第5章微生物遗传变异课件.ppt

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1、微生物的遗传变异与菌种选育（2）,第五章,5.3 微生物的基因重组,基因重组（遗传传递）：指遗传物质从一个微生物细胞向另一个微生物细胞传递(接触或不接触)而达到基因的改变，形成新遗传型个体的过程。,原核微生物的基因重组噬菌体的基因重组真核微生物的基因重组,1.转化：1928，Griffith2.转导：1951，Lederberg和 Zinder3.接合：1946，Lederberg 和 Tatum4.溶原性转变,一、原核微生物的基因重组,转化：受体细胞直接吸收供体细胞的DNA片段, 并与其染色体同源片段进行遗传物质交换，从而使受体细胞获得新的遗传性状的现象。,转化（transformation

2、）,(2) 转化过程,转化因子进入细胞,转化因子单链配对与整合,复制,分离,转导（transduction）,转导：利用完全或部分缺陷噬菌体为媒介，把供体细胞的小片段DNA携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象。,由转导作用而获得供体细胞部分遗传性状的重组受体细胞称为转导子 （transductant） 携带供体部分遗传物质（DNA片段）的噬菌体称为转导噬菌体。,细菌转导的二种类型：,普遍性转导,特异性转导,1、普遍性转导（generalized transduction）,通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何小片段DNA进行误包，而将其遗传性状传递给受体菌

3、的现象，称普遍性转导。,(1) 意外的发现,1951年，Joshua Lederberg和Norton Zinder为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用，用二株具不同的多重营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌LT22A（P22）和LT2 实验：,用“U”型管进行同样的实验时，在供体和受体细胞不接触的情况下，同样出现原养型细菌！,沙门氏菌LT22A是携带P22噬菌体的溶源性细菌 另一株LT2是非溶源性细菌,一个表面看起来的常规研究却导致一个惊奇和十分重要发现的重要例证！,基因的传递很可能是由可透过“U”型管滤板的P22噬菌体介导的(在接种LT22A的一端出现了原养型),（普遍性转导这一重要的基因

4、转移途径的发现）,沙门氏菌的普遍性转导,进入受体的外源DNA通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子（完全转导）,如果受体菌通过普遍转导获得了供体菌DNA片段后，在其体内不发生基因的交换、整合和复制，只进行转录、翻译和性状的表达。这种转导被称为流产转导.,供体片段,单线传递,2. 特异性转导（specialized transduction） 定义：通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数 特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因 组整合、重组，形成转导子的现象。 媒介： 部分缺陷噬菌体（丢失自身一部分基因，并被 同等长度的宿主基因所取代） 只能转导个别特定基因,大肠杆菌中噬菌体的正常裂解及半

5、乳糖基因转导噬菌体的形成过程,溶原性转变（lysogenic conversion）：,一个与转导相似又不同的现象,定义:温和噬菌体感染细胞后使之发生溶源化，因噬菌体的基因整合到宿主染色体上，而使后者获得了新性状的现象。,溶原性转变与转导的不同？,a）噬菌体不携带任何供体菌的基因；,b）这种噬菌体是完整的，而不是缺陷的；,接合 (conjugation),通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程。,中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致！,为减少所培养的结果是回复突变的机会，采用双重或三重营养缺陷型。该实验是建立在不大可能同时发生两种或三种回复突变的设想

6、上的。,细菌遗传重组单向过程和F因子的提出 F菌株,F菌株,F质粒的四种存在方式及相互关系,F+ + F- 2 F+ F + F- 2 F Hfr + F- 多种情况 Hfr + F- HfrF-（多数情况下;高出几百倍以上 ） Hfr + F- HfrHfr（少数情况下）,接合的结果,起点,接合管,断裂,进入,滚环复制,合成互补链,分开,接合管,染色体DNA,F因子,复制起点，开始复制,1条链进入,复制互补链,重组,易断裂,二、噬菌体的基因重组,烈性噬菌体,噬菌体h+r- h-r+产生的四种子裔噬菌体形成的噬菌斑,透明而小,半透明而大,半透明而小,透明而大,温和性噬菌体：溶原现象。,无速溶性

7、状,寄主范围扩大,寄主范围正常,但具速溶性状,1.有性杂交：指性细胞间的接合和随之发生染色体重组，并产生新遗传型后代的一种方式。2.准性生殖：指不经过减数分裂就能导致基因重组的生殖过程。染色体的交换和减数分裂不规则。菌丝联结：形成异核体：独立生活。核融合(2倍体)：10-5-10-7分离子的产生：有丝分裂过程中染色体会发生交换和单倍体化 。,三、真核微生物的基因重组,5.4.1自然界工业菌种筛选程序5.4.2诱变育种5.4.3杂交育种5.4.4原生质体育种5.4.5基因工程技术用于工业菌种改良,5.4 微生物的菌种选育,一、自然界工业菌种筛选程序,目标菌数量少,问题？具体实例/如何鉴定,1、步

8、骤和方法,原菌株（出发菌株）纯化细胞或孢子悬浮液诱变处理中间培养突变株分离初筛复筛生产性试验,诱变预备实验,活细胞计数,离心收集菌体离心洗涤玻璃珠振荡分散过滤,活细胞计数,物理方法：紫外线、射线、等离子等化学方法：与碱基反应、碱基类似物、移码突变剂复合法：,形态突变：淘汰平皿反应：挑取变异菌株（变色圈、透明圈、生长圈、抑菌圈等）,二、诱变育种,90-99.9%,变异菌株的初步筛选,纸片培养显色法,透明圈法,琼脂块培养法,2.筛选方法,（1）抗药性突变型的筛选,（2）营养缺陷型突变体的筛选什么叫营养缺陷型菌株?？指某些微生物通过诱变处理使其在一些营养物质的合成能力上出现缺陷，不能合成，只能外源提

9、供。,明确几种培养基:基本培养基(MM)完全培养基(CM)补充培养基(SM), 基本培养基：凡是能满足某种野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基，称为基本培养基；常以-表示； 在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素及含氮碱基之类的天然有机物质如蛋白胨、酵母膏等，以满足该微生物的各种营养缺陷型菌株都能生长繁殖的培养基，称为完全培养基，常用+表示； 在基本培养基中只是有针对性地加入某一种或某几种营养缺陷成分，以满足相应的营养缺陷型生长的培养基，称为补充培养基，补充培养基可按所加入营养成分相应地用A、B等来表示。,营养缺陷型菌株筛选步骤,抗生素法:诱变处理液在MM中培养短时,野生型生长活化,缺陷

10、型处于“休眠”,加入抗生素,杀死野生型,保存缺陷型.青霉素、制霉菌素。菌丝过滤法：丝状真菌。野生型孢子萌发菌丝而缺陷型不能，过滤除去菌丝，反复几次，达到浓缩。差别杀菌法：细菌芽孢较营养体耐热。,诱变处理:同一般诱变处理.,淘汰野生型菌株：百分之几至千分子几,检出缺陷型：方法四种,基本培养基含诱变处理后菌液的基本培养基基本培养基,第1次长出的菌落,第2次长出的菌落,夹层培养法,完全培养基（第1次培养后，再倒）,逐个检出法,完全培养基,完全培养基,基本培养基,影印法,限量补充培养法,补充培养基(如0.01%蛋白胨)含菌的基本培养基,确定生长谱,含菌MM,含某生长因子MM,营养缺陷型菌株的应用（p1

11、63-164）,1、分析生长因素（如食品中氨基酸、维生素）；2、遗传标记菌种；3、测定微生物的代谢途径，获得更多代谢产物,三、杂交育种,基因重组是杂交育种的理论基础。前述。,亲本菌株（供体和受体）已知性状；有方向性,四、原生质体育种,将遗传性状不同的两种菌（种内、间、属间）融合为一个新细胞的技术。,五、基因工程技术用于工业菌种改良,基因工程技术：基因操作、基因克隆、DNA重组。是将含目的基因DNA片段经体外操作与载体连接，转入一个受体细胞并使之扩增、表达的过程。,目的基因载体选择体外重组导入细胞筛选鉴定,分离、合成、逆转为cDNA、PCR扩增等,质粒、噬菌体、病毒,工具酶、连接酶,原核细胞（转

12、化、感染等）；真核细胞（微量注射法、电穿孔法、基因枪法等）,抗性等,5.4 微生物菌种的退化、复壮与保藏,性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。,影响微生物菌种稳定性的因素：,a）变异,b）污染,c）死亡,一、菌种退化与复壮,（一）菌种退化现象,1.概念：菌株生产性状的劣化或遗传标记的丢失。,2.退化的表现,1）原有形态形状变得不典型；2）生长速度变慢；3）代谢产物生产能力下降；4）致病菌对宿主侵袭力下降；5）对外界不良环境的抵抗力下降。,（二）菌种退化原因,1）根本原因在于基因自发突变；2）传代次数影响,使负突变株的比例逐渐占优势3）与培养条件有关。,退

13、化是发生在微生物细胞群体中的一个由量变到质变的逐步演变的过程。,1.合理的育种;2.选用合适的培养基;3.创造良好的培养条件4.控制传代次数5.用不同类型的细胞进行接种传代6.采用有效的菌种保藏方法,（三）菌种退化的防治(p172),（四）、菌种的复壮,1. 衰退群体少数个体（未退化），重新获得具有 原有典型性状的菌种(狭义复壮，消极措施)。,2. 有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种 维护工作中不断筛选“正变”个体(广义复壮，积极措施) 。,a）纯种分离;（有哪些方法？见下一页）,b）通过寄主进行复壮；,纯种的分离方法 平板划线分离法 菌落纯 平板涂布分离法 平板倾注分离法

14、用“分离小室”进行单细胞分离 细胞纯 显微操纵器进行单细胞分离 菌丝尖端切割法进行单细胞分离,二、菌种的保藏,在一定时间内使菌种不死、不变、不乱、不污染,基本要求：,基本原理：,创造一个微生物代谢不活动、生长受抑制（休眠）环境条件（干燥、低温、真空、缺营养、添加保护剂、酸度中和剂）,基本方法：,生活态休眠态,培养基传代培养,寄主传代培养,冷冻,干燥,斜面、平板,液氮、低温冰箱,沙土管、冷冻真空干燥,菌种保藏机构,ATCC采用的菌种保藏法：（ American Type Culture Collection ，美国典型菌种保藏中心） 冷冻干燥保藏法 液氮保藏法CCCCM采用的菌种保藏法： （ China Committee for Culture Collections of Microorganism，中国微生物菌种保藏委员会） 斜面传代法 冷冻干燥保藏法 液氮保藏法,由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜。因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。,复习思考题,