线虫实验11课件.ppt

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1、线虫实验,1,开设线虫有关实验的目的意义,线虫作为模式生物，与酵母、果蝇、斑马鱼、小鼠和拟南芥等一起，为生命科学的发展做出了极大的贡献。目前，国内外众多的科研机构都在以线虫作为研究材料，在RNAi、衰老、药物筛选、功能基因组学等领域进行研究北京生命科学研究所 、遗传与发育生物学研究所、北京大学 、军事医学科学院、 东南大学等单位,2,2002诺贝尔奖,Brenner, Horvitz & Sulston “For their discoveries concerning genetic regulation of organ development and programmed cell de

2、ath.”,3,2006诺贝尔奖,for their discovery of RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA,Andrew Z. Fire,Craig C. Mello,Fire A, et al. Potent and specific genetic interference by double-strand RNA in Caenorhabditis elegans. Nature, 1998,391:806-811,4,2008诺贝尔奖,for the discovery and development

3、 of the green fluorescent protein, GFP,Martin ChalfieColumbia University New York, USA,5,Expression of GFP from a first stage C. elegans larva (Chalfie et al., 1994).,The two touch receptor neurons ALMR and PLMR are fluorescence-labelled at their cell bodies, leading to the strongly fluorescing two

4、dots in the figure. Fluorescing processes can be seen projecting from both of these cell bodies. Halos produced from the out-of-focus of homologues of these cells on the other side of the animal are indicated by arrow heads. The thick arrow points to the nerve ring branch from the ALMR cell (out of

5、focus); the thin arrows point to weakly fluorescing cell bodies.,6,Postdoctoral position, Vatamaniuk Lab, Cornell,A postdoctoral position is available in a young research group at Cornell University to study genetic and biochemical interactions of ATP-bindings cassette (ABC) transporters and the mol

6、ecular mechanisms of their function in detoxification of heavy metals. We seek highly motivated, responsible, and talented individuals with extensive experience in molecular genetics and at least some basic experience in protein biochemistry. Experience with C. elegans work is desirable. Interested

7、applicants should send a CV and the names and contact information of 3 persons who can provide a letters of reference. Please send information by email to okv2cornell.edu.,7,实验原理,线虫的生物学,8,线虫的生物学,通常所说的线虫特指秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)是一种很小的蠕虫。秀丽隐杆线虫成体长仅1mm，全身透明，以细菌为食，居住在土壤中，全身共有959个细胞。线虫整个的生命周期仅3天（2

8、5）。野生型线虫胚胎发育中细胞分裂和细胞系的形成具有高度的程序性，这样就便于对其发育进行遗传学分析。,9,线虫的生物学,秀丽隐杆线虫有5对常染色体和1对性染色体；性别为雌雄同体或雄性（自然群体中为千分之一）；杂交时，后代雌雄比例为1：1成虫一生可产300个受精卵；有大量突变株；可以用-80冰箱长期保存线虫基因组测序1998年完成,10,Life cycle of C. elegans,temperature-dependent15,5.5day;20,3.5day;25,2.5day,11,线虫的发育,12,线虫的发育,13,.GGTATCCATTAGGTAT,?,1-dimensional

9、genetic information100,281,416 bp 20,000 genes,1 cell at fertilization to 959/1031 cells in adult4-dimensional processes of development,14,线虫的性别,雌雄同体雄性,15,线虫的突变体（一）,a:wild type b:dummpy c:small d:long,16,线虫的突变体（二）,运动类型突变,17,18,实验目的,学会线虫的饲养技术；观察线虫的形态特征；,19,实验安排,时间安排：本周准备各种材料，观察并接种培养下周“细胞凋亡诱导与观察”再下周“环

10、境因素对线虫基因表达的影响”分组安排：按4-8人为一小组,20,实验内容,准备线虫培养与实验所需要的培养基、试剂等大肠杆菌OP50的培养LB液体培养基 【200ml】 2g蛋白胨, 1 g 酵母粉, 1 g NaCL, 加水至200ml,1,21,实验内容,1M MgSO4溶液 【100ml】1MCaCl2溶液 【100ml】1M磷酸盐缓冲液 【200ml】 （配方：108.3gKH2PO4，35.6gK2HPO4，加水至1L ）,2,3,4,灭菌,22,实验内容,线虫培养基 【1000ml】17g琼脂、3gNaCl、2.5g peptone，加入蒸馏水（自来水亦可）987ml 灭菌后加入：5

11、mg/ml胆固醇1.0ml 25ml 1M磷酸盐缓冲液1ml MgSO41ml CaCl2,5,23,实验内容,M9 缓冲液 【500ml】1.5g KH2PO4, 3gNa2HPO4, 2.5gNaCl, 加水到500mL灭菌后加0.5ml 1M MgSO4,6,24,实验内容,K medium 【200ml】52mM NaCl，32mM KCl灭菌并倒平板,7,8,25,实验内容,每组培养皿包扎、灭菌观察接种野生型和转基因品系各1皿,26,实验要求,小组内的充分讨论各小组间的配合提问,27,作业,查找线虫的资料,28,重金属诱导的线虫细胞凋亡,29,实验目的,了解线虫同步化培养的技术了解荧

12、光显微镜的使用学习细胞凋亡的实验研究基本技术，巩固理论知识,30,原理,细胞凋亡(apoptosis)是指细胞在一定的生理或病理条件下，受内在遗传机制的控制自动结束生命的过程。蝌蚪变态时，尾部细胞退化也是一种程序性死亡,31,原理,凋亡细胞核表现为染色增强、荧光更为明亮，呈圆形、固缩状或团块状；非凋亡细胞核呈正常形态，荧光深浅不一；荧光染料染色后，在荧光显微镜下清晰可辨。,32,凋亡细胞的核固缩，更亮,33,原理,重金属如镉、铜等处理能引起线虫的细胞凋亡吖啶橙能透过细胞膜，嵌入细胞核DNA，使之发出明亮的绿色荧光,34,实验操作,线虫的培养OP50接种于LB液体中，37培养12-24hr；倒N

13、GM平板，涂OP50菌液200微升，培养过夜备用挖取一小块带有线虫的琼脂，接种；或用M9缓冲液洗下线虫，接种到NGM平板20培养,35,实验操作,同步化怀卵成虫用3mlM9洗下，放入5ml的塑料试管，加入0.8ml20%次氯酸钠，0.4ml0.5M的NaOH处理10min，观察，虫体破裂5500转离心1min，弃上清4mlM9洗涤2次加入4mlM9，混匀转入培养皿中，20孵化24hr离心5500转1min，吸取上清弃去，留300-400微升混匀后，接种于NGM上，20培养，约64hr达早期成虫,36,实验操作,细胞凋亡诱导观察M9洗下，离心，洗涤1-2次；K medium中加入少量OP50菌液

14、，将重金属母液加入，使终浓度为25、50、100、200uM， 24（96）微孔板，处理线虫12-24hr离心，0.5mlM9（加少量OP50）悬浮细胞，加入5-10微升的吖啶橙溶液（150-200ug/ml），避光染色1.5hr，注意设置对照离心，M9洗涤，回接到NGM上恢复培养30min解剖镜下挑取，放载玻片上M9液滴中，荧光显微镜观察（蓝光波长）,37,实验操作,观察线虫生殖细胞：凋亡细胞的核为亮绿色或黄色正常细胞的核为淡绿色,38,今天工作,OP50接种LB，37培养过夜OP50菌液涂NGM平板， 37培养过夜观察线虫形态,39,作业,根据时间，设计方案，使恰好可以在下周实验课的时间观

15、察凋亡细胞,40,环境因素诱导线虫基因表达,41,目的,理解环境影响基因表达的作用巩固荧光显微镜的使用了解GFP作为活体标记基因在生物学研究中的意义,42,原理,热休克蛋白 Heat Shock Proteins (HSPs),是在从细菌到哺乳动物中广泛存在一类热应急蛋白质。当有机体暴露于高温的时候，就会由热激发合成此种蛋白，来保护有机体自身。,43,原理,除环境高温以外，其他应激原如缺氧、寒冷、感染、饥饿、创伤、中毒等也能诱导细胞生成HSP。因此， HSP又称应激蛋白（stress protein, SP）,44,原理,线虫TJ375品系是转基因品系，表型与野生型相同，所转基因为hsp16:

16、GFP融合基因 。,45,原理,环境中存在不利于生存的条件时，在较短时间内，细胞内就会产生hsp蛋白。TJ375品系则会合成hsp-gfp融合蛋白，在荧光显微镜下，gfp受激发而呈现绿色。,46,47,实验操作,在解剖镜下挑取TJ375品系中的成年个体；35处理30min，设置未处理对照荧光显微镜下蓝光观察，比较对照与处理间的GFP表达差异,48,今天的工作,接种线虫，进行培养；分组依次进行GFP表达观察；继续微核实验；继续果蝇杂交实验统计；,49,今天工作,4人一组进行2只凹面载玻片，各滴1滴M9；解剖镜下各挑取1条野生型tj375放入一只载玻片进行高温处理，另一只做对照也可以尝试其他因素处理，时间以不导致线虫死亡为宜。,50,实验报告,通过查找资料，对你所观察到的GFP表达差异进行分析，给出解释。,51,open-ended experiment创新性实验,52,