实时荧光定量PCR技术课件.ppt

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1、Export Department Export Management Export Department Export Management Exp,实时荧光定量PCR技术,Report,内容概要,荧光定量PCR的基本概念荧光定量PCR的标记方法荧光定量PCR解析方法 SYBR法实验流程及注意事项,常规PCR与实时荧光定量PCR,常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析实时荧光定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析,荧光定量PCR常用的三个概念,扩增曲线 荧光阈值 CT值,Cyc

2、le（循环数）,Rn（荧光强度）,Baseline,Lgliner phase,平台期,扩增曲线,Cycle（循环数）,Rn（荧光强度）,Baseline,Lgliner phase,前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline） 荧光阈值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段 真正的信号:荧光信号超过阈值,Threshold,荧光阈值,平台期,Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数,Cycle（循环数）,Rn（荧光强度）,Ct value,Ct值,Ct值

3、的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值极具重现性,Ct值的数学原理,理想的PCR反应：Xn=X02n非理想的PCR反应：Xn=X0 (1+Ex)n方程式两边同时取对数得: log Xn=log X0 (1+Ex)n整理方程式得: log X0= (- log (1+Ex) )n+ log Xn将C(t)和达到C(t)值时终产物的量Xc(t)带入上式得： log X0= (- log(1+Ex) ) C(t)+ log Xc(t)初始浓度的对数与循环数呈线性关系,n：扩增反应的循环次数Xn：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率,Cycle number,Ck 1

4、04,Ck 102,Sample,Lg of DNA concentration,模板DNA量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即Ct值越小。 Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。,Ct值与模板起始量的关系,qPCR 常用实验方法,简单 成本较低,适用于多重PCR 特异性较好,可进行SNP检测特异性非常好,A,B,C,SYBR Green I 染料法原理,SYBR Green I 是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料,SYBR Green I,热 变 性,引物退火,延伸反应,SYBR Green I 染料法作用机理,问题点： SYBR Green I与双链DNA进行

5、结合后散发荧光，因此如 果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将 同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。,SYBR Green I染料法问题点与关键点,关键点： 设计合适引物，防止非特异性扩增！,将温度与荧光强度的变化求导 (-dI/dT),原始图谱,对数图谱,SYBR Green I 染料法融解曲线,SYBR Green I染料法融解曲线,使用方便，不必设计复杂 探针 具有价格优势,优 点,无模板特异性 对引物特异性要求较高 不能进行多重定量 灵敏度相对较低,缺 点,SYBR Green I 染料法优缺点,Taqman探针法原理,5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如

6、FAM、VIC等 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针,Taqman探针法工作机理,1、引物、探针的设计： 探针Tm为68-70 ，30 bp, 5不能有G，G可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为59-60 2、反应参数的确定： 一般为：94 ，10-20S 60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高），也可通过温度梯度优化退火温度 3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：100-900

7、nM 探针浓度：50-300nM4、其他与常规PCR相同,Taqman探针法PCR体系的建立,高度特异性 重复性好 灵敏度高 可进行多重定量,优 点,只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高 不易找到本底低的探针,缺 点,Taqman探针法优缺点,标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补 茎由互补配对序列组成,实时荧光定量PCR的分类分子信标,实时荧光定量PCR的分类分子信标,高特异性：对目标序列 检测SNP最灵敏的试剂之一荧光背景低,优 点,只能用于一个特定目标 设计困难 价格比较高,缺 点,实时荧光定量PCR的分类分子信标,几种方法的应用比较,绝对定量标准曲线由已知浓度的RNA、质粒生成定

8、量未知模板标准样品和未知样品必须同时反应相对定量 Ct Method: 使用内参基因定量所研究样品和参照样品目的基因，参照基因可以与目的基因同时反应，也可以单独反应。双标准曲线法：对每个样品的内参基因和目的基因都做绝对定量，求出每个样品中内参基因和目的基因的绝对数量，然后根据相对定量的基本公式来求出目的基因的差异表达。,绝对定量vs 相对定量,绝对定量,Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品 可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系 根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量,一个目的基因 即需要确定其量值的核酸序列。一组标准样本 用来生成标准曲线。可以是含

9、有目的基因的质粒、PCR产物、基因组DNA等。重复反应孔 建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性。标记方法的选择SYBR Green法或探针法均可。实验结果显示扩增曲线；标准曲线；融解曲线（探针法不需要）。,绝对定量分析几要素,拷贝数的计算：待测样本浓度（ng/ul）OD26040稀释倍数样本分子量=碱基数324待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量61014,倍比梯度稀释方法：1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品iv +9v稀释缓冲液，得

10、标准品v,质粒标准品稀释方法与拷贝数计算,方 法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测 试 剂：RealMasterMix（Probe） 标准品：质粒标准品浓度为106、105 、104 、 103 ；2个重复；设阴性空白对照 实验步骤：提取HBV DNA； 设计特异引物； 设计TaqMan探针并标记探针； 荧光定量扩增； 结果分析：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数。,绝对定量实验例乙肝病人血液中HBV的绝对定量,实验数据,乙肝病人血液中HBV的绝对定量,扩增效率（E）计算 E = 10-1/slope 1 = 10-1/-3.29 1 = 2.011 =

11、1.01,标准曲线制作：利用Mean Ct 作图可得到标准曲线,y = -3.29x + 40.33 R2 = 0.9978,乙肝病人血液中HBV的绝对定量,相关系数（R2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。 扩增效率（E）：0.9-1.1, 越接近1，越理想。,未知样品拷贝数的计算,将Ct值带入线性方程：,20.5= -3.29 X + 40.33,QuantityUnknown=10 6.03 =1,071,519 copies,乙肝病人血液中HBV的绝对定量,理论上目的基因表达量分析条件,实际目的基因表达量分析,相对定量的必要性,一个参照样本一个或一个以上的未知样本一个目的基因管

12、家基因用来校对不同样本之间目的基因的实际表达量重复反应孔 建议每个样本设置三个或三个以上重复孔，以确保统计结果的可信度。标记方法的选择SYBR Green法或探针法均可。实验结果显示扩增曲线；标准曲线；融解曲线（探针法不需要）。一组标准样本（有些分析方法不需要）,相对定量分析几要素,管家基因 维持细胞基本代谢活动所必须的基因, 如：GAPDH、Actin、18S rRNA等,筛选方法,根据文献提供 通过具体实验筛选,相对定量分析管家基因筛选,双标准曲线法 2 -Ct法,相对定量分析方法,相对定量分析实例分析,利用TaqMan法研究ERBB2 在正常或乳腺肿瘤组织标本中的表达差异已知在50%的乳

13、腺肿瘤样本中, ERBB2表达异常, 因此可以作为一个检测标准选用GAPDH作为内标基因FAM标记的ERBB2探针VIC标记的GAPDH探针构建标准曲线双重PCR反应阴性对照无RNA对照（空白）无逆转录酶对照（基因组）,双标准曲线法,Color 2 - VIC detection for GAPDH,Color 1 FAM detection for ERBB2,样品扩增：正常vs肿瘤,PMT1-FAM detection- ERBB2,PMT2-VIC detection- GAPDH,肿瘤,肿瘤,正常,正常,双标准曲线法实验结果,ERBB2表达,GAPDH表达,HealthyRNA,Tum

14、orRNA,GAPDH,ERBB2,10951052,21302492,9550085730,136000130800,Copies ng/ l Total RNA,ERBB2 copies / GAPDH copies,1095 / 95500 = 0.0111052 / 85730 = 0.012,2130/136000 = 0.0172492/130800 = 0.019,Healthy RNA,Tumor RNA,0.011,0.018,双标准曲线法结果分析,C(t)=4.41-5.18=-0.770.182-c(t) =1.51-1.93结果与双标准曲线法相近,2 法实验结果,Ct,

15、样品制备,环境要求,定量体系配备,数据分析,RT,上机,浓度确定,SYBR法实验流程及注意事项,cDNA的合成,反应体系优化,试剂选择,样品制备,定量体系配备,数据分析,上机,SYBR法实验流程及注意事项,cDNA合成 (两步法 qRT-PCR),qPCR关键cDNA影响qPCR敏感度全长cDNA合成增加qPCR成功率引物Oligo(dT): 只识别mRNA，合成cDNA序列靠近3 随机引物: 随机合成序列，可能合成非编码RNA，造成定量结果高估两者混合结合两者优点,好的qPCR结果依赖于成功的cDNA合成,定量体系配备,引物设计,浓度确定,环境要求,误差控制,RT,样品制备,数据分析,上机,

16、维基百科/google,目的mRNA序列,Real-Time PCR引物序列,Blast确定引物特异性,引物设计,SYBR引物设计原则,SYBR-Green引物引物长度18-30 bp，产物长度范围100400bpG/C 含量: 40-60%避免引物内含有互补序列 (尤其是3端)避免3 端错配3端不能出现连续三个以上的G或C避免3端出现T碱基设计夸内含子引物,TaqMan探针和引物设计,TaqMan探针 - Tm 值比引物高10 -没有连续相同的碱基 -探针位置尽可能地靠近上游 引物 -C远远多于G -5端没有G,TaqMan引物 -Tm (58 - 600 C) -15 - 30 bases

17、 in length -G+C content 30 - 80% -不要有连续4个G -3端不能有连续两个以上的G+C -5端不要有G (A or C preferred) -引物之间的TM相差避免超过2 -扩增长度50 - 150 bp (max 400) -引物跨越内含子,免费的基于网络的设计软件,Primer5（primer3.ut.ee） - 引物和双标记水解探针的设计 -Tm的计算MFold（ http:/mfold.rna.albany.edu） -引物和扩增产物二级结构的预测 -二级结构的稳定性(delta G) 和融解温度(Tm)BLAST（ http:/blast.ncbi.

18、nlm.nih.gov/） -结构特异性,对照设置,阴性对照Negative control: No template (NTC)： 检验是否有模板污染No reverse transcriptase (NRT) : 检验RNA样品中是否有DNA污染No amplification control (NAC) : 检验是否有聚合酶污染No probe control (NPC) : 检验荧光污染Buffer: Only contains buffer : 检验背景荧光阳性对照Calibrator: 可以用带有PCR扩增子的合成的RNA或cDNA寡核苷酸； 质粒DNA；克隆到质粒的cDNA；体外

19、反转录的RNA；Reference RNA pools；来自于特定的生物体样本的RNA或DNA及国际上公认的生物学标准物。Standard curve,反应体系优化,上机,反应条件优化,cDNA的合成,样品制备,模板准备,数据分析,SYBR法实验流程及注意事项,标准品,待测样本,阳性对照,阴性对照,技能要求,误差控制,仪器介绍,上机（qPCR）,试剂选择,cDNA的合成,样品制备,模板准备,数据分析,SYBR法实验流程及注意事项,数据分析,仪器介绍,分析方法,上机,cDNA的合成,样品制备,模板准备,相对定量：2Ct法绝对定量：标准曲线法,可靠，准确的数据,SYBR法实验流程及注意事项,qPC

20、R体系的检验,用扩增曲线检验qPCR体系用融解曲线检验qPCR体系用标准曲线检验qPCR体系用No-Template Control( NTC)检验qPCR体系（引物）用No RT Control检验qPCR体系（模板）,扩增曲线,平滑起始无扩增起峰时间正常NTC和NRC无扩增或扩增起峰较晚,CT值是判断实验成功与否的重要参考,荧光定量PCR参数解析- CT值,CT值主要是由反应中模板的初始浓度决定。模板浓度高，只需较少的扩增循环就可累积足够的产物，产生高过背景的荧光信号，那么CT值就会很早出现，相反CT值则会较晚出现。大多数荧光定量PCR实验的CT值在18-30之间。CT值在30-35个循环

21、之内出现，需要多次重复试验以判断数据的准确性，然后再判断是否有目的基因的扩增。CT值在35个循环之后出现，可以认为反应失败。,溶解曲线分析,呈现单峰峰的宽度较小NTC和NRC均无较高的峰出现,荧光定量PCR-扩增效率,r2: 0.951 Slope: -3.58 -3.10E: 90%110%,r2=0.999 Slope= -3.364E=10（-1/slope）-1,荧光定量PCR- NTC,NTCNTC的最佳状况NTC不为零,荧光定量PCR标准数据参考范围,MIQE qPCR国际标准,提出发表文章时所要求的最低限度的必要信息标准。对QPCR的术语；概念；研究与临床应用；样本的采集、处理和制备；核酸的质量控制；反转录；QPCR过程；数据分析等方面的操作标准和规范都做了详尽的阐述。,Report,Thank you for your attention!,