血红蛋白的提取和分离课件.ppt
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1、课题3 血红蛋白的提取和分离,专题5 DNA和蛋白质技术,思考1 分离生物大分子的基本思路是什么?,选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。,思考2 蛋白质的分离和提取的原理是什么?,根据蛋白质各种特性的差异,如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等,可以用来分离不同蛋白质。,一、基础知识:, 凝胶色谱法(分配色谱法):,1、凝胶:,一些微小多孔的球体(内含许多贯穿的通道,由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖,具多孔的凝胶就叫分子筛),2、概念:根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小,利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,来进行分离
2、。,3、原理:当不同的蛋白质通过凝胶时,相对( )的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程( ),移动速度( ),而( )的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在( )移动,路程( ),移动速度( ),相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。,4、具体过程,相对分子质量较小,较长,较慢,相对分子质量较大,凝胶外部,较短,较快,凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示,凝胶色谱法分离蛋白质的原理,1、概念:在一定的范围内,能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用,具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。, 缓冲溶液:,2、作用: 能够抵制( )的对溶液的( )的影响,维持PH基本
3、不变。,外界的酸或碱,PH值,3、缓冲溶液的配制,通常由( )种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的( )就可以制得( )使用的缓冲液。,12,使用比例,在不同PH范围内,思考:说出人体血液中缓冲液。,NaH2PO4 / Na2HPO4,H2CO3 / NaHCO3,在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是磷酸缓冲液,目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境,保证血红蛋白的正常结构和功能,便于观察(红色)和材料的科学研究(活性),2、原理:许多重要的生物大分子,如( )等都具有( ) 在( )下,这些基团会带上( ) 。在电场的作用下,这些带电分子会向着与其( ) 移动。电泳利用了待分离样品中各种分子
4、( )以及分子本身( )、( )的不同使带电分子产生不同的( ),从而实现样品中各种分子的分离。,多肽、核酸,可解离的基团,正电或负电,所带电荷相反的电极,带电性质的差异,大小,形状,迁移速度,一定的PH,分类:P66,琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。,测定( )通常用十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙稀酰胺凝胶电泳,蛋白质相对分子质量,电泳检测结果,思考 人们用鸡的红细胞提取DNA,用人 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么?,鸡的红细胞具有细胞核,含有DNA,便于进行DNA的提取,人的红细胞无细胞核,结构简单,血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。,样品处理粗分离纯化纯度鉴定,蛋白质的提取和分离一般
5、分为四步:,二 实验操作,1.样品,血液,血浆,水分,固体物质,血浆蛋白,无机盐磷脂葡萄糖等,血细胞,白细胞,血小板,红细胞(最多),血红蛋白( ),两个a肽链,两个一肽链,共四条肽链,90,每条肽链环绕一个亚铁血红素基团,可携带一分子氧或一分子二氧化碳。血红蛋白因含血红素而呈现红色。,2. 血液有哪些成分?,1. 用鸡的红细胞提取DNA,用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么?,鸡的红细胞具有细胞核,含有DNA,便于进行DNA的提取;人的红细胞无细胞核,结构简单,血红蛋白含量丰富,便于提取血红蛋白。,二、实验操作,二、实验操作,(1)红细胞的洗涤:,洗涤目的:,去除杂蛋白,以利于后续血红
6、蛋白的分离纯化。,洗涤操作:,1、采集血样。注意要加入柠檬酸钠防止血液凝固。 2、低速短时间离心(速度越高和时间越长,会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀,达不到分离的效果)3、吸取血浆:上层透明的黄色血浆。4、盐水洗涤:用五倍体积的质量分数为0.9的氯化钠溶液洗涤。5、低速离心(低速短时间)6、重复三次,直至上清液中已没有黄色,表明洗涤干净。,(一)样品处理,红细胞的洗涤,(:,2)血红蛋白的释放 加蒸馏水到原血液体积,再加40体积的甲苯 ,置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟(加速细胞破裂),细胞破裂释放出血红蛋白。,(3)分离血红蛋白溶液:,过程:将搅拌好混合液转移到离心管内,以 2000r/mi
7、n的速度离心10 min。试管中溶液层次:第1层(最上层):甲苯层(无色 透明);第2层(中上层):脂溶性物质沉淀层(白 色薄层固体);第3层(中下层):血红蛋白的水溶 液层(红色透明液体);第4层(最下层):杂质沉 淀层(暗红色)。分离:用滤纸过滤,除去脂溶性沉淀层,于分液漏 斗中静置片刻后,分出下层的红色透明液体。,二、实验操作,分离血红蛋白溶液,有机溶剂 无色透明的甲苯层,脂类物质 白色薄层固体(脂溶性物质沉淀层),血红蛋白溶液 红色透明液体,红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物,(二)、血红蛋白的粗分离-透析:,过程:取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中,将透 析袋放入盛有300ml的物质的量
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