大豆抗原蛋白课件.ppt

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1、大豆抗原蛋白研究进展,郭鹏飞 博士2009.4 .22 上海,MAFIC对大豆抗营养因子的研究历程, 1986 - 1990年（美国） “Transient hypersensitivity to soybean meal in the early weaned pig” “Effects of fat source & combinations on starter pig performance, nutrient digestibility & intestinal morphology” “Interrelationship between hypersensitivity to so

2、ybean proteins and growth performance in early-weaned pigs” 1990 - 至今（国内） “利用酶联免疫法测定大豆胰蛋白酶抑制因子的研究” “膨化全脂大豆对仔猪抗营养作用机理研究” “大豆寡糖对仔猪抗营养作用机理研究” “大豆凝集素受体结构及其类似物作用机理研究” “有效失活大豆抗营养因子特异蛋白酶的筛选” “大豆抗原蛋白的免疫学特性及其对仔猪的致敏机理研究”,大豆中的抗营养因子,研究背景,仔猪断奶后腹泻的发生是影响养猪生产性能的一个 突出问题 全国80%以上的猪场会发生仔猪腹泻 仔猪腹泻的发生率在20-50%，死亡率20%以上 增重减

3、缓，生长抑制，甚至成为僵猪 饲料报酬降低，养殖效益下降 易发生继发性的疾病,研究背景,对仔猪断奶后腹泻诱因的不同观点：上世纪70年代以前，以兽医学为代表的一批学者提出了一种理论，即病原微生物是引起仔猪断奶后腹泻的根本原因但以营养学为代表的一批学者在后来的研究中提出了一种新的理论: 日粮抗原是引起仔猪断奶后腹泻的先决条件，病原微生物感染只是仔猪断奶后腹泻的继发性原因,大豆抗原蛋白,玉米-豆粕型日粮的广泛应用大豆中存在多种抗原蛋白大豆抗原蛋白是由 Duke等（1934）首次发现 婴儿过敏Castimapoolas等（1968，1969）从大豆中分离出4种抗原蛋白:,大豆抗原蛋白,Glycinin

4、由6个酸性多肽和6个碱性多肽组成的大分子蛋白（360 kDa），占 大豆籽实蛋白质总量的25-35%，球蛋白总量的40%。 -Conglycinin是一种分子量为180 kDa的糖蛋白，由3个亚基 、组成 三聚体（分子量分别为72、76、53 kDa），约占大豆籽实蛋白质总量的 30%左右。,Glycinin晶体结构,大豆抗原蛋白,大豆抗原蛋白造成肠道损伤是断奶后腹泻的原发性因素,Qiao等， 2003， AJAS, 16(1): 63-69.,大豆抗原蛋白与生长性能,大豆抗原蛋白使仔猪在断奶后第一周生长速度明显下降(P0.05),Li等，1990,1991,大豆抗原蛋白与绒毛形态,左上(4周

5、龄豆粕组)左下(8周龄豆粕组)右上(4周龄奶粉组)右下(8周龄奶粉组),Li等，1990（JAS,68:1790-1799）,大豆抗原蛋白与隐窝深度,大豆抗原蛋白使仔猪在断奶后1周和5周的隐窝深度增加,Li等，1990,1991,大豆抗原蛋白降低了断奶后一周仔猪的肠道绒毛高度，对断奶后5周仔猪没有影响,大豆抗原蛋白与仔猪断奶综合征,大豆抗原蛋白,生产性能,免疫机能,肠道形态,增重,采食量,淋巴细胞转化,血清抗体IgG,绒毛高度,隐窝深度, 2000-2003年，吉林农业大学以荷斯坦黑白花牛为试验对象，研究了生大豆粉和熟大豆粉对犊牛的生长性能、血清抗-conglycinin和glycinin抗体

6、效价、木糖吸收的影响。结果发现： 肠道吸收能力和增重明显下降；血清抗-conglycinin和glycinin抗体滴度显著升高；粗蛋白和脂肪的消化吸收率下降。,对犊牛的影响,孙泽威等，2003,对幼建鲤的影响, 2000-2003年，四川农业大学以幼建鲤为试验对象，研究了不同的大豆蛋白源（大豆分离蛋白SPI、去皮豆粕DSBM）对幼建鲤的生长性能和肠道免疫的影响。结果发现： 当饵料中SPI替代鱼粉的用量达60%时，肠道上皮细胞顶端脱落、固有层变宽，脾脏重显著降低，中后肠抗体水平显著升高； 当饵料中DSBM替代鱼粉的用量达50%时，肠道上皮细胞顶端脱落、固有层变宽，脾脏重显著降低，中后肠抗体水平显

7、著升高。,张锦秀等，2003, 研究成果：和国外研究一样，上述研究从不同的侧面探讨并证实了大豆抗原蛋白对幼龄动物的过敏反应性，从而为后续研究积累了资料，提供了非常有价值的技术参考。 存在的问题：由于纯的大豆蛋白难以获得，上述研究主要以大豆或大豆制品为材料，尚缺乏对glycinin、-conglycinin单个蛋白分子的致过敏作用的探讨，因此无法排除各种抗营养因子的互作影响。,研究成果及存在的问题,我们的研究结果,肥大细胞FcR 受体,大豆抗原蛋白致敏机理研究,大豆抗原致敏机理 血液和脾脏中CD4淋巴细胞数量及CD4/CD8显著升高，免疫机能处于紊乱状态 脾脏淋巴细胞及血液中的淋巴细胞过度增殖，

8、导致组织和器官中淋巴细胞浸润，引起免疫损伤 脾脏及血液中IL-4、 IL-5 、TNF-含量及 IL-4/IFN-显著升高，这些炎性因子进入肠道后，损伤肠道上皮，产生过敏症状 血清中IgE和IgG显著升高，发生速发型过敏反应 肠道肥大细胞数量显著增加，脱粒现象明显，组胺等致敏因子释放增多，引起肠道局部过敏反应,细胞免疫及体液免疫均受到抑制作用,研究抗原蛋白质敏机理的意义,（1）免疫耐受性理论的应用 仔猪断奶前饲喂足够的日粮蛋白质才能消除断奶后短暂的过敏反应，从而避免吸收不良综合症和临床腹泻的发生。有研究报道，断奶前至少要补充600克含22大豆蛋白质的饲料才能“形成”一个成熟的不受断奶应激影响的

9、消化系统，这对3周龄断奶仔猪难以实现，且成本很高，费时多。Miller等（1984b）建议对3周龄断奶仔猪断奶前不宜补料。（2）饲喂低蛋白质日粮低蛋白水平日粮可防止断奶后腹泻症的发生，这样不仅可以降低日粮成本，还可以减轻对肠道的损伤，两者结合足以抵消增重的损失，目前这种方法已有应用。（3）注射免疫佐剂 皮下注射1毫升免疫佐剂（一种水油乳剂）能增加仔猪免疫抑制细胞的生成数量，加速免疫耐受性的形成。,大豆抗原蛋白-Conglycinin,-Conglycinin对大鼠生长性能的影响,郭鹏飞、李德发等，2007,-conglycinin对大鼠肠道组织形态的影响,郭鹏飞、李德发等，2006,大鼠空肠形

10、态观察（10 40）,-conglycinin 大鼠肠道肥大细胞的影响,对照组,试验组,大鼠饲喂-conglycinin后小肠肥大细胞数量显著增加，脱粒现 象明显，肥大细胞释放的与过敏有关的细胞因子随之增加，表明大鼠处于过敏状态；同时，肥大细胞组胺的释放率增加，进而引起血管通透性增强，使大分子蛋白等营养物质漏入肠腔及水钠交换障碍，造成消化不良或腹泻。,郭鹏飞、李德发等，2006,-conglycinin对大鼠血液中对IgE水平影响(ng/mL ),总IgE,特异性IgE, 灌喂大豆-conglycinin 时，大鼠血液总IgE和特异性IgE 显著升高，表明大鼠呈超敏状态,郭鹏飞、李德发等，20

11、06,-conglycinin对淋巴细胞增殖能力及CD4、CD8细胞数量的影响,郭鹏飞、李德发等，2006,-conglycinin对大鼠血浆细胞因子浓度的影响,郭鹏飞、李德发等，2006,-conglycinin对断奶仔猪（38日龄）生产性能的影响,日增重,采食量,饲料转化率,-conglycinin对断奶仔猪生产性能的影响,郝月、李德发等，2008,-conglycinin对仔猪肠道组织结构的影响,绒毛高度,隐窝深度,-conglycinin对断奶仔猪肠道影响,郝月、李德发等，2008,-conglycinin对仔猪免疫机能的影响,郝月、李德发等，2008,大豆抗原蛋白 Glycinin,

12、仔猪对Glycinin的过敏反应,孙鹏、李德发等，2008,Glycinin对仔猪（24-28日龄）生产性能的影响, 日粮中添加2%以上的glycinin在短期内可显著影响仔猪的生长性能。,孙鹏、李德发等，2008,Glycinin对仔猪腹泻的影响, 日粮中添加2%以上的glycinin可不同程度地增加仔猪腹泻的发生率。,孙鹏、李德发等，2008,Glycinin对仔猪小肠内肥大细胞数量及组胺含量的影响, 日粮中添加 2%或 4% 的glycinin可显著增加仔猪空肠、回肠内组胺的释放量。,孙鹏、李德发等，2008,Glycinin对仔猪免疫机能的影响,孙鹏、李德发等，2008,小 结,大豆抗

13、原蛋白诱发幼龄动物发生过敏反应，进而影响机体消 化系统和免疫功能，抑制动物的生长。大豆抗原蛋白显著升高了动物血浆中的IgE水平、小肠内肥大 细胞数量和肠道组胺含量，导致体液免疫功能亢进，从而诱 发动物发生速发型过敏反应大豆抗原蛋白显著提高了动物淋巴细胞转化率和淋巴细胞亚 群CD4+细胞数量，淋巴细胞的过度增殖、分化及其分泌的 炎性介质增多，导致动物细胞免疫功能显著亢进，从而诱发 迟发型过敏反应 孙鹏等（2008）研究报道，仔猪每天口服 1 g 维生素C可降低过敏仔猪血清中IgE抗体水平，抑制肠道组胺的释放，减少仔猪过敏性腹泻，促进仔猪生长，缓解大豆抗原蛋白Glycinin对仔猪的致敏作用,大豆

14、抗原蛋白检测,不同大豆产品中glycinin和-conglycinin的含量,不同加工厂膨化大豆产品中glycinin和-conglycinin的含量,大豆抗原蛋白的检测方法,定量检测：缺乏准确有效的测定方法间接 酶联免疫测定（蛋白测定试剂盒）：抗体缺乏特异性，不准确 火箭免疫电泳 ：具有较高的准确度和灵敏度，但是操作相对繁杂多克隆抗体检测：多克隆抗体具有生产成本低，操作简单，抗体产量高等优点，但是由于这种抗体来源于动物血清，含有较多的杂蛋白质，因此，抗血清的效果不稳定，重复性较差。单克隆抗体检测：抗体制备困难，针对性难评定,定性检测： SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,大豆抗原蛋白的分离提纯, W

15、u et al. (2000)：酸碱法分离glycinin、-conglycinin（沉降系数、等电点） Saito et al. (2001): 植酸酶降解 Duranti (2002)：尿素 蛋白变性 亚基色谱分离（意大利专利） Kazunobu et al. (2004)：胃蛋白酶 分解glycinin -conglycinin木瓜蛋白酶分解-conglycinin glycinin,单克隆抗体的制备及抗原蛋白定量检测方法的建立, 免疫学方法是研究抗原蛋白致过敏机理的一个基本方法 抗体制备是免疫学研究的一个常用手段 抗体：多抗/单抗 本试验拟以抗大豆-conglycinin单克隆抗体为工

16、具，建立-conglycinin免疫学检测方法（ELISA），并为定量测定和研究大豆制品中的抗原蛋白含量奠定基础。,游金明、李德发等，2006,抗-congylcinin单克隆抗体的特性, 属于IgG1型抗体 能识别-conglycinin分子的 和 亚基, 大豆-congylcinin定量检测方法的建立 竞争性ELISA校正曲线的建立 IC50为 4.7 ng/mL 检测限为 2.0 ng/mL 线性工作范围为2.0-11.5 ng/mL,单抗的成功制备为进一步研究-conglycinin在仔猪小肠上皮细胞上的吸收与分布情况提供了一个有效的工具；以单抗为基础的定量方法的建立也为检测大豆、大豆

17、制品中-conglycinin的含量，为研究-conglycinin在体内的降解规律和致过敏机理提供了一个科学的分析手段,游金明、李德发等，2006,游金明、李德发等，2007,不同加工方式中-conglycinin含量,对照,大豆 -congylcinin能广泛结合于仔猪小肠黏膜上皮细胞上,-congylcinin 处理组,游金明、李德发等，2006,大豆抗原蛋白的消除,大豆抗原蛋白glycinin和-conglycinin为对热稳定的抗营养因子，直接加热不能彻底破坏。育种：使生物体内的某个基因不起作用，称之为“基因敲除”（knock out）沉默”（silence）。目前，美国科学家成功培

18、育出过敏性低的大豆品种（尹红，2003）。日本京都大学也开发出一种不易引起过敏的低变应原大豆（张可喜，2002），热处理（膨化）：李德发等(1993)，Li等(1991b)和谯仕彦等(1995)对断奶仔猪的试验发现膨化加工的大豆饼粕能降低血清中抗Glycinin和-Conglycinin IgG的效价，并能减轻仔猪对大豆蛋白引起的迟发型过敏反应的程度及肠道损伤程度。化学法处理：有机溶剂提取。乙醇溶液提取和热处理（膨化）过程的组合工艺是有效降低大豆抗原蛋白的加工方式（Sisson 等，Rusette,1997）。微生物发酵法：提高豆粕蛋白的溶解度，利于消化；有效减小了豆粕中蛋白的分子量，减少抗原

19、蛋白含量，其中的一部分已达到小肽水平甚至氨基酸水平，可以直接被动物吸收。,大豆抗原蛋白的消除方法,膨化全脂大豆与生产性能,膨化全脂大豆显著改善仔猪的生产性能(P0.05),膨化全脂大豆与仔猪肠道形态,膨化全脂大豆显著改善肠道吸收状况(P0.05),m,发酵豆粕中抗原蛋白含量变化,上海源耀公司，2006,结 语,经过几十年的研究，尽管人们对大豆中营养因子的化学结构和理化特性、生理作用、抗营养机制有了一定的了解，抗营养因子的钝化技术也有所发展，但是在大豆及大豆制品的实际运用中，还有很多问题没有得到解决。 就目前研究状况来看，热处理是应用最广泛的方法，但在工艺上仍需继续精进，且对于热稳定性高或热加工不足以有效地灭活的抗营养因子，人们必须要不断地研究新的方法加以消除。至于化学钝化，与生产应用尚有距离，还应特别关注化学钝化试剂的安全性问题。开发新的技术是提高大豆制品营养价值及应用效果的关键。,Thank You !,