动物疫病检测技术课件.ppt

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1、分子诊断学,20世纪 50年代 Watson和 Crick提出了 DNA双螺旋结构模型，标志着分子生物学作为一门独立学科的诞生。70年代以来，分子生物学已成为生命科学领域最具活力的学科前沿。由于分子生物学理论和技术方法不断地被应用于临床 ,在疾病的预防、预测、诊断、疗效的评价等诸方面发挥着愈来愈重要的作用。分子生物学与临床医学的广泛交叉和渗透 ,产生了一个崭新的学科方向-分子医学; 70年代末 ,美国科学院院士美籍华裔科学家 Kan等 应用液相 DNA分子杂交成功地进行了镰形细胞贫血症的基因诊断 ,标志着检验诊断进入基因诊断时代。由于基因诊断是从疾病基因或与致病相关的基因及其表达产物的水平上进

2、行检测 ,因此实现了疾病的早期诊断 ,但由于基因诊断方法以现代分子生物学技术为基础并有机整合了细胞学、遗传学、免疫学等技术 ,使基因诊断更具先进性、精确性和快速 ,因此大大提高了诊断的特异性和灵敏度。,随着基因诊断技术的不断改进和日臻成熟 ,其涉及领域和应用范围不断扩大 ,特别是 80年代中期聚合酶链反应 (PCR)技术的问世以及 90年代初人类基因组计划的启动 ,进一步推动了基因诊断技术的发展。1999年 11月 ,美国研究病理学会和分子病理学协会创刊出版了The JournalofMolecularDiagnostics杂志,标志着基因诊断技术已经发展成为一个成熟的学科 分子诊断学。,分子

3、诊断学,是以分子生物学理论为基础 ,利用分子生物学的技术和方法研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化 ,为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据。,回顾分子诊断学 20余年的发展历史 ,大致经历了 3个阶段:(1)利用 DNA分子杂交技术进行遗传病的基因诊断 ; (2)以 PCR技术为基础的 DNA诊断 ,特别是定量 PCR和实时 PCR的应用 ,不仅可以检测存在于宿主的多种 DNA和 RNA病原体载量 ,还可检测多基因遗传病细胞中 mRNA的表达量 ; (3)以生物芯片 (biochip)技术为代表的高通量密集型检测技术 ,生物芯片技术包括基因

4、芯片、蛋白质芯片、组织芯片等 ,由于其工作原理和结果处理过程突破了传统的检测方法 ,不仅具有样品处理能力强、用途广泛、自动化程度高等特点 ,而且具有广阔的应用前景和商业价值 ,因此成为分子诊断技术领域的一大热点。,分子诊断技术的应用,针对传染病的分子诊断技术：现有的很多诊断技术存在着操作不便、费用高昂等缺陷，聚合酶链式反应、单克隆抗体等分子诊断技术如能得到更广泛的使用，进一步降低成本，将可以提高发展中国家传染病诊断的水平，使死亡率降低。分子诊断技术在微生物学研究领域已显出优势：细菌鉴定有很多方法，传统方法如表型表达和生物化学技术等，但操作费时和技术复杂。诸如引起肺结核的分支杆菌，其生长缓慢，经

5、常要培养几周。如果不能对细菌进行快速精确的鉴定，医生只能给患者开广谱抗生素 ,因而引发无效治疗和细菌耐药性。,随着分子生物学的发展，对细菌的分子诊断技术正在成熟。DNA所包含的遗传信息决定了不同种生物之间以及同种生物的不同亚种/株系之间的差异。因此分子诊断对细菌的分型比传统方法更为准确。DNA的分析方法有多种，如定量PCR、分子杂交(包括基因芯片)和DNA 序列分析等。而只有DNA 序列测定分析是黄金标准。很显然，DNA包含的遗传信息存在于DNA和ATCG排列次序中，搞清ATCG排列次序对DNA分析来说就是终结指标。如对诸如16S RNA和内源RNAse P 基因的序列分析可以判断很多不同种类

6、细菌或同种细菌的不同亚种/株系。但16S rRNA基因的序列分析不能用来分析炭疽热细菌 ,因为 anthracis与B1cereus具有同样的16S rRNA 序列 。对内源的 RNAse P基因的序列分析可以判断不同种类细菌或同种细菌的不同亚种 。,分子诊断技术是新变异的病原体检测的最有效的手段之一。如：SARS。,常见的分子诊断方法,核酸分析技术,PCR,5,3,延伸,延伸,5,3,变性、退火,变性、退火,PCR扩增原理,反向PCR (reverse PCR)：是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。,已知序列,未知序列,未知序列,高浓度引

7、物,低浓度引物,不对称PCR,多重PCR（复合PCR）,电泳,引物,1,2,3,4,1,2,3,4,LP-PCR（Labelled primers),观察,锚定PCR（anchored PCR, A-PCR）原位：利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。：,逆转录酶,聚合酶,PCR扩增,mRNA,杂化双链,cDNA,荧光定量 PCR（real-time PCR),通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。

8、在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图 。,目前 实时荧光 PCR 技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。其中最主要的应用集中在以下几个方面： DNA 或 RNA 的绝对定量分析 。包括 病原微生物或病毒含量的检测 , 转基因动植物转基因拷贝数的检测， RNAi 基因失活率的检测等。 基因表达差异分析。例如比较 经过不同处理样本之间特定基因的表达差异 (

9、如药物处理、物理处理、化学处理等 ) ，特定基因在不同时相的表达差异以及 cDNA 芯片或差显结果的确证 基因分型。例如 SNP 检测，甲基化检测等。对病毒感染的诊断起到了量化的作用。同时，对研究病毒和机体之间的关系提供了参考。随着实时荧光定量 PCR 技术的推广和普及，该技术必然会得到更广泛的应用。,巢式PCR（Nest-PCR）,巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。,巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5 RACE）的特异性。,PCR技术是一种敏感性非常高的检测已感染的宿主或带菌者病原的方法 ,即使只

10、有少量的宿主细胞被感染 , PCR以感染的病原微生物 DNA与宿主细胞中 DNA整合的靶 DNA为模板扩增出已知基因序列 ,也能扩增未整合的病原基因组序列PCR技术在检测疫苗污染中也起到重要的作用。然而 ,这种方法不能区分活的有机体和死亡的有机体或是不完整的基因组碎片 ,这可导致结果解释的复杂性和影响 PCR在实际检测中的应用。PCR技术在慢性持续性感染的疾病检测中非常有用 ,如逆转录病毒感染 (牛的白血病病毒感染、羊脑炎、关节炎病毒感染等 ) ,这些疾病在诊断和预防中存在严重困难是因为被感染动物是一个持续性潜在的传染源。,杂交技术,核酸杂交技术,Southern Blot将待检测的DNA分子

11、用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。,DNA 琼脂糖电泳 印迹转移 预杂交 杂交（变性探针） 洗膜 放射自显影或显色,Northern Blot,在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern

12、Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。,mRNA提取 甲醛变性电泳 印迹转移 预杂交 杂交（变性探针） 洗膜 放射自显影或化学发光,mRNA提取 甲醛变性电泳 印迹转移 预杂交 杂交（变性探针） 洗膜 放射自显影或化学发光,探针标记技术,1 标记物：放射性和非放射性两种放射性：P32 非放射性：生物素、地高辛素、荧光素 2、标记方法 （1）切口平移法 （2）随机引物法（3）末端标记法（4）单链DNA探针标记（5）寡核苷酸探针标记法,基因芯片,利用核酸杂交的原理，应用于DNA、RNA的研究基因芯片（Genechip）就是利用点

13、样机等机械装置，在玻璃等支持物表面整齐地点上高密度的、成千上万个“点”，每个“点”含有可与一种基因杂交的一条DNA探针。由于芯片上有序地排列着DNA探针，因此也被称为微阵列（Microarray）。在芯片上滴加样品后，在合适的条件下，样品中含有的各种核酸片段（cDNA或cRNA）就与相应的探针杂交。由于核酸片段上已标记有荧光素，激发后产生的荧光强度就与样品中所含有的相应核酸片段的量成正比，也就代表该基因的表达量。经激光共聚焦扫描仪等装置扫描后，所获得的信息经专用软件分析处理，即可获得成千上万种基因的表达情况。正因为这种特点，基因芯片技术已成为当前生命科学研究的热点之一。,蛋白质分析技术,Wes

14、tern Blot,原理：抗原抗体反应步骤：SDS-PAGE电泳 转膜（PVDF或硝酸纤维素膜）封闭 一抗 洗涤 酶标二抗反应洗涤 显色或化学发光显影,免疫印迹主要是在实验室诊断中用于区分或辨别感染性的微生物 ,而且是以抗原特异性或用已知的抗原来检测特异性抗体。在其他检测方法中的假阳性结果或假阴性结果经常能在免疫印迹实验分析中得到解决。免疫印迹也经常用来辨别单克隆抗体的类型。个别纯化的多肽 (或表达的重组蛋白 )可以使用免疫印迹转膜的方法进行蛋白活性的检测 ,也可以用来区分动物血清中的抗体是免疫引起的还是感染引起的。,ELISA,加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受

15、检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。测定方法具有很高的敏感度（pg-ng/ml水平），并且重复性好。,ABS-ELISA技术（Avidin Biotin system-ELISA）,亲和素是一种分子量是60，000的碱性蛋白，由四个相同亚基组成，每个亚基有一个生物素分子结合点。两者均可与抗体等大分子生物活性物质相偶联，又可被酶类等多种材料所标记，成为一种生物反应放大系统。生物素化抗体可捕获多个亲和素，后者再与酶结合，加入底物后，产生颜色反应。这一系统可以大大提高ELISA的灵敏度。,操作过程：抗原包被 封闭 待检标本 生物素化抗体 洗涤 酶标记亲和素 洗涤 加底物显色和检

16、测,免疫荧光技术,利用某些荧光素，如FITC、R-PE等通过化学反应与抗体或其它蛋白结合制备成荧光探针，然后与被测抗原或配体发生特异性结合，形成的荧光复合物在一定波长光的激发下可产生荧光，因此利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测未知抗原或相应配体。,免疫组织化学技术,是指酶标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的成色反应，对相应的抗原进行定性、定位和定量测定的一项技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙的结合起来，借助显微镜（包括荧光显微镜、电子显微镜等）的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等），并可在原位显示相应

17、的基因和基因表达产物。免疫荧光法（Immunofluorescence technique）免疫酶法（Immunoperoxidase technique）免疫金银法（Immunogold technique）ABC法（ Avidin-Biotin Complex）近年来免疫组织化学已快速成为一种实验室诊断和鉴定病毒、细菌、原生动物等微生物抗原的一种标准的方法。,蛋白质相互作用研究技术,Pulldown技术：IS、GST融合蛋白将IS或GST融合蛋白作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白结合，然后根据IS或GST琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在得到目标蛋白的抗体前

18、，或发现抗体干扰蛋白质蛋白质之间的相互作用时，可以启用IS或GST沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。 两种应用： 1）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用 2）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用,免疫共沉淀：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用,酵母双杂交系统：将编码某一蛋白X的DNA序列与DN

19、A结合域BD的编码序列融合形成一个杂交体，将编码另一蛋白Y的DNA序列与DNA激活域AD的编码序列融合形成另一个杂交体，当两个杂交体共转化酵母细胞（此酵母细胞上游有DNA结合位点的报告基因），若X和Y没有相互作用，则单独不能激活报告基因的转录；若X和Y可相互作用，则使BD和AD靠近形成一个有效的转录激活子，激活报告基因的转录。因此可通过检测报告基因的转录来研究蛋白质X和Y的相互作用。,LacZ,Gal4结合域,Gal4结合域,LacZ,LacZ,Gal4激活域,LacZ,Gal4激活域,Gal4结合域,X,Y,X,Y,双杂交系统的原理,1）已知蛋白之间相互作用的检测：2）蛋白质的功能域研究：通

20、过对其中某一个蛋白质作缺失或定点突变，再用此系统检测是否还存在相互作用，可阐明其功能域或关键氨基酸；3）克隆新基因和新蛋白：将感兴趣的蛋白质基因与BD基因构建成“诱饵”表达质粒，将某一器官或组织的cDNA文库与AD基因构建成“猎物”基因库，共转化酵母细胞，可筛到与感兴趣蛋白质相互作用的蛋白质的cDNA序列，并推测其蛋白质序列。,用途,蛋白质芯片,其制作原理类似于基因芯片，所不同的是，蛋白、多肽芯片所用的样品是提纯的蛋白、多肽。其检测的原理类似于抗原、抗体检测的ELISA法。如采用双抗夹心的形式，可通过机械点涂的方法，将多种不同的单克隆抗体点样固定在固相介质表面，如PVDF膜上，制备成抗体蛋白芯

21、片，与制备的多种抗原样本杂交、结合，芯片上的抗体捕获相应的抗原，然后再与标记的多种不同的抗体杂交，由于抗原具有多价结合表位而结合标记抗体，根据杂交信号的有无、多少而进行定性、定量的分析。,蛋白组学,Proteomics方法可从身体组织或液体如血清、尿或脑脊液中直接测量蛋白质的变化 ,以致于在疾病发生的过程中每一步确切的变化都能被检测出来 ,故其在疾病早期诊断中扮演着非常重要的角色。运用 proteomics方法诊断感染性疾病是在其发展的早期 ,但也体现出诊断的重要性。例如 ,以前精确的诊断慢性乙型肝炎病的感染仍然依赖于肝脏的活组织检测 ,但用proteomic方法分析被检人血清就可显示出慢性乙

22、型肝炎病患者血清中至少有 7种血清蛋白有重要的改变。到目前为止已建立起来的一些临床诊断 proteomics方法 ,在癌症的早期诊断中起到定性的标志 ,例如从尿中检测膀胱癌。,运用 proteomics在诊断传染性疾病时可发现一些新奇的诊断抗原 ,如用其检测人类血清 ,发现幽门螺杆菌的 9种新的潜在的免疫诊断抗原。在莱姆病的博氏疏螺旋体中超过 80种抗原被发现 ,这些抗原可能区分病人的感染是早期还是晚期在鼠弓形体病中发现 7种抗原 ,运用它们能够区分弓形体病的急性和慢性感染。,微流控芯片(microfluidic chip)技术,微流控芯片技术是芯片技术与毛细管电泳联合应用的定量检测技术。它可

23、用于核酸(DNA 和 RNA)、蛋白质及细胞的检测 ,并已产品化。进行微流控芯片检测时 ,应将样品、对照和指示剂系统导入预先已有复杂毛细管道刻蚀的芯片上 ,经过电泳技术 ,利用内对照系统对产物准确定量。该项检测目前已应用于乙型肝炎病毒(HBV)基因分型、HBV 基因某些变异(如 1896c 变异、抗拉米呋定YMDD变异等)研究 、用血安全检测和严重急性呼吸综合征冠状病毒及流感病毒检测等多方面。微流控芯片技术经济耐用 ,还可及时简便地利用菜单为临床提供信息。由于它采用多个单纯 PCR 组合 ,可排除多重 PCR检测时互相干扰而影响检测效率的问题。,分子诊断的发展趋势,应用现有的 DNA分析技术不

24、断地扩大可进行分子诊断的疾病的病种;更突出地加强对疾病发病的分子基础的研究。这不仅表现在 DNA 水平上阐明疾病的分子缺陷 ,而且进一步探索在转录和翻译水平上疾病发生的分子病理学.因此,分子诊断应分为 DNA 诊断和 RNA 诊断两部分。DNA诊断分析静态的基因结构 ,RNA诊断检测动态的基因功能.,AIV的分子诊断技术进展,Steininger和Herrmann试验发现 RTPCR 和巢式 RTPCR的灵敏度高于病毒分离和 ELISA ,可以避免一些错误的阴性结果；Starick 还发现它可以鉴别高低致病力 AIV；Choi 等的试验表明多重 PCR方法可以鉴别流感病毒的亚型，是一个很好的禽

25、流感病毒亚型鉴别检测方法。David Suarez等将 技术与荧光探针检测技术结合后，推出了RRTPCR(realtime，reversetranscription ，polymerase chain reaction，即实时荧光反转录聚合酶链反应)技术，这种可在 3h 内产生诊断结果。不但如此，它的敏感性远远高于普通的 RTPCR。,2005年初，“禽流感 H5、H7、H9 亚型多重RRTPCR 检测试剂盒在深圳研制成功”，这改变了RTPCR一次只能检测一个禽流感亚型成为历史，实现一次同时检测三个禽流感亚型，这在世界上尚属首次。也有人用 PCRRFLP 分析流感病毒，并认为其在流感病毒变异研

26、究中具有重要作用。,依赖核酸序列的扩增/电化学发光检测技术(NASBA/ ECL)NASBA/ ECL (Nucleic acid sequencebasedamplification with electrochemiluminescent detection)是一项通过连续、等温、基于酶反应技术来快速扩增核酸，并利用电化学发光反应进行检测的技术。其可在不同来源序列中检测核酸的特定区域，这项技术特别适用于扩增RNA。与RTPCR比较，它可减少样品中抑制性物质的影响，降低核酸污染的可能性，并大大缩短检测产生结果的时间。在禽流感的检测中 ,NASBA/ ECL 还不管AIV的科系来检测 A 型

27、AIV 的 H5 和 H7 亚型的血凝素基因比例 ,基于母体基因的进一步NASBA 分析能检测 AIV 所有已知亚型(H1 H15) 的样品。NASBA/ ECL 的核酸分离、扩增及检测的全过程在6h内即可完成。,新城疫的分子生物学诊断技术,单克隆抗体技术：用来确定NDV的来源、传播及毒力的强弱等；核酸探针技术：特异性较强：可以区分强、弱毒株和野毒株和疫苗毒株,口蹄疫的分子诊断技术,ELISA：斑点ELISA、生物素亲和素强化斑点ELISA、3ABCELISA 、3D- ELISA 、3ABELISA、液相ELISA、单稀释阻断EL ISA等；在PCR 技术中, 应用于检测FMDV 的有直接P

28、CR、荧光RTPCR、RTPCR、双倍PCR、实时PCR等。PCR 技术不仅可用于检测组织中存在的病毒，还可以用于序列分析，并可以鉴定出病毒的血清型，其特异性和灵敏性均比血清学方法高，而且快速、可重复。电聚焦技术中， FMDV 诱导的肽通常都能聚成清晰的、单一的条带，因此可在单相聚焦时与其他的病毒进行比较。SPA 偶联抗体法、基因工程改造细胞发光法、免疫金标记快速检测试纸法、自我染色复制法、基因芯片和蛋白上清检测系统等。由于控制口蹄疫的关键之一在于早期诊断, 因此探索一种能够大量、快速、高效的检测方法将仍是今后研究的热点。,动物疾病诊断所面临的问题 当猪只感染某种疾病后一般都会出现该种疾病特有

29、的临床症状及病理解剖病灶，但近来猪只感染某些疾病时，常因活毒疫苗的使用或病毒基因的变异等因素出现非典型病例，造成疾病诊断上的困难。另一方面，当一只猪同时感染两种以上的病原或该病转变成慢性病时，此种临床上常见的多种疾病混合感染病例，亦常造成疾病诊断上的困难。目前PCR技术应用在动物疾病的诊断上，比较于病毒分离及其它诊断方法，具有操作简便及诊断快速之优点。但因其敏感度太高，容易产生非特异性反应，所以一般要再将PCR产物进行核酸定序或杂交反应来证实结果。而DNA芯片诊断方法即是将PCR产物再进行核酸杂交，以快速而全面性的筛检病原基因库，如此可以立即而正确的诊断出动物疾病为那一种病原体所感染，还可进一

30、步监定感染病原的亚型或基因型。,畜卫所)与国内生技公司合作，将低密度寡核酸芯片技术平台与PCR或RT-PCR检测技术进行整合，成功地建立猪只病毒性疾病的DNA芯片诊断系统。目前本系统分成3组，一为引发猪只水疱性疾病的整合型生物芯片，主要含口蹄疫病毒 (FMDV) 7种血清型、水疱性口炎病毒 (VSV) 4种血清型、猪水疱病病毒 (SVDV) 及猪水疱疹病毒 (VESV)。二为引发猪只呼吸道综合症 (PRDC) 之5种病毒及6种细菌为主的整合型生物芯片，三为猪瘟病毒 (CSFV)、牛病毒性下痢病毒 (BVDV) 及猪环状病毒 (PCV) 为主的整合型生物芯片，主要针对猪瘟病毒中的LPC疫苗型、本土型、外来型病毒株及近亲病毒BVDV与PCV中的PCV1、PCV2 等病毒株进行区别监定。,