法。在细胞的增殖过程中，DNA合成的增加使得指示细胞对核苷或碱基的需求增多，若将核苷标记上可以示踪的同位素（3H/125I ），通过检测细胞内的同位素含量，则可反映细胞增殖的程度。,结果客观易于自动化；适用于大标本量的测定,优点,缺点,方法的特异性受依赖细胞株影响；放射性污染,(1) 放射性核素掺入法,2020年10月2日,30,特点：不使用放射性核素， 以细胞代谢变化为增殖指征 指示细胞的增殖情况与线粒体代谢活性相关,测定步骤类似,相同点,不同点,与同位素掺入法相比

10、,掺入物：MTT而非3H-TdR；反应条件：选用的细胞及其浓度、 培养时间不同,(2) MTT 比色法,2020年10月2日,31,敏感性较高特异性不高操作繁琐易受干扰,生物学活性测定方法学评价,2020年10月2日,32,细胞因子的免疫学检测,分泌型细胞因子的检测细胞内细胞因子的检测,2020年10月2日,33,敏感性偏低不能判断细胞因子的生物学活性。,ELISA,特异、简便易于推广和标准化等优点可同时检测大量标本且试验废弃物便于处理细胞因子测定的首选方法,优点,缺点,2020年10月2日,34,ELISPOT,2020年10月2日,35,酶联免疫斑点试验(ELISPOT或ElisaSpot

11、),在包被有待测细胞因子抗体的微孔板上，加入可分泌相应细胞因子的待测细胞，经在有或无刺激物存在的条件下培养，待测细胞分泌细胞因子于其周围，并被板上的特异性抗体捕获。后续的反应如同ELISA，即在洗去细胞后视用于试验的酶标抗体为一抗或二抗，分别作直接或间接法。,一个斑点代表一个细胞因子分泌细胞，斑点的颜色深浅程度与细胞分泌的细胞因子量相关,基本原理,2020年10月2日,36,细胞内细胞因子检测技术,激活,膜抗原标记,细胞内细胞因子标记,2020年10月2日,37,流式细胞分析法,流式细胞分析法，是基于荧光抗体染色技术并借助流式细胞仪敏感的分辨力所建立的方法。该法主要用于细胞内细胞因子和细胞表面

12、粘附分子的检测，通过特异性的荧光抗体染色，能简单、快速地进行单个细胞水平的细胞因子或粘附因子的检测，精确判断不同细胞亚群细胞因子和膜分子的表达情况。,1分离和培养待检细胞 2细胞固定 3封闭非特异性结合位点 4染色与分析,基本步骤,2020年10月2日,38,使用流式细胞分析法，可以：,区分不同分泌特性的细胞亚群： Th1细胞 IFN- Th2细胞 IL-4细胞表面的粘附分子或细胞因子受体： 单克隆抗体技术 直接或间接荧光抗体染色 无需作细胞固定和非特异性结合位点的封闭 待测细胞是新鲜分离或培养的活细胞，保持良好状态,2020年10月2日,39,四、免疫学测定方法学评价,优点： 特异性高 操作

13、简便、快速，无需依赖细胞株 影响因素较少且易控制，重复性好，方法容易标准化。缺点： 所测定的只是细胞因子的蛋白含量，与其生物活性不一定呈正比 结果与所用的抗体来源及亲和力有很大的关系 敏感性相对较低 标本中细胞因子的可溶性受体，会影响特异性抗体对细胞因子的结合,2020年10月2日,40,细胞因子的分子生物学检测,此方法测定的并非细胞因子本身，而是细胞因子的基因。方法：1、Northern印迹杂交法2、Southern 印迹杂交法 3、PCR与逆转录PCR4、原位杂交，原位PCR和原位RTPCR,2020年10月2日,41,第三节 常用细胞因子的检测方法,一、IL-2的检测二、IFN-的检测三

14、、TNF的检测,2020年10月2日,42,待检样品（细胞上清） 指示细胞（CTLL-2）,按不同稀释度加入,37C，16-20小时,加入3HTdR（1-5Ci）,37C，4-6小时,收集细胞,测定,白细胞介素-2的测定示意图,2020年10月2日,43,待检样品（细胞上清） 指示细胞（L929）,按不同稀释度加入,37C，4小时,37C，24-48小时,弃取上清，加入VSV,观察细胞病变（镜检或比色）,干扰素的测定示意图,2020年10月2日,44,肿瘤坏死因子的测定示意图,待检样品（细胞上清） 指示细胞（L929）,按不同稀释度加入,37C，24小时,弃取上清，洗涤,加入结晶紫染液，洗涤,

15、加入细胞裂解液，比色,2020年10月2日,45,第四节 细胞因子受体的检测,一、细胞因子受体的类型二、细胞因子受体的检测,2020年10月2日,46,细胞因子受体的类型,膜型细胞因子受体分泌型细胞因子受体,第一课件网网站,2020年10月2日,47,细胞因子受体的检测方法,膜型细胞因子受体的检测 配体检测法 抗体检测法分泌型细胞因子受体的检测 标记抗体检测法,48,演讲完毕，谢谢观看！,Thank you for reading! In order to facilitate learning and use, the content of this document can be modified, adjusted and printed at will after downloading. Welcome to download!,汇报人：XXX 汇报日期：20XX年10月10日,