微生物限度检查法操作规程课件.ppt

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1、微生物限度检查法操作规程 质量检测中心 张廷滔,定义,微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。,本检查法中细菌及控制菌培养温度为 3035；霉菌、酵母菌培养温度为 2328。 检验结果以1g、1ml、10g、10ml、10cm2为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。,检查环境微生物限度检查环境在洁净度C级下的局部洁净度B级的单向流空气区域内进行。,微生物限度检查室,要求温度：1826；相对湿度：4565；压差：洁净室与外界压差30Pa,培养基营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基胆盐乳糖培养基、4-甲基伞形酮葡

2、糖苷酸培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基、营养肉汤培养基、四硫磺酸钠亮绿培养基、胆盐硫乳琼脂培养基,稀释液和冲洗液 0.1%蛋白胨水溶液 pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 0.9%氯化钠溶液,供试品的保存,供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，勿冷藏或冷冻，以防供试品内污染菌因保存条件不妥引起致死或繁殖。供试品在检验之前，应保持原包装状态，严禁开启。包装已开启的样品不得作为供试品。,实验前的准备,以头孢氨苄胶囊为例1.在洁净室使用记录上登记好头孢氨苄胶囊的规格、批号；准备一张微生物限度检查空白记录，填好除检验结果以及温湿度外的其他必要信息。,2.准备好相应的检查用品：营养琼脂培养基和玫瑰红纳琼脂培养基

3、各1瓶融化后，放入烤箱中待用100mlpH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 1瓶 9ml/管的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液4支0.1%蛋白胨水溶液（500ml瓶） 滤杯沉降菌平皿空白平皿-吸管、镊子、剪刀等放入不锈钢盒中经干热灭菌后待用,3.配置消毒液0.1%洁尔灭溶液75%乙醇,传递窗,物料,微生物限度检查室,注：进入无菌检验室的样品若有两层包装的，需将外包装在传递窗或缓冲间拆除后，经传递窗传入实验室。,4.将待检样品以及的相关用品（包括培养基、缓冲液以及检测用器皿等），经传递窗紫外消毒60分钟后，再转运至微生物限度检查室。,5.按空调机组上的F2”键，开启空调；通过物流通道处的按钮，开启净化工

4、作台。,化验人员按照进出微生物检测室更衣操作规程进行正确的更衣。,进入更鞋室更鞋脱去工作服及私人衣物（只剩贴身内衣、内裤）挂在衣钩上并将所有头发塞入发网中固定洗手用手肘开门进入一更。然后取GEL溶液23ml，采用六步法对双手和手腕进行消毒（在30秒内保持双手完全被GEL覆盖）用手肘开门进入C级二更（黄色地面）。,在二更更鞋，然后戴上绸帽，绸帽应包裹住全部头发；再戴上口罩，口罩必须覆盖嘴、鼻，在脑后勒紧；最后穿洁净区连体工作服，依次将左脚、右脚、左手、右手穿入（过程中应避免碰触洁净衣外表面，同时洁净衣也不得接触地面或墙面）检查自己的着装用手肘开门进入C级缓冲间。在C级缓冲间，用手肘开门分别进入C

5、级微生物限度检查室一和检查室二，带上无菌手套，再在消毒液中浸泡约30秒。,化验人员用浸泡了消毒液的无菌毛巾，擦拭净化工作台台面。打开传递窗，将相关的检查用品依次摆放在不锈钢桌上和净化工作台上。（镊子和剪刀应插入75%酒精棉球中）,准备7个沉降菌平皿，做好标记和日期在净化工作台上和检查室地面上摆放好沉降菌平皿。用消毒液清洗浸泡双手，将消毒毛巾贴好，放在净化工作台台面上。,供试液的制备原则,常用的供试品制备方法,液体供试品取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1：10的供试液。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。固体、半固体或粘稠液供试品称取供试品

6、10g，加pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1：10供试液。有必要时可适当加温（不应超过45）。,供试液的制备 取10g头孢氨苄胶囊于磨口瓶中，用无菌剪刀将其剪碎，加入100mlpH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液混匀，作为1：10供试液。静止得上清液备用。,在供试液静止沉淀的同时准备8个无菌平皿，每2皿为一组，分别在每组的2个平皿盖上分别依次注明“0（空白）,10-1, 10-2, 10-3”。准备3瓶胆盐乳糖培养基，分别在瓶上注明”1-/2,1+/2, 0/2,其中2标示当月2号，1表示当天所做的第一个样品、+：表示样品阳性，-：表示样品、0：表

7、示阴性对照。,细菌和控制菌检查,薄膜过滤法制备平皿准备2个无菌平皿，倾注营养琼脂培养基约15-20ml，半盖盖，除出去冷凝水后，盖上平皿盖待凝。,火焰喷射器在检验仪的过滤头表面灭菌35秒钟。镊子在火焰上灭菌并冷却，夹住3张无菌滤膜放置在3个过滤头中央。将已经过灭菌的过滤杯小心安装在过滤头上。从过滤杯的上边缘按下过滤杯卡在过滤头上。,预润滤膜将事先插在75%酒精棉球中的剪刀过火焰数次后，撬去冲洗液瓶子的铝塑盖和胶塞，将瓶口和瓶颈部位过火焰数次。向3个过滤杯中，分别加入少量的0.1%无菌蛋白胨水溶液，顺时针旋转阀门手柄90度，打开过滤头对应阀门。按下检验仪的启停开关启动仪器过滤。,过滤样品分别取1

8、0ml上清液（取相当于1g供试品），分别加入3个滤杯中过滤或先将10ml上清液加入100ml0.1%无菌蛋白胨水中混匀，再过滤。冲洗用800ml0.1%无菌蛋白胨水分次冲洗过滤，每次约100ml，总冲洗量不得超过1000ml。,每次冲洗时冲洗液瓶的瓶口和瓶颈部位应过火焰数次，在过滤前后，应保持滤膜的完整性。,样品过滤完后，逆时针旋转阀门手柄90度，关闭过滤头对应阀门，然后按启停开关停止仪器。镊子在火焰上灭菌并冷却取出第一张滤膜，菌面朝上贴于制备好的培养基平板上。（滤膜贴于平板上时不得有空隙或气泡，否则影响微生物生长）。,镊子再次火焰上灭菌并冷却分别取出第二张和第三张滤膜，快速接至100ml胆盐

9、乳糖培养基中，分别做为样品和样品阳性。取10mlpH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液加入100ml胆盐乳糖培养基中作为阴性对照。,再用火焰喷射器在灭菌检验仪的过滤头镊子在火焰上灭菌并冷却，夹住1张无菌滤膜放置在1个过滤头中央。安装过滤杯用少量的0.1%无菌蛋白胨水溶液冲洗滤膜，过滤。取出滤膜，贴于培养基平板上做为阴性对照。,酵母菌和霉菌的检查平皿法,样品的稀释,每递增l稀释级，必须另换一支吸管。稀释时，吸管插入第1级稀释液内不低于液面2.5cm，反复吸吹约10次。吸液时，应先吸至高于吸管上部刻度少许，然后提起吸管，贴于试管内壁调整液量至刻度，吸管移至第2级稀释管的内壁近液面处（勿接触液面）缓慢地放

10、出全部供试液（吸管内应无黏附或残留液体）,在上述进行10倍递增稀释的同时，以该稀释级吸管，吸取该级稀释液各1ml至2个灭菌平皿中，（一般为左手持平皿，将盖半开，右手持吸管），注入平皿时，将1ml供试液慢慢全部注入平皿中，管内无残留液体，防止反流到吸管尖端部。,阴性对照 待各级稀释液注皿完毕后，用1支吸管吸取试验用稀释剂（pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液）各1ml，分别注入2个平皿中,倾注培养基,注：混匀时切勿将培养基溅到皿边及皿盖上,培养,将冷凝后的平板用保鲜膜包裹好，注明检查日期。倒置培养，细菌平板于3035培养箱中培养3天。霉菌、酵母菌计数平板于2328培养箱中培养5天。逐日观察菌落生长情况，

11、点计菌落数。,完成微生物限度检查后，将待培养的样品、废弃物等通过传递窗传出。检查人员对洁净室进行清洁。,细菌数选取平均菌落数在30300之间的稀释级。霉菌、酵母菌数先取平均菌落数在30100之间的稀释级。 因为超过300有凝聚作用，易计数偏低，且不易点计，低于30细菌分布不是正态分布，不能代表其正常计数，且数量减少，误差增大。,菌落报告原则,菌落计数,一般将平皿置菌落计数器或从平皿的背面直接以肉眼点计，以透射光衬以暗色背景，仔细观察。勿漏计细小的琼脂层内和平皿边缘生长的菌落。注意细菌菌落与霉菌菌落和酵母菌菌落以及它们与供试品颗粒、培养基沉淀物、气泡等的区别。必要时用放大镜或用低倍显微镜直接观察

12、或挑取可疑物涂片镜检。如仍难区别，可延长培养时间47天，细菌菌落常会生长增大而加以区别。,菌落计数,若平板上有2个或2个以上菌落重叠，肉眼可辨别时仍以2个菌落或2个以上菌落计数；若平板生长有链状菌落，菌落间无明显界限，一条链作为一个菌落计，但若链上出现性状与链状菌落不同的可辨菌落时，仍应分别计数，若生长蔓延较大的片状菌落或花斑样菌落，一般不宜作为计数用。,菌落报告原则,如只有1个稀释级平均菌落数在30300（30-100）之间，则将该稀释级的菌落乘以稀释倍数报告。稀释 菌落数 平均值 报告10 1 280 260 270 27010270010 2 29 28 10 3 3 2,当有2个或2个

13、以上稀释级的菌落数符合上述规定时，以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告。,如各稀释级平均菌落数均在30以下，则按最低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告。稀释 菌落数 平均值 报告10 1 10 12 11 1110 11010 2 2 3 10 3 1 3如各稀释级的平均菌落数均无菌落生长或最低稀释级平均落数小于1小时，应报告菌数为1稀释倍数个/g或ml。,结果报告 菌落数在100以内时，按实有数报告。 菌落数大于100时，取两位有效数字报告，第三位按数值修约规则处理。 复试 供试品细菌数、霉菌数及酵母菌数其中任一项一次检验不合格，应重新取2倍包装量供试品，依法作单项复试两份，以三次检验结果的

14、平均值报告。,异常情况处理,菌落蔓延1.加TTC（1000ml营养琼脂加1的TTC(2、3、5氯化三苯四氮唑琼脂 )1ml )2.开盖干燥（将已凝固的营养琼脂平板开盖，倒置倾放于净化工作台上，开机1-2h合盖，在倒置于培养箱内）异常菌落数报告法 细菌平皿上长霉菌、霉菌平皿上长细菌，哪个多，以哪个计数，不能相加计数。,注意事项1供试品检验全过程必须符合无菌技术要求。使用灭菌用具时，不能接触可能污染的任何器物，灭菌吸管不得用口吹吸。2从供试品稀释至倾注琼脂培养基操作应在1小时内完成，避免由于时间过长导致菌细胞繁殖或死亡。3供试液稀释及注皿应取均匀的供试液，以免造成实验误差。4在净化工作台上操作时，应避免双手来回出入工作台,