生化产品检测与分析课程总结课件.ppt
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1、,一.考试题型介绍二.内容串讲三.每章重点四.习题讲解,总复习,一.考试题型介绍,(一). 名词解释题(310=30)(二). 简答题(65=30)(三)计算题(2-3题,20)(四). 阐述题(102=20),二.内容串讲,第一章 绪论(一)生化产品检测与分析的目的和意义(二)生化产品检测与分析的内容(三)生化产品检测与分析的方法,第二章 生物工程分析的基础知识,(一)样品的采集、制备和保存(二)生物样品预处理的方法(三)误差及分析方法的选择重点:进行样品分析的流程,样品的制备与预处理方法,分析方法的选择原则。从哪些方法来保证测定结果的准确度。,第4章 化学分析法,(一)概述(二)酸碱测定法
2、(三)氧化还原滴定法(四)重量法重点:蛋白质及氨基酸的测定中的凯氏定氮法、还原糖的直接滴定法以及脂类测定的经典方法(索氏提取法)的原理、方法及注意事项。,第5章 紫外-可见吸收光谱法,(一)紫外-可见吸收光谱定义 检测范围(二)朗伯-比耳定律(三)紫外-可见分光光度计(四)分析条件的选择(五)测定方法(六)紫外-可见吸收光谱的应用重点:光的吸收定律;分析条件的选择。生色团、助色团,红移、蓝移的定义。,第6章 荧光分光光度法,(一)荧光的产生(二)激发光谱与荧光光谱(三)荧光分析仪器(四)荧光分析方法特点及应用重点:激发光谱与荧光光谱;具有荧光性质的分子的结构特征,荧光分析方法与紫外可见分光光度
3、法的区别与联系。,第7章 薄层色谱法,(一)概述(二)薄层色谱的基本原理(三)薄层色谱的操作技术(四)薄层色谱法定量分析(五)薄层色谱法在生物工程分析中的应用重点:薄层色谱的基本原理和薄层色谱的操作技术;比移值,分配系数,分离度的含义及应用。,第8章 气相色谱分析法,(一)概述和基本理论(二)定性分析方法(三)定量分析方法(四)气相色谱检测器(五)气相色谱的应用重点:塔板理论,定量方法的分类特点及适应范围、气相色谱仪结构组成和气相色谱检测器的选择和应用。,第9章 高效液相色谱法,(一)高效液相色谱法的特点(二)高效液相色谱的基本理论(三)高效液相色谱的固定相和流动相(四)液相色谱仪(五)高效液
4、相色谱的应用重点:高效液相色谱仪的组成部分及作用原理;检测器的分类及应用范围;固定相和流动相的选择;气相色谱与液相色谱的区别与联系。,第10章 电泳法和高效毛细管电泳法,(一)概述(二)电泳法和高效毛细管电泳法的基本理论(三)电泳仪和高效毛细管电泳仪(四)应用示例重点:电泳法和高效毛细管电泳法的分离模式,第12章 酶法分析,12.1 概述12.2 酶法分析方法和应用示例12.3 酶联免疫分析法,重点:酶法分析的方法和应用范围,第14章 生物传感器,(一)概述(二)酶传感器(三)核酸传感器(四)几种新型生物传感器重点:生物传感器的定义模型和制作的主要方法以及电化学方法中常用的电极类型。,生物工程
5、分析的定义: 是一门研究和讨论生物工程领域所需要的分析检验技术的方法、原理、仪器装置、操作要点以及应用范围等为主要内容的工具学科。,第1章 绪论,三.每章重点,分析化学,化学分析,仪器分析,酸碱滴定,配位滴定,氧化还原滴定,沉淀滴定,电化学分析,光学分析,色谱分析,波谱分析,重量分析,滴定分析,电导、电位、电解、库仑极谱、伏安,发射、吸收,荧光、光度,气相、液相、离子、超临界、薄层、毛细管电泳,红外、核磁、质谱,1.理化检验篇(1)生化产品营养成分的测定(2)水分、矿物元素的测定(3)酶活力的测定,生物工程分析的主要内容:,第1章.绪论,2.仪器分析篇 (1)紫外、可见吸收光谱法 (2)荧光分
6、光光度法 (3) 薄层色谱法 (4)气相色谱法 (5)高效液相色谱法 (6)电泳法和高效毛细管电泳法 (7)生物传感器,第2章 生物工程分析的基础知识,一.样品分析流程: 样品的采集、制备和保存,样品的预处理,成分检验与分析,数据处理,整理报告。二.正确采样,必须遵守的原则:代表性,三.预处理方法分类:1.溶解法2.蒸馏法(1)常压蒸馏(2)减压蒸馏(3)水蒸气蒸馏(4)分馏(5)扫集共蒸馏法3.有机物破坏法 干法灰化 湿法消化:是加入强氧化剂(如浓硝酸、高氯酸、高锰酸钾等),使样品消化,而被测物质呈离子状态保存在溶液中。4.溶剂提取法 溶剂分层法浸泡法盐析 5.色层分离法6.其它的生化分离提
7、纯技术,四.分析方法的评价指标 在研究一个分析方法的好坏时,通常用精密度、准确度和灵敏度三项指标评定。此外还考虑线性和线性范围、耐用性等.1.精密度 是指对同一样品多次测定,每次测定结果与均值的符合程度。2. 准确度 指测定值与真值之间的符合程度。3. 灵敏度 是指化学反应中能检出的最低量。,4. 特异性 指分析测定中对某一成分起反应,其他物质对反应无影响或基本无影响。,二. 提高分析精确度的方法(控制和消除误差的方法),1 正确选取样品的量 2 增加平行测定次数 3 对照实验4 空白实验5 回收实验6 校正仪器和标定试剂7 严格遵守操作规程,(二)回收试验 目的是检测误差,以衡量分析方法的准
8、确度。是在样品中加入一定量被测物质,然后用同样方法测定,测得值与理论值之比乘以100%即为回收率,合格的回收率应为100%5 %。,第4章 化学分析法,4.2 酸碱滴定法,蛋白质系数:表示1份含氮量相当于蛋白质含量的份数. 不同的产品蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同,故不同产品的蛋白质系数有差异。,蛋白质的测定方法,*凯氏定氮法,双缩脲比色法,紫外吸收法,Folin-酚比色法,染料染色法,中性醋酸铅,乙酸锌和亚铁氰化钾溶液,硫酸铜和氢氧化钠溶液,还有碱性醋酸铅、氢氧化铝溶液、活性炭等。,糖的测定常用澄清剂的种类,铁氰化钾法,4.3.1 还原糖的测定-直接滴定法(斐林氏容量法),原理 将一定量的
9、碱性酒石酸铜甲、乙液等量混合,立即生成天蓝色的氢氧化铜沉淀;沉淀很快与酒石酸钾反应,生成深蓝色的可溶性酒石酸钾钠铜络合物。 在加热条件下,以次甲基蓝作为指示剂,用样液滴定,样液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应,生成红色的氧化亚铜沉淀; 这种沉淀与亚铁氰化钾络合成可溶的无色络合物;二价铜全部被还原后,稍过量的还原糖把次甲基蓝还原,溶液由兰色变为无色,即为滴定终点; 根据样液消耗量可计算出还原糖含量。, 此法测得的是总还原糖量。 在样品处理时,不能用铜盐作为澄清剂,以免样液中引入Cu2+,得到错误的结果。 碱性酒石酸铜甲液和乙液应分别贮存,用时才混合,否则酒石酸钾钠铜络合物长期在碱性条件下会慢慢分解析
10、出氧化亚铜沉淀,使试剂有效浓度降低。,说明与讨论, 滴定必须在沸腾条件下进行,其原因一是可以加快还原糖与Cu2+的反应速度;二是次甲基蓝变色反应是可逆的,还原型次甲基蓝遇空气中氧时又会被氧化为氧化型。此外,氧化亚铜也极不稳定,易被空气中氧所氧化。保持反应液沸腾可防止空气进入,避免次甲基蓝和氧化亚铜被氧化而增加耗糖量。,滴定时不能随意摇动锥形瓶,更不能把锥形瓶从热源上取下来滴定,以防止空气进入反应溶液中。,样品溶液预测的目的;一是本法对样品溶液中还原糖浓度有一定要求(0.1%左右),测定时样品溶液的消耗体积应与标定葡萄糖标准溶液时消耗的体积相近,通过预测可了解样品溶液浓度是否合适,浓度过大或过小
11、应加以调整,使预测时消耗样液量在 10 mL 左右;,5.加速灰化的方法:,(1) 改变操作方法 样品初步灼烧后取出坩埚冷却 在灰中加少量热水搅拌使水溶性盐溶解,使包住的碳粒游离出来 蒸去水分干燥灼烧(2) 加HNO3(1:1)或30%H2O2 使未氧化的碳粒充分氧化并且使它们生成NO2和水,这类物质灼烧时完全消失,又不至于增加残留物灰分重量。(3) 加乙酸镁、硝酸镁等,使碳粒不被包裹,同时得作空白实验。,4.5.1 总灰分的测定,灰分测定步骤,在坩埚中称取定量样品在电炉中炭化至无烟 在马福炉中灼烧到灰白色(灰化) 降至200 放入干燥室内冷却称重灼烧1小时 冷却到恒重灰分%=(灰分重量/样品
12、重量 )100,三.脂类物质提取剂的选择,经典方法,索氏提取器,虹吸管,联接管,4.常用的脂类提取剂有哪些?,5.索氏提取法的原理、仪器构造、优点和操作过程分别是什么?索氏提取法的原理:脂肪不溶于水,易溶于乙醚、石油醚、氯仿等溶液中。用乙醚等有机溶液提取样品中脂肪等再经蒸发除去有机溶剂,经称重就可知粗脂肪的含量。优点:即用易挥发溶剂在索氏提取器里不断地蒸发、冷凝、溶解被提取物、纯溶剂再蒸发、冷凝、溶解被提取物,一直到把被提取物提取干净。这一方法简单、提取完全。 仪器:索氏提取器操作过程:球瓶内放有机溶剂,经水浴加热使溶剂不断蒸发。提取筒内装样品,溶剂蒸气经冷凝器冷凝后不断滴入提取筒内。溶剂在此
13、与样品充分接触,溶解其中的脂肪。经过一定时间后,溶剂不断蒸发,冷凝,样品受到一次次新鲜溶剂的浸泡,直到样品中所有的脂肪完全溶出止。,第5章 紫外-可见分光光度法,5.1 紫外-可见吸收光谱5.2 朗伯-比耳定律5.3 紫外-可见分光光度计5.4 分析条件的选择5.5 紫外-可见吸收光谱的主要用途,电子跃迁有哪几种类型,这些类型各处于什么波长范围?n, n,跃迁,200nmn跃迁,吸收波长为150250nm跃迁,吸收波长处于远紫外区的近紫外端或近紫外区150250nm之间n跃迁,吸收波长250nm800nm之间,n 跃迁 200 nm200400 nm(近紫外区) ,可用于结构鉴定和定量分析。
14、可见吸收光谱:电子跃迁光谱,吸收光波长范围400750 nm ,主要用于有色物质的定量分析,2. 生色团与助色团,生色团: 最有用的紫外-可见光谱是由和n跃迁产生的。这两种跃迁均要求有机物分子中含有不饱和基团。这类含有键的不饱和基团称为生色团。简单的生色团由双键或叁键体系组成,如乙烯基、羰基、亚硝基、偶氮基-NN-、乙炔基、腈基-CN等。助色团: 有一些含有n电子的基团(如-OH、-OR、-NH、-NHR、-X等),它们本身没有生色功能(不能吸收200nm的光),但当它们与生色团相连时,就会发生n-共轭作用,增强生色团的生色能力(吸收波长向长波方向移动,且吸收强度增加),这样的基团称为助色团。
15、,Alg(I0/It)=-lgT= b c A:吸光度,描述溶液对光的吸收程度; b:液层厚度(光程长度),通常以cm为单位; c:溶液的摩尔浓度,单位molL-; :摩尔吸光系数,单位Lmol-cm-; 或: Alg(I0/It)= a b c c:溶液的浓度,单位gL- a:吸光系数,单位Lg-cm- a与的关系为:a =/M (M为摩尔质量),1.朗伯-比耳定律,朗伯-比耳定律是吸光光度法的理论基础和定量测定的依据。应用于各种光度法的吸收测量; 摩尔吸光系数在数值上等于浓度为1 mol/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度; 吸光系数 a 相当于浓度为1 g/L、液层厚度为1
16、cm时该溶液在某一波长下的吸光度。,紫外可见分光光度计基本组成,光源,单色器,样品室,检测器,显示,二、分光光度计的类型,1.单光束 简单,价廉,适于在给定波长处测量吸光度或透光度,一般不能作全波段光谱扫描,要求光源和检测器具有很高的稳定性。,2.双光束 自动记录,快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响,特别适合于结构分析。仪器复杂,价格较高。,第6章 荧光分光光度法,(一)荧光的产生(二)激发光谱与荧光光谱(三)荧光分析仪器(四)荧光分析方法特点及应用重点:激发光谱与荧光光谱;具有荧光性质的分子的结构特征。,荧光与分子结构的关系,(2)共轭效应 * 跃迁 芳香族化合物
17、。共轭双键结构有利于发光。 共轭体系越大,越易产生荧光,荧光效率也增大.,电子跃迁类型大部分荧光化合物电子跃迁的能级是由* 跃迁或n* 电子跃迁而被激发的。,(3) 刚性平面结构,酚酞(无荧光),8羟基喹啉(弱荧光),红色荧光,荧光素,联二苯 = 0.2,芴 = 1.0,3,4-苯并芘,( 强荧光物质),刚性平面结构:可降低分子振动,减少与溶剂的相互作用,故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构,荧光素有很强的荧光,酚酞却没有。,(4)取代基的影响,给电子基增强荧光: OH,OR,NH2,NHR,NR2,CN吸电子基减弱荧光: COOH,C=O,NO2,NN,Cl,Br,I与体系作用小的取代
18、基影响不明显: SO3R,NH3,SH,F,R。,取代基之间若发生氢键,增强分子平面性和刚性会加强荧光:,测量荧光的仪器主要由四个部分组成:激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。 特殊点:有两个单色器;光源与检测器通常成直角;单色器位置不同;比色皿不同(荧光要用四面透光的),6.3.1 荧光分光光度计,第7章 薄层色谱法,(一)概述(二)薄层色谱的基本原理(三)薄层色谱的操作技术(四)薄层色谱法定量分析(五)薄层色谱法在生物工程分析中的应用重点:薄层色谱的基本原理和薄层色谱的操作技术。,7.2 薄层色谱法的基本原理,1.保留参数(Rf值)用来表征斑点位置的基本参数是保留因子,通常称作比移值,
19、用Rf表示。,原点,S,R,W,Ls,L。,Lr,原点,参比,样品,前沿,3.分配系数K= cS / cm ,表示,即分离达到平衡时,组分在固定相和流动相的浓度之比。4.分离度,7.3.4 流动相与展开体系,1.液-固吸附 在该色谱中,溶质的保留和分离选择性决定于三个因素:,溶解能力,相互作用,一.展开体系:,定量计算外标法:此法是薄层定量最常用的方法。定量时,点样量必须准确,样品与对照品应点在同一块薄层板上。用已知含量的对照品得出样品含量的一种方法。内标法:选一个纯度高、化学性质稳定、在薄层上能与对照品分开的物质作内标物,并准确称取加到被测物中,根据内标物的质量算出被测物的含量。,薄层色谱法
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