生化蛋白质结构及功能课件.ppt

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1、Biochemistry,查锡良主编，人民卫生出版社，第八版，2013年出版,生 物 化 学,生物化学与分子生物学教研室 黄勇奇,生物化学：biochemistry,是研究生物体内化学分子与化学反应的基础生命科学，从分子水平探讨生命现象的本质。主要研究生物体内分子结构与功能，物质代谢与调节以及遗传信息传递的分子基础与调控规律。,绪 论,第一节 生物化学的发展简史第二节 当代生物化学研究的主要内容第三节 生物化学与医学,生物化学的发展简史： 一、叙述生物化学阶段（18世纪中到19世纪末） 二、动态生物化学阶段（20世纪初） 三、分子生物学时期（20世纪后半叶以来）,生物化学的发展简史： 一、叙述

2、生物化学阶段（18世纪中到19世纪末） 二、动态生物化学阶段（20世纪初） 三、分子生物学时期（20世纪后半叶以来）,萌芽阶段，其主要的工作是分析和研究生物体的组成成分以及生物体的分泌物和排泄物 。,生物化学的发展简史： 一、叙述生物化学阶段（18世纪中到19世纪末） 二、动态生物化学阶段（20世纪初） 三、分子生物学时期（20世纪后半叶以来）,蓬勃发展的时期，基本上弄清了生物体内各种主要化学物质的代谢途径。,生物化学的发展简史： 一、叙述生物化学阶段（18世纪中到19世纪末） 二、动态生物化学阶段（20世纪初） 三、分子生物学时期（20世纪后半叶以来）,这一阶段的主要研究工作就是探讨各种生物

3、大分子的结构与其功能之间的关系。,生物化学的主要内容：,一、生物大分子结构与功能,二、物质代谢与其调节,三、遗传信息传递与调控,四、专题篇（临床生化与分子生物学）,生物化学与临床：,一、生物化学是临床课程的重要基础（相互联系）,二、生化检测为临床诊断提供信息依据,三、是分子水平上的基因诊断所必需,四、是开展基因治疗等科研必备的基础,生物分子的结构与功能,第一篇,第一章：蛋白质的结构与功能第二章：核酸的结构与功能第三章：酶第四章：聚糖的结构与功能第五章：维生素与无机盐,蛋白质的结构与功能,第 一 章,Structure and Function of Protein,本章内容概要： 1、蛋白质的

4、分子组成 2、蛋白质的分子结构 3、蛋白质结构与功能的关系 4、蛋白质的理化性质 5、蛋白质的分离纯化与结构分析,一、什么是蛋白质?,蛋白质(protein)是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物。,蛋白质概述：,二、蛋白质的生物学重要性,1. 蛋白质是生物 体重要组成成分分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80。,1）作为生物催化剂（酶）2）代谢调节作用3）免疫保护作用4）物质的转运和存储5）运动与支持

5、作用6）参与细胞间信息传递,2. 蛋白质具有重要的生物学功能,3. 氧化供能,蛋白质的分子组成The Molecular Component of Protein,第 一 节, 组成蛋白质的元素:,主要有C、H、O、N和S。 有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘 。,各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16。,由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：,100克样品中蛋白质的含量 ( g % )= 每克样品含氮克数 6.25100,1/16%, 蛋白质元素组成的特点,（凯氏定氮法）,一、氨基酸 组

6、成蛋白质的基本单位,R,氨基酸的结构通式,存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属 L- 氨基酸（甘氨酸除外）。,存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属 L- 氨基酸（甘氨酸除外）。,H,甘氨酸,R,L-氨基酸的结构通式,1、非极性脂肪族氨基酸2、极性中性氨基酸3、芳香族氨基酸4、酸性氨基酸5、碱性氨基酸,二、氨基酸的分类（据侧链基团的理化性质不同分）,* 20种氨基酸的英文名称、缩写符号及分类如下:,(1) Nonpolar aliphatic amino acids:,Glycine Alanine Valine L

7、eucine Isoleucine Proline,甘氨酸,丙氨酸,缬氨酸,亮氨酸,异亮氨酸,脯氨酸,（非极性脂肪族）,(1) Nonpolar aliphatic amino acids:,Glycine Alanine Valine Leucine Isoleucine Proline,(2) Polar neutral amino acids:,Serine Threonine Cysteine Methionine Asparagine Glutamine,（极性中性）,丝氨酸,苏氨酸,半胱氨酸,蛋氨酸（甲硫氨酸）,天冬酰胺,谷胺酰胺,(3) Nonpolar aromatic ami

8、no acids:,Phenylalanine Tyrosine Tryptophan,非极性芳香族氨酸酸,苯丙氨酸,酪氨酸,色氨酸,(3) Nonpolar aromatic amino acids:,Phenylalanine Tyrosine Tryptophan,(4) acidic amino acids（酸性氨基酸） Aspartic acid （天冬氨酸） Glutamic aicd （谷氨酸）,(3) Nonpolar aromatic amino acids:,Phenylalanine Tyrosine Tryptophan,(4) acidic amino acids:

9、Aspartic acid Glutamic aicd,(5) basic amino acid （碱性氨基酸）,Lysine Arginine Histidine,赖氨酸,精氨酸,组氨酸,说明一点： 20种氨基酸的分类是可以根据不同需要而有多种分类的。如以往曾经只分为四种： 非极性疏水性，极性中性，酸性，碱性。,甘氨酸 glycine Gly G 5.97,丙氨酸 alanine Ala A 6.00,缬氨酸 valine Val V 5.96,亮氨酸 leucine Leu L 5.98,异亮氨酸 isoleucine Ile I 6.02,苯丙氨酸 phenylalanine Phe F

10、 5.48,脯氨酸 proline Pro P 6.30,非极性疏水性氨基酸,色氨酸 tryptophan Try W 5.89,丝氨酸 serine Ser S 5.68,酪氨酸 tyrosine Try Y 5.66,半胱氨酸 cysteine Cys C 5.07,蛋氨酸 methionine Met M 5.74,天冬酰胺 asparagine Asn N 5.41,谷氨酰胺 glutamine Gln Q 5.65,苏氨酸 threonine Thr T 5.60,2. 极性中性氨基酸,天冬氨酸 aspartic acid Asp D 2.97,谷氨酸 glutamic acid G

11、lu E 3.22,赖氨酸 lysine Lys K 9.74,精氨酸 arginine Arg R 10.76,组氨酸 histidine His H 7.59,3. 酸性氨基酸,4. 碱性氨基酸,说明一点： 20种氨基酸的分类是可以根据不同需要而有多种分类的。如以往曾经只分为四种： 非极性疏水性，极性中性，酸性，碱性。,在往后的学习中，还会碰到以下的氨基酸分类： 1、按结构中是否含硫而划分出含硫氨基酸：Cys、Met 2、按R基团是否为支链划分出支链氨基酸：Val、Leu、Ile 3、按营养价值高低不同划分营养必需和营养非必需氨基酸。,两种特殊氨基酸：,脯氨酸（亚氨基酸）, 半胱氨酸,胱氨

12、酸,Modified amino acids修饰氨基酸（无密码子编码）,Selenium, Se,Sulfur, S,羟脯氨酸,羟赖氨酸,amino acids not-presented in proteins,鸟氨酸,瓜氨酸,不出现在蛋白质结构中的氨基酸,三、氨基酸的主要理化性质 1、氨基酸两性解离和等电点： 1）两性解离：,AA,NH2,COOH,AA,NH3,COOH,AA,NH2,COO,-,+,AA,AA,NH2,COOH,AA,NH3,COOH,AA,NH2,COO,-,+,H,+,OH,-,H低时,H高时,三、氨基酸的主要理化性质 1、氨基酸两性解离和等电点： 1）两性解离：,

13、2）等电点：指使氨基酸解离成正、负离子数相等， 净电荷为零时溶液的pH值。用pI表示,AA,NH2,COOH,AA,NH3,COOH,+,AA,NH2,COO,-,AA,COO,NH3,+,-,H,+,OH,-,如此则有：,AA,NH2,COOH,AA,NH3,COOH,+,AA,NH2,COO,-,AA,COO,NH3,+,-,pH,pI,pH,pI,pH=,pI,I的计算:,pI = (pK1 + pK2) / 2,I的计算:,pI = (pK1 + pK2) / 2,例： Glu的pK1 =2.6，pK2=4.6， pK3=9.6， 其pI约是多少？,I的计算:,酸性：小加小除以碱性：大

14、加大除以其他：加起来除以,pI = (pK1 + pK2) / 2,问题：下列哪个氨基酸在中性溶液中电泳时 向负极移动？ A、精氨酸 B、异亮氨酸 C、谷氨酸 D、天冬氨酸 E、丝氨酸,2. 紫外吸收,是指含有共轭双键的色氨酸、酪氨酸溶液对紫外光具有吸收特性，其最大吸收峰在 280 nm 附近。,2. 氨基酸紫外吸收特性的应用。,大多数蛋白质含有色氨酸与酪氨酸，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。（紫外分光光度法）,3. 茚三酮反应,氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm处。由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此

15、也可作为氨基酸定量分析方法。,四、肽,（一）肽(peptide),* 肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。,四、肽,* 肽键(peptide bond)是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。,（一）肽(peptide),* 肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。,+,甘氨酰甘氨酸,肽键,* 两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽,* 肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。,* 由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。,*

16、 多肽链(polypeptide chain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。,N 末端：多肽链中有自由氨基的一端C 末端：多肽链中有自由羧基的一端,1、多肽链有两端：,* 多肽链(polypeptide chain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。,2、多肽链主链和侧链：,主链：由构成肽键的四个原子和-碳原子交替连接而成。侧链：由多肽链各个氨基酸残基的侧链基团构成。,多肽链主链：,多肽链侧链：,多肽链侧链：,蛋白质与多肽：,可以说蛋白质是多肽，但不能说多肽就是蛋白质；蛋白质含有较多的氨基酸残基（最小的，胰岛素，51），并且蛋白质因为自身独特的空间结构而具有特异的生理功

17、能。,（二） 几种生物活性肽,1. 谷胱甘肽(glutathione, GSH),功能：抗氧化、解毒。,GSH过氧化物酶,GSH还原酶,NADPH+H+,NADP+,（1）抗氧化：,联系临床： 蚕豆病的生化机制（磷酸戊糖途径的生理意义）！,酶,SH,SH,+,Hg,酶,S,S,Hg,酶,S,S,Hg,+,GSH,酶,SH,SH,Hg,GSH,+,（2）解毒：如临床上的重金属中毒,（有活性）,（失去活性）,（恢复活性）,体内许多激素属寡肽或多肽,神经肽(neuropeptide),2. 多肽类激素及神经肽,蛋 白 质 的 分 子 结 构The Molecular Structure of Pro

18、tein,第 二 节,蛋白质的分子结构包括：1952年,一级结构(primary structure)二级结构(secondary structure)三级结构(tertiary structure)四级结构(quaternary structure),定义：蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸从N端到C端的排列顺序。,一、蛋白质的一级结构,一级结构的维系键：肽键，有些蛋白质还包括二硫键。,一级结构是蛋白质空间构象和生物学功能的基础。,1953年，英国F.Sanger，1958年Nobel奖,二、蛋白质的二级结构,维系键： 氢键,（一）肽单元,参与肽键的6个原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平

19、面，C1和C2在平面上所处的位置为反式(trans)构型，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元 (peptide unit) 。,20世纪30年代,蛋白质二级结构的主要形式,-螺旋 ( -helix ) ：最常见 -折叠 ( -pleated sheet ) -转角 ( -turn ) 无规卷曲 ( random coil ),（二） -螺旋：是指蛋白质分子中多个肽平面通过 -碳原子沿长轴方向，按一定规律盘绕形成 的稳定-螺旋构象。,结构要点（特征）是：多为右手螺旋；3.6AA圈、螺距0.54nm,0.54nm,（二） -螺旋：是指蛋白质分子中多个肽平面通过 -碳原子沿长轴方向，按一定规律

20、盘绕形成 的稳定-螺旋构象。,结构要点（特征）是：多为右手螺旋；3.6AA圈、螺距0.54nm氢键维系（主要）；,0.54nm,C,O,H,（二） -螺旋：是指蛋白质分子中多个肽平面通过 -碳原子沿长轴方向，按一定规律盘绕形成 的稳定-螺旋构象。,0.54nm,C,O,H,R,结构要点（特征）是：多为右手螺旋；3.6AA圈、螺距0.54nm氢键维系（主要）；侧链基团在外，并以其大小、形状、所带电荷来影响螺旋形成。 可存在两性-螺旋,（三） -折叠：又称-片层。是指蛋白质多肽链主链 中肽平面折叠成锯齿状的结构。,结构特点是：1、肽链延伸，折叠成锯齿状。,（三） -折叠：又称-片层。是指蛋白质多肽

21、链主链 中肽平面折叠成锯齿状的结构。,结构特点是：1、肽链延伸，折叠成锯齿状。 2、若干肽段可互相靠拢，平行排列，成片层状。,（三） -折叠：又称-片层。是指蛋白质多肽链主链 中肽平面折叠成锯齿状的结构。,结构特点是：1、肽链延伸，折叠成锯齿状。 2、若干肽段可互相靠拢，平行排列，成片层状。 3、氢键维系。,C,O,N,H,（三） -折叠：又称-片层。是指蛋白质多肽链主链 中肽平面折叠成锯齿状的结构。,结构特点是：1、肽链延伸，折叠成锯齿状。 2、若干肽段可互相靠拢，平行排列，成片层状。 3、氢键维系。 4、侧链基团在片层上下。,C,O,N,H,R,R,（三） -折叠：又称-片层。是指蛋白质多

22、肽链主链 中肽平面折叠成锯齿状的结构。,结构特点是：1、肽链延伸，折叠成锯齿状。 2、若干肽段可互相靠拢，平行排列，成片层状。 3、氢键维系。 4、侧链基团在片层上下。 5、平行排列的肽段可顺向，可反向。,C,O,N,H,R,R,N端,C端,C端,N端,（三） -折叠：又称-片层。是指蛋白质多肽链主链 中肽平面折叠成锯齿状的结构。,结构特点是：1、肽链延伸，折叠成锯齿状。 2、若干肽段可互相靠拢，平行排列，成片层状。 3、氢键维系。 4、侧链基团在片层上下。 5、平行排列的肽段可顺向，可反向。,C,O,N,H,R,R,N端,C端,C端,N端,（三） -折叠：又称-片层。是指蛋白质多肽链主链 中

23、肽平面折叠成锯齿状的结构。,结构特点是：1、肽链延伸，折叠成锯齿状。 2、若干肽段可互相靠拢，平行排列，成片层状。 3、氢键维系。 4、侧链基团在片层上下。 5、平行排列的肽段可顺向，可反向。,C,O,N,H,R,R,C端,N端,-折叠,-pleated sheet,（四）-转角和无规卷曲,-转角只包含四个氨基酸残基.,1.-转角,无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。,2. 无规卷曲,（五）模体,在许多蛋白质分子中，两个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象并具有特殊功能，称为模体(motif)。本质上属超级二级结构。模体总有其特征性的氨基酸序列,并发

24、挥特殊的功能。,钙结合蛋白中结合钙离子的模体,锌指结构,（六）氨基酸残基的侧链对二级结构形成的影响,蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成-螺旋或-折叠，它就会出现相应的二级结构。,例1：妨碍-螺旋形成的主要因素：,（1）多个酸性AA相邻或多个碱性AA相邻，R带同种电荷相斥。,（2）Asn , Leu存在处，R侧链大。,（3）Pro存在，Pro的N原子位于刚性五元环中，妨碍盘曲而使肽链走向转折，不能形成-螺旋而形成-转角。,例2：-折叠形成的条件：,较小的R（如Gly , Ala）容许两条肽段彼此接近。如蚕丝蛋白中含大量Gly,Ala，故极易形成-折叠。,三、蛋

25、白质的三级结构,整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。,（一） 定义,肌红蛋白 (Mb),规律：亲水侧链在外，疏水侧链在内。,（二）结构域,大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个具有较为独立三维结构的球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行使其功能，称为结构域(domain) 。但有些蛋白质各结构域之间接触较多并紧密，从结构上很难划分，因此并非所有蛋白质的结构域都明显可分。,（三）分子伴侣(chaperon),* 分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，如此重复进行可防止错误的聚集发生，使肽链正确折叠。,* 分子伴侣也可与错误聚集的肽段结合

26、，使之解聚后，再诱导其正确折叠。,* 分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫键的正确形成起了重要的作用。,一类能促进蛋白质空间结构正确形成的蛋白质。它通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构。,机制：,可参考P308页加深理解。,四、蛋白质的四级结构,蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。,有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，这样的一条多肽链就称为蛋白质的亚基 (subunit)。,维系键： 氢键，离子键，疏水键。不能是二硫键。,理解四级结构要注意的几个问题： （1）并非所有的蛋白质都有四级结构。 条

27、件：由两条(以上)的多肽链构成。 且每条多肽链具有独立的三级结构。 多肽链之间不能以共价键相连。 （2）亚基单独存在时不具有生理功能。 （3）蛋白质分子之间的结合或蛋白质与脂类、核酸 等的结合，不属四级结构范畴。,4 subunits,血红蛋白的四级结构,蛋白质一 四级结构关系图：,蛋白质一 四级结构关系图：,Motif Domain,五、蛋白质的分类,* 根据蛋白质组成成分,* 根据蛋白质形状,纤维状蛋白质：较难溶于水,球状蛋白质：多数能溶于水,蛋白质结构与功能的关系The Relation of Structure and Function of Protein,第 三 节,蛋白质结构与功

28、能的关系The Relation of Structure and Function of Protein,第 三 节,一、蛋白质一级结构与功能的关系二、蛋白质空间结构与功能的关系,（一）一级结构是空间结构与功能的基础,一、蛋白质一级结构与功能的关系,例： 蛋白质就算受到变性因素影响而导致其空间结构破坏，只要其一级结构还在，则仍然有恢复其空间结构与功能的可能。,牛核糖核酸酶的一级结构（天然状态）,天然状态，有催化活性,尿素、 -巯基乙醇,去除尿素、-巯基乙醇,非折叠状态，无活性,（二）蛋白质一级结构相似则空间结构与功能相似。,如： 各种动物体内的胰岛素，其一级结构类似，故都具有降血糖的功能。,

29、（三）蛋白质一级结构的改变可引起 功能的改变（疾病）,例：镰刀形红细胞贫血,（三）蛋白质一级结构的改变可引起 功能的改变（疾病）,例：镰刀形红细胞贫血,这种由蛋白质分子一级结构发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。其根本原因在于基因突变。,（四）一级结构的氨基酸序列能提供生物进化信息,比较不同物种间同种蛋白质的一级结构，可以了解物种间的进化关系。表现为蛋白质一级结构越相似，则物种间的亲缘关系越接近。 可由此绘成物种间的进化树。见图1-18,二、蛋白质空间结构与功能的关系,蛋白质的空间结构决定蛋白质的功能蛋白质的空间结构改变则功能改变,（一）肌红蛋白与血红蛋白的结构,（一）肌红蛋白与血红蛋白的结

30、构,可看出：血红蛋白单个亚基的结构与肌红蛋白相似。 故都能与氧结合。但有差别。,Hb与Mb一样能可逆地与O2结合， Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。 Mb则缺乏此种变化。,（二）血红蛋白的构象变化与结合氧,肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线,* 协同效应(cooperativity),一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。 如果是促进作用则称为正协同效应 (positive cooperativity)如果是抑制作用则称为负协同效应 (negative co

31、operativity),变构效应(allosteric effect),当蛋白质与某些小分子物质结合后引起其空间结构的改变进而伴随其功能的变化，称为变构效应。此种蛋白称为变构蛋白，这些小分子物质称为变构剂。后面将要学习的酶的变构调节即与此相同。,（三）蛋白质构象改变与疾病,蛋白质构象病： 蛋白质在形成空间结构的过程中发生错误折叠，故未能形成正确的空间结构（构象），尽管其一级结构不变，但其功能仍受到影响，严重时可导致疾病发生。,有些蛋白质错误折叠后相互聚集，水溶性差，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。,这类疾病包括： 人纹状体脊髓变性病、

32、老年痴呆症、 亨丁顿舞蹈病、疯牛病等。,蛋白质构象改变导致疾病的机理：,疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为-折叠的PrPsc，从而致病。,疯牛病中的蛋白质构象改变：,第四节,蛋白质的理化性质,The Physical and Chemical Characters of Protein,（一）蛋白质的两性电离,蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。,* 蛋白质的等电点( i

33、soelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。,Pr,NH2,COO -,OH-,OH-,H+,H+,Zwitterion,Negative ion,Positive ion,pH=pI,pHpI,pHpI,（二）蛋白质的胶体性质,蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。,* 蛋白质胶体稳定的因素（蛋白质溶于水的原因）颗粒表面电荷水化膜,水化膜,表面电荷,水化膜与表面电荷的存在，使溶液当中的蛋白质分子不能互相聚集

34、成团，从而以单个分子的形式溶于水溶液中。 要想蛋白质从溶液当中沉淀出来，则必须破坏这两大因素。,（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固,在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。称为蛋白质变性。,蛋白质的变性(denaturation),造成变性的因素：如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等 。,变性的本质：破坏非共价键和二硫键， 不改变蛋白质的一级结构。,变性的后果：溶解度降低，粘度增加，结晶能力 消失，生物活性丧失，易被蛋白酶水解。,应用举例临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。此外,

35、 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。,* 蛋白质沉淀：蛋白质变性时会因空间结构被破坏而导致疏水侧链暴露出来，肽链相互缠绕继而融汇聚集而从溶液中析出，称为蛋白质沉淀。变性的蛋白质易于沉淀但不一定沉淀；同样蛋白质发生沉淀，也不一定是因为变性引起。,若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为变性蛋白质的复性(renaturation) 。,天然状态，有催化活性,尿素、 -巯基乙醇,去除尿素、-巯基乙醇,非折叠状态，无活性,若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为变性蛋白质的复性(ren

36、aturation) 。但许多蛋白质变性后，因空间结构破坏严重而难以复性，称为不可逆变性。,蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。,* 蛋白质的凝固作用(protein coagulation),（四）蛋白质的紫外吸收,由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。,（五）蛋白质的呈色反应,茚三酮反应(ninhydrin reaction) 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。,双缩脲反应(biuret reaction)蛋白质和多肽分子中的肽键在

37、稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。,（五）蛋白质的呈色反应,茚三酮反应(ninhydrin reaction) 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。,双缩脲反应(biuret reaction)蛋白质和多肽分子中的肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。,+,第五节,蛋白质的分离纯化,The Separation and Purification of Protein,（一）透析及超滤法,* 透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开

38、的方法。,* 超滤法 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。,（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀,*丙酮和乙醇等有机溶剂极性强，故能破坏蛋白质表面的水化膜而使蛋白沉淀。 使用丙酮沉淀时，应在04低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离以免变性。,*盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。,* 免疫沉淀法： 将某一纯化蛋白质作为抗原免疫动物，可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复

39、合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。,（三）电泳,蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳(elctrophoresis) 。,例：人血清中有各种蛋白质： 清蛋白（pI=4.64) -球蛋白（ pI =5.06) -球蛋白（ pI =5.06) -球蛋白（ pI =5.12) -球蛋白（ pI =6.85 7.3),2,1,如把上述各种蛋白质都处于有同一pH值（如=8.6)的溶液中，则由于它们的等电点不同，导致它们所带的电荷量也不等（但都带负电）。与8.6的差值越大，则所带的电荷量越

40、多。如置入同一电场中电泳，它们都会向正极移动，但因速度有差别而分离开来。,醋酸纤维薄膜,+,-,点样血清（包括各种蛋白）,正、负极和薄膜都和pH=8.6的缓冲液接触,+,-,在220V电压下，通电40分钟后并经染色得,各种蛋白的PI不同，分子量也有差异，故向正极移动的速度就有差别。,+,-,清蛋白,-球蛋白,1,-球蛋白,2,-球蛋白,-球蛋白,*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。*等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。*双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。,几种重要的蛋白质电泳：,（四）层析,待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时

41、，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度经过固定相而达到分离蛋白质的目的 。,蛋白质分离常用的层析方法：* 离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。* 凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。,（五）超速离心,* 超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。,*蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient, S)表示，沉降系数与蛋白质的密度和形状相关 。,* 因为沉降系

42、数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。,（六）多肽链中氨基酸的序列分析,（七）蛋白质空间结构测定,（略）,（六）多肽链中氨基酸的序列分析,分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成,测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基,把肽链水解成片段，分别进行分析,测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法,一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。,还可通过核酸序列来推演蛋白质中的氨基酸序列,按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列,分离编码蛋白质的基因,

43、测定DNA序列,排列出mRNA序列,四、蛋白质空间结构测定,* 二级结构测定通常采用圆二色光谱(circular dichroism，CD)测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。 -螺旋的CD峰有222nm处的负峰、208nm处的负峰和198 nm处的正峰三个成分；而-折叠的CD谱不很固定。,* 三级结构测定X射线衍射法(X-ray diffraction)和核磁共振技术(nuclear magnetic resonance, NMR)是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。,* 用分子力学、分子动力学的方法，根据物理化学的基本原理，从理论上计算蛋白质分子的空间结构。,根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构,* 通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找出一级结构与空间结构的关系，总结出规律，用于新的蛋白质空间结构的预测。,