男性不育与辅助生殖技术演示ppt课件.ppt

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1、男性不育与辅助生殖技术,“百米冲刺”,男性不育定义,WHO规定：夫妇未采用任何避孕措施性生活1年以上，由于男方因素造成女方不孕者，称为男性不育男性不育症不是一种独立的疾病，而是由某一种或很多疾病与因素造成的结果,男性不育的概况,10-15%生育年龄的夫妇有不育症 男性不育占不育原因的 40% 我国男性的精液质量呈下降趋势，正以1的速度下降 在工业化程度越高的地区，精子质量降低越明显 无精症占男性不育症的 7-13% 有7-11%的无精症患者有染色体异常,男性不育的病因,睾丸前因素睾丸性因素睾丸后因素,男性不育的诊断 病史,全面了解家族遗传史、婚育史、性生活史、过敏史、手术外伤史和其他对生育可能

2、造成影响的因素，还要简要了解女方病史，记录患者的个人信息既往史：重点了解与生育相关的疾病和因素，主要包括腮腺炎、睾丸炎、发烧、附睾炎以及手术外伤史，内分泌史、性功能、用药史、生活习惯。环境与职业因素等,男性不育的诊断 体格检查,全身检查：重点注意第二性征的情况，体型、皮肤、喉结、毛发分布等生殖器官的检查：阴茎、睾丸、附睾、输精管、精索直肠指诊：前列腺、精囊,男性不育症实验诊断基础,1.男性不育症实验诊断概况,男性不育症的实验诊断方法过去长期停留在较低水平，不育症病因临床诊断困难。WHO制定了多项男性不育实验和临床诊断技术规范。正确认识辅助生殖技术（ART）的作用和适用范围。,男性不育症诊疗基本

3、程序（WHO）： 不育男性 病因学诊断 治疗或偿试治疗 男科学 考虑ART助孕 选择最适ART助孕方式 辅助生殖技术,男性不育症现代实验诊断技术 精液计算机辅助分析 精子功能检测 精液免疫生化检验 细胞遗传学检查 分子生物学 尤以精液免疫生化检验发展得最快,具有十分重要的诊断价值。,精液常规参考值（WHO Laboratory Manual, CUP, 4th edn,1999）,量 2 ml， 15%*活率 75%活精(除外伊红染精）白细胞数 1 106/ ml免疫珠试验 50%活精与免疫珠粘附混合抗免疫蛋白试验 50%活精有粘附颗粒,* 精子正常形态 15%, 体外受精率下降.,精液异常的

4、定义（WHO Laboratory Manual, CUP, 4th edn,1999）,少精症 (Oligozoospermia)精子密度 20 106/ ml弱精症 (Asthenozoospermia) 50%向前运动(a+b)或 25%快速向前运动(a)畸形精症 正常形态精子 30% 少弱畸精症 (Oligoasthenteratospermia)以上三个或二个变量异常无精症(Azoospermia) 射出精液中(包括离心)无精子隐匿精子症不射精(Aspermia)逆行射精,生精功能评价指标： 血激素：FSH、LH、 T、PRL、E2 血清抑制素B 生殖细胞凋亡 染色体及无精子候 选基

5、因,常用血激素,FSH特性：垂体前叶分泌；不是总能准确预测生精功能状态； 一般 地，血FSH水平与精原细胞的数量紧密相关,精原细胞缺乏或明显减少时,血FSH常常会升高.当精原细胞数量正常,但出现精母细胞或精子细胞完全性生精阻滞时,血FSH一般在正常范围。,血激素检测注意事项: FSH浓度水平相对稳定可靠; LH、T、PRL浓度均易产生生理波动； 应注意对抽血时间的有序把握，及注意对抽血前影响因素的控制。,精液在生殖管道中运输检测指标,附睾分泌功能指标-精浆中性葡糖苷酶,Seminal plasma neutral alpha- glucosidase WHO推荐检测方法：Cooper法（PNP

6、G法）临床意义： 附睾分泌功能的指标。中性-葡糖苷酶较左 旋肉毒碱和甘油磷酸胆碱对附睾更特异更灵 敏。 结合精浆果糖、激素和睾丸其他指标,对远端 输精管阻塞有较好的诊断价值。,精囊分泌功能指标-精浆果糖,Seminal plasma fructose WHO推荐检测方法：吲哚法或酶法 临床意义： 精囊分泌的果糖是精子能量的主要来源。先天性精囊缺如果糖测定为阴性。精囊炎时，果糖含量降低。不完全射精或射精过频，果糖含量亦降低。用于鉴别单纯性输精管阻塞所致的无精症（果糖含量正常）和输精管、精囊发育不良引起的无精症。,前列腺分泌功能指标（WHO推荐） 精浆柠檬酸定量（酶法） （Seminal plas

7、ma citric acid ） 精浆酸性磷酸酶定量（PNPP法） （Seminal plasma acid phosphatase ） 精浆锌定量（5-Br-PAPS法）（Seminal plasma zinc ）,静止性生殖道感染性检测,精液白细胞过氧化物酶染色（Leukocyte Peroxidase）精液白细胞群组化酶免定量（Leukocyte Subpopulations ）精浆粒细胞弹性硬蛋白酶定量（PMN-elastase）,精液圆细胞(rouud cell)： 生殖道上皮细胞、生精细胞和白细胞统称之。正常精液： 圆细胞数5106/ml; 白细胞数1106/ml。,抗精子抗体 a

8、nti-sperm antibody 血清AsAb检测指标的局限性 a) 男性特有的血睾屏障对精子施行封闭式保护; b) 精子抗原的复杂性给诊断试剂的制备带来困难. 精子膜表面抗体（包被抗体）检测的意义 避免精子膜内抗原释放, 反应具特异性; 检测活力精子, 更具临床意义., 精子膜表面抗体检测的方法(WHO推荐） 混合凝集反应（mixedagglutination reaction, MAR） 特点：免疫性不育过筛试验，检测IgG型抗体。 免疫珠试验 (immunobead test, IBT) 特点：特异性较MAR更高,可进行IgG、IgA、IgM 抗体分型。,MAR、IBT结果观察,男性

9、免疫性不育的确诊 a) MAR与IBT试验结果并非经常一致。 b) 男性免疫性不育的确证需要在MAR或IBT阳性基 础上附加其他试验，附加试验可以是前者的重复 试验、精子-宫颈粘液接触试验、精子-宫颈粘液 毛细管试验。 c) MAR: 10%为可疑，50%有确定临床意义。 I BT: 20%为可疑, 50%有确定临床意义。,性交后试验,意义禁欲至少两天 准确推算排卵期 前一天夜间同房，禁用润滑剂，性交后不能行阴道冲洗及盆浴 924小时取精,精子低渗膨胀试验(HOS),Sperm Hypo-Osmotic, HOS临床意义: WHO不主张将HOS作为精子功能试验予以应用. 是一种检查精子存活力的

10、补充试验方法. 有研究表明：HOS与去透明带地鼠卵穿透试验 之间有较好的符合率,对继发性不育者更有价值.,精子顶体酶 acrosin,临床意义 : 顶体酶是受精过程中不可缺少的蛋白水解酶。顶体酶活性可反映精子质量，顶体酶活力不足可导致不育。 临床精子成活率低、死精子症以及严重生殖系统感染，特别是溶脲支原体严重感染时可造成精子顶体酶活性降低。 顶体酶活性是判断男性精子功能和生育力强弱的重要评价指标。,检测方法： Kennedy法（BAPNA法）： 精氨酸酰胺酶 BAPNA 硝酰基苯胺 （BAPNA： N-苯甲酰-DL-精胺酸-硝酰基苯胺 ） 不足之处： 反应时间过长（3小时） BAEE（苯甲酰精

11、氨酸乙酯）法：,精子顶体酶活性检测标本留取； 顶体酶检测标本：原精液与洗涤后精子。 精子顶体酶活性检测常见实验检测错误。,精子悬液活性氧类物质(ROS) reactive oxygen species, ROS,临床意义：活性氧类是氧的代谢产物，包括超氧阴离子、过氧化氢、氢氧根、过氧化氢和一氧化氮。过量存在可诱发细胞脂质、蛋白质和DNA的氧化损伤而造成病理性损伤。许多细胞具有酶性抗氧化剂系统（超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶）或非酶性抗氧化剂系统（尿酸、维生素C、维生素E）。当这些防御机制受制时，细胞功能将受到影响。,精子形态学染色SpermMorphology Staining

12、,吉姆萨染色-评价不同类型白细胞比评价精子更好(改良)巴氏染色-经典方法肖尔(Shorr)染色-常规精子形态分析勃-利二氏(Bryan-Leishman)染色-适用于鉴定未成 熟生殖细胞和未成熟生殖细胞与白细胞的鉴别Diff-Quik染色-精子形态学分析,精子形态学染色（Diff-Quik）,2022/12/9,39,可编辑,精子形态学计算举例：计数的精子数： 200正常精子数： 78正常精子百分比：（78/200100%） 39% 缺陷精子数：（200-78） 122（61%） 头部缺陷精子数： 110（55%） 中段缺陷精子数： 18（9%） 尾部缺陷精子数： 16（8%） 缺陷总数：（1

13、10+18+16） 144畸形精子指数(TZI) = (缺陷总数/ 缺陷精子数) = 144/122=1.18精子畸形指数(SDI) = (缺陷总数/所数精子总数) = 144/200=0.72,当精子畸形率70%或畸形精子指数(TZI) 1.6时，可引起生育障碍，导致不育症。来自辅助生殖技术项目的资料表明，使用本方法所描述的分类方法，如果正常形态的精子数低于15%或精子畸形指数(SDI) 1.6时，体外受精率降低。正常精子形态14% (Kruge & Menkfeld标准),计算机辅助精子分析 Computer aided of semen analysis，CASA,CASA较人工方法具有

14、以下优点： 高精确性； 提供精子动力学的量化数据。根据识别精子原理分类,CASA分为: 灰度识别 荧光识别 比色识别 (880nm),灰度CASA的特点:精子活力分级: a级: 快速前向运动 (VAP26m/s) b级: 中速前向运动 (16VAP26m/s) c级: 慢速前向运动 (6VAP16m/s) d级: 极慢或不动 (0VAP6m/s) 灰度CASA无法检测出“精子成活率”，需进一步作活体染色（如：HOS，伊红染色） 同一精液标本a+b+c值低于实际“精子成活率”。,灰度CASA的特点:精子识别: 根据成像灰度识别精子,易将精液杂质误识别为精子,需要人工干预帮助识别。,CASA临床应

15、用存在的普遍性问题： 在精液未经其他技术处理状态下报告精液白 细胞数量； 在精液未经其他技术处理状态下报告精子形 态学； 精子密度计数重复性差； 精子活力计数重复性差； 同一实验室不同技术人员检测结果差异较大； 不同实验室间检测结果无可比性。,3. 精子功能评价指标,与精子功能相关的实验检测项目：标准化的精液分析（包括CASA 活动力与速度）精子膜完整性（HOS,LDH-X）；精子核蛋白成熟度(苯胺蓝染色)/DNA受损度(吖啶橙染色)；精子抗体（免疫珠试验）精子-宫颈粘液相互作用：体内试验（性交后试验) 体外试验（毛细管试验）顶体酶和诱发顶体反应精子-卵母细胞相互作用,诱发顶体反应Induce

16、d acrosome reaction,WHO推荐方法：钙离子载体法 精子体外获能后，通过钙离子载体启动顶体反应，用于评价 精子发生顶体反应的能力。 几种凝集素在AR前后精子的结合位点：,睾丸活检术,睾丸切开活检术（testicular open biopsy） 睾丸穿刺活检（testicular puncturation biopsy ）睾丸细针抽吸活检（fine needle aspiration biopsy,FNA）睾丸活检意义的变迁（由一种诊断方法演变成治疗手段）,睾丸钳穿活检术,正常生精功能,成熟精子,支持细胞,精母细胞,Part 3,生精功能低下（同一病人）,减少,缺如,Part

17、 3,生精功能缺如,（47，XXY),睾丸间质纤维化，透明样变,Part 3,供精人工授精(AID) 适应症：精液质量低下：无精子症、严重少弱精症、畸形精子症优生目的：男方和/或家族有不宜生育的严重遗传病、智力低下、精神病、近亲婚配、肿瘤患者经过化疗或放射治疗后特殊情况：截瘫、不射精、逆行射精治疗失败母儿血型不合不能得到存活新生儿,男性不育的辅助生育治疗,男性不育的辅助生育治疗,宫腔内人工授精(AIH)适应症： 男性因少精、弱精、液化异常、性功能障碍、生殖器畸形等不育宫颈因素生殖器道畸形及心理因素导致性交不能等不育免疫性不育 原因不明不育,男性不育的辅助生育治疗,单精子卵浆内注射术(ICSI)

18、 适应症：严重男性不育：少精、弱精、畸形精症，无精症（睾丸活检有成熟精子） 常规试管婴儿受精失败，或受精率极低,a)sperm concentration 精子浓度 2 x 106b)sperm motility 精子活率 5 %c)strict criteria normal morphology 严格标准的精子正常形态 4 %d)use of surgically retrieved spermatozoa 使用通过外科手术获得的精子e)failure of fertilization in a previous IVF cycle 前一个常规IVF受精失败,Cornell Univers

19、ity ICSI适应症,ICSI 适应症 本中心,严重少、弱畸精症：3次检查内至少有2次以上精液常规检查符合以下任一标准者：一次射精的活精子浓度20106/ ml，按严格标准进行精子形态学检查，形态正常精子10% 或a+b级精子活动率10% 精液处理后活精浓度1106/ ml，a+b级运动精子50% 梗阻性无精症或生精功能障碍，附睾或睾丸活检有成熟精子者 重度畸精症：精子正常形态数4冷冻后的少弱精2次以上不明原因IVF-ET受精失败或受精率低于30% 精子无顶体或顶体功能异常 （诱导顶体反应率5）IVM周期 PGD周期,外科取精方法,显微附睾精子抽吸术Microsurgical Epididy

20、mal Sperm Aspiration (MESA)经皮附睾精子抽吸术 Percutaneous Epididymal Sperm Aspiration（PESA)睾丸精子抽吸术 Testicular Sperm Aspiration (TESA)睾丸穿刺取精术Testicular Puncturation Biopsy 睾丸精子抽提术 Testicular Sperm Extraction (TESE)睾丸显微切开活检取精术(Micro-TESE),显微附睾精子抽吸术Microsurgical Epididymal Sperm Aspiration (MESA),经皮附睾精子抽吸术Perc

21、utaneous Epididymal Sperm Aspiration (PESA),睾丸精子抽吸术Testicular Sperm Aspiration (TESA),睾丸精子抽提术Testicular Sperm Extraction (TESE),睾丸钳穿取精术,经皮附睾精子抽吸术 (percutaneous epididymal sperm aspiration,PESA)睾丸精子抽吸术 (testicular sperm aspiration,TESA) 睾丸穿刺取精术(testicular puncturation biopsy) 睾丸精子抽提术 （Testicular Sper

22、m Extraction ,TESE) 成功率高 创伤小 并发症少 简单易行 可反复多次取精,ICSI procedures,ICSI出生后代追踪,2840个ICSI小孩和2955个IVF小孩，先天性畸形率分别为4.2%和4.6% (BonduelleM, 2002) ICSI后出生的9781个孩子与自然受孕出生孩子相比, 先天性畸形的发生率无明显上升 (Van Steirteghem A, 2002),性染色体非整倍体率和常染色体结构异常率明显 升高（0.6% vs 0.2%, 0.4% vs 0.07% ) (Van Steirteghem A, 2002)ICSI和IVF的婴儿缺陷发生率

23、是自然受孕婴儿的2 倍( 8.6%和9.0% vs 4.2%)。 (Hasen, et al. 2002),ICSI的安全性,没有足够的动物实验评估安全性随意选择一条精子注入卵浆中，跨越了自然受精的步骤传播导致男性不育的遗传缺陷,ICSI操作本身有关的危险,对卵浆或分裂的纺锤体的物理和/或生化的干扰,导致早期分裂的错误, 产生非整倍体胚胎 注入生化污染物，(PVP, 微生物等)注入与精子有关的外源性DNA,不能滥用ICSI技术,轻微精液异常的不育患者ICSI可能对后代的影响及危险性对不育患者没有明显好处时,降级原则(down grade)（WHO男子不育标准化手册）,首先选择损伤小的方法和技术，其次选择复杂、昂贵、损伤性的方法自然生育 IUI (不限次数） IVF ICSI降低子代治疗风险降低夫妇及社会治疗成本利于人类发展原则,2022/12/9,78,可编辑,