蛋白质组学课件.ppt

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1、Proteome & Proteomics,Proteome & Proteomics 定义,Proteome：1994年，由澳大利亚Macguarie大学的Wilkins等首先提出：“蛋白质组指的是一个基因组所表达的全部蛋白质”(proteome indicates the proteins expressed by a genome)“proteome”是由蛋白质一词的前几个字母“prote”和基因组一词的后几个字母“ome”拼接而成蛋白质组(Proteome) :细胞内的全部蛋白质,Proteomics定义,蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，研究细胞内所有蛋白质及其动态变化规律的科学最早

2、是在1995年提出的，它在本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质特征：表达水平 （量）翻译后的修饰（成熟与调控）蛋白与蛋白相互作用（信号通路）等由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识,Proteome 与 Genome关系,互补的角度/空间来研究细胞的分子架构相辅相成Genome - 导演RNome - 编剧Proteome-演员,Proteome 与 Genome区别,稳定性Proteome - 静态 Genome - 动态修饰化程度Proteome - 高 Genome - 底复杂程度Proteome - 高 （20aa + 高度多样性修饰）Genome - 底

3、 （4nt）特异性Proteome - 组织和细胞特异性 Genome - 无组织和细胞特异性,功能蛋白质组(functional proteome),1997年，由Cordwell和Humphery-Smith提出的，它指的是在特定时间、特定环境和实验条件下基因组活跃表达的蛋白质。功能蛋白质组只是总蛋白质组的一部分，通过对功能蛋白质组的研究，既能阐明某一群体蛋白质的功能，亦能丰富总蛋白质数据库，是从生物大分子(蛋白质、基因)水平到细胞水平研究的重要桥梁环节。,功能蛋白质组,蛋白质组学研究思路与方法,策略、技术、工具,蛋白质组研究相关网站,蛋白质组学研究依赖生物信息学和网络技术http:/ww

4、w.proteomeworks.bio- 蛋白质组研究技术、信息等http:/ 发现新蛋白及新作用(新药开发)http:/www.proteome.med.umich.edu 蛋白质组研究相关企业、各 种仪器来源、新闻等http:/www.proteome.co.uk 各种蛋白质组研究相关信息http:/www.micromass.co.uk 介绍蛋白质鉴定的先进仪器http:/www.expasy.ch 蛋白质鉴定专家系统，Swiss Institute of Bioinformatics http:/expasy.proteome.org.au 蛋白质鉴定专家系统，Australian P

5、roteome Analysis Facilityhttp:/expasy.cbr.nrc.ca 蛋白质鉴定专家系统，Canadian Bioinformatics Resours,主要专业术语及其英文对照和缩写,IPG-IEF：固相pH梯度等电聚焦（immobilized pH gradients isoelectric focusing）SDS- PAGE：十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis）2-DE：双向电泳(Two Dimensional Electrophoresis

6、)HPLC：高效液相色谱（High performance Liquid Chromatography）MALDI-TOF MS：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry),研究策略与技术,两条互补的实验流程基于凝胶的工作流程（Gel-based workflow）基于液相色谱的工作流程（LC-based workflow）,蛋白质组学实验室所需的条件,双向凝胶电泳（2DE）,是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离）

7、然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小）凝胶经染色得到二维分布的蛋白质图,蛋白质组研究的基本技术,2D-SDS-PAGE：样品制备第一向IPG-IEF电泳IPG平衡第二向SDS-PAGE电泳染色（银染）及 图谱分析目标蛋白获取及其鉴定（MC分析）,2DE结果图谱,蛋白质组研究的基本技术- 样品预分离,样品的制备（预处理）：组织细胞细胞器（线粒体、叶绿体、细胞核）,蛋白质组研究的基本技术- 蛋白提取,重要性：在制备时丢失的蛋白永远不能在后面实验中弥补把蛋白质看作具有独特而奇妙性质的实体原则：使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀 防止在样品制备过程中发生样

8、品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白,蛋白质组研究的基本技术- 蛋白提取,步骤：破碎沉淀蛋白去除杂质,蛋白质组研究的基本技术- 蛋白提取,样品制备流程 - 破碎尽可能减少蛋白水解/其它形式蛋白降解原则机械法（超声波法、高压法 、机械匀浆法 ）化学法（去污剂法、酶裂解法 ）物理法（液氮研磨法、循环冻融法、渗透法 、玻璃珠破碎法 ）,蛋白质组研究的基本技术- 蛋白提取,样品制备流程 - 沉淀蛋白 去杂浓缩后蛋白可溶性是关键 TCA-丙酮沉淀法 三氯醋酸（TCA）沉淀法 引起降解/修饰 丙酮沉淀法 硫酸铵沉淀法 影响IEF醋酸铵沉淀法 步骤繁琐,2D电泳结果影

9、响因素分析,蛋白质组研究的基本技术- 蛋白提取,样品制备流程 - 去除杂质 关键是尽量不丢失蛋白和减少蛋白修饰 核酸的清除 （DNase/Rnase）多糖的清除 （超离心 、TCA沉淀等）去污剂的清除 （丙酮沉淀法等）盐离子和外源带电小分子的清除（透析、TCA-丙酮沉淀法）,2D电泳结果影响因素分析,可能原因：样品含高丰度Pr,可能原因：TCA残留致使Pr丢失,2D电泳结果影响因素分析,可能原因：Tris质量不好,可能原因：Urea 不纯,蛋白质组研究的基本技术- 蛋白提取,样品制备注意事项：蛋白质水解 - 蛋白酶抑制剂(PMSF等)特殊样品的制备 (低丰度 、强碱性蛋白质 （核糖体）、极端分

10、子量 )样品定量 重复性,2D-SDS-PAGE重复性,The same protocol and sample, however not the same resultsRec: similar; cir: different,2-DE,第一向IPG-IEF电泳IEF是一种根据样品的等电点不同而使它们在pH梯度中相互分离的一种电泳技术将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带从而得知其等电点信息,IEF的基本条件,step 1,step 2,step 3,total,voltage,Time

11、,Volt-Hours,Ramp,250,20min,Linear,4000,4000,2hr,10,000V-hr,Linear,Rapid,5 hr,14,000V-hr,7 cm,step 1,step 2,step 3,total,total,step 1,step 2,step 3,11 cm,17 cm,250,250,8000,10000,10000,8000,20min,20min,2.5hr,2.5hr,20,000V-hr,40,000V-hr,30,000V-hr,50,000V-hr,5.3 hr,7 hr,Linear,Linear,Linear,Linear,Rap

12、id,Rapid,IPG-IEF电泳,2-DE,第二向垂直SDS-PAGE电泳聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应 。SDS与蛋白质形成雪茄状带负电荷复合物，从而消除了蛋白间的电荷及形状差异，电泳速度仅与分子量有关 从而得知其分子量信息,第二向垂直SDS-PAGE电泳,凝胶浓度与其对应的分离范围,胶浓度 分离范围(KD) 5% 36-200 7.5% 24-200 10% 14-200 12.5% 14-100 15% 14-60,第二向垂直SDS-PAGE电泳,步骤：溶液配置(Buffer、Bis-Acr、AP、TEMED)灌胶电泳,Ettan Dalt twelv

13、e电泳系统,第二向垂直SDS-PAGE电泳,Ettan Dalt six电泳系统,2-DE 凝胶蛋白质斑点的检测,染色： 1）考马斯亮兰染色法； 2）银染法； 3）负染法； 4）荧光染色法； 5）放射性同位素标记法等,2-DE 凝胶蛋白质斑点的检测,图像扫描和分析Image Scanner II,2-DE 凝胶蛋白质斑点的检测,全自动斑点切取系统（Ettan Spot Picker）,2-DE 凝胶蛋白质斑点的检测,质谱或MALDI-TOF MS质谱分析基本原理是使试样中各组分电离生成不同荷质比的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器，利用电场和磁场使发生相反的速度色散离子束中速度

14、较慢的离子通过电场后偏转大，速度快的偏转小；在磁场中离子发生角速度矢量相反的偏转，即速度慢的离子依然偏转大，速度快的偏转小；当两个场的偏转作用彼此补偿时，它们的轨道便相交于一点。与此同时，在磁场中还能发生质量的分离，这样就使具有同一质荷比而速度不同的离子聚焦在同一点上，不同质荷比的离子聚焦在不同的点上，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。,2-DE 凝胶蛋白质斑点的检测,MALDI-TOF MS样品溶于固定的底物中形成晶体，用激光脉冲使其离子化，离子被加速后通过飞行管时分离，所有离子均可被检测，常用来测蛋白质、多肽、核酸和多糖等生物大分子,2-DE 凝胶蛋白质斑点的检测,通过质谱分析，

15、可以获得分析样品的分子量、分子式、分子中同位素构成和分子结构等多方面的信息,SARS病毒N蛋白整体分子量,蛋白质功能研究技术,蛋白质功能研究技术,酵母双杂交,蛋白质功能研究技术,Co-IP技术,蛋白质功能研究技术,Co-IP&Pull down,蛋白质组在医学研究中的现状和前景,蛋白质组在医学研究中的现状和前景,人类疾病的蛋白质组研究直肠癌：Sanchez等对15例结肠癌和13例正常人的结肠上皮进行2-DE。建立了包括882和861个斑点的结肠癌及正常人结肠粘膜的标准胶图。结果发现在分子量为13kD和pI值为5.6处的蛋白质仅出现在结肠癌的组织中。经鉴定为：钙粒蛋白B（calgranulin

16、B）及钙卫蛋白（calprotectin）,蛋白质组在医学研究中的现状和前景,人类疾病的蛋白质组研究肝癌 - 醛糖还原酶 膀胱癌 -醛糖还原酶 、Trp-tRNA合成酶、IFN-诱导的r3，SOD及35.8kD和11.2kD两未知蛋白 扩张型心肌病 - 8种蛋白质,蛋白质组在医学研究中的现状和前景,致病微生物的蛋白质组研究 检测博氏疏螺旋体与免疫有关的蛋白质 弓形体抗原的检测白色念珠菌 -对真菌细胞壁蛋白分析筛选抗药真菌药物,蛋白质组学研究趋势,蛋白质组学研究趋势,在应用研究方面蛋白质组学将成为寻找疾病分子标记和药物靶标最有效的方法之一 在技术发展方面研究方法将更强调各种方法间的整合和互补，以适应不同蛋白质的不同特征蛋白质组学与其它学科的交叉互动,