生物化学与分子生物学（全套ppt课件）.ppt

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1、生物化学与分子生物学,一生物化学与分子生物学的定义, 生物化学是用化学的理论和方法研究生命现象的科学。分子生物学是研究生物大分子结构和功能的学科。生物化学与分子生物学是同一个二级学科,在大学本科阶段可以作为两门课开设, 也可以作为一门课开设.,绪论,二生物化学与分子生物学的研究范畴,（一）生物体的组成物质复杂性组成物质多；分子大；空间结构复杂。规律性元素构件小分子聚合物（生物大分子）；结构与功能相适应。,（二）物质和能量代谢,复杂性多步化学反应构成代谢途径；多条代谢途径相互交织成网；物质代谢和能量代谢相互交织；调节控制有条不紊。,规律性反应类型不多；反应机理符合有机化学理论；调节控制与生物学功

2、能相适应。,（三）信息分子的生物合成,复杂性合成过程复杂；调节控制复杂；与生命现象的关系复杂。,规律性遗传密码已经破译；基因表达的基本过程已经清楚；生物大分子结构与功能的关系逐渐明晰；研究方法日新月异。,三.生物化学与分子生物学同生产实践的关系,启蒙阶段食品选择和加工；医疗。发展阶段维生素、抗生素医疗；代谢食品、医疗；分子生物学 基因工程、蛋白质工程。,发展前景生物制品；转基因动植物；基因芯片；基因诊断；基因治疗。,四.生物化学的发展史,1.炼金术阶段: 现代化学起源于炼金术(alchemy)。换言之，炼金活动是化学的前史。“ chemistry” 一词也来自alchemy, 而alchemy

3、 = al (the) + chem, 其中的chem来自中国的“ 金” 的古汉语发音。炼金术在各个古代文明中都占重要位置, 并不是中国特有, 一般而言都是如何将铜, 铅, 锡变成金、银这样的贵金属的实用学问。在西方, 炼金术从公元前几百年开始到17世纪为止, 延续了2000年；在中国也生存了差不多同样长的时间。中国的炼金术除了得到贵金属以外，还致力于研制长生不老之药“ 金丹”。因此, 中国的炼金术的化学成份比其他古代文明要浓。 中国的炼金术随丝绸之路传到了阿拉伯文化圈, 所以有了alchemy这个行业。 西腊文明在欧州历史上曾一度失传, 幸好阿拉伯人继承了其精华(714世纪), 1113世纪

4、十字军的侵略将散落在阿拉伯文化中的希腊文化又带回了欧洲, 也顺便将中国的炼金术带进入了西方文明。此后，西方的炼金术活动朝着独自的方向发展，特别是对酸, 碱, 盐等物质的化学性质有了相当的知识积累。,2.从炼金术到化学: 17世纪兴起的文艺复兴活动使alchemy真正向现代的chemistry过渡。 当时的化学家, 要么是贵族, 要么是业余爱好。在与英国的Newton同时期的贵族Robert Boyle (1627-1691) 对气体和真空进行了研究, 写了“ The Sceptical Chymist (1661)” 一书, 主张决别带有神秘色彩的炼金术, 而以理性思考的态度来研究化学。他发现

5、了波以尔法则 PV=Const, 实际上就是现代物理化学的起点。1662英国设立了 Royal Society, 1666年 Paris Academia 分别设立, 为科学研究和交流提供了土壤。这是化学与炼金术决别的标志。 随后,空气中含有不同成分1764年CO2 (Black), 1766年H2 (Canvendish), 1772年O2 (Sheele), 1772年N2 (Ratherford) , 1774年Cl2 (Sheele), 相继被发现。1774年Lavoisier确立了物质不灭定理, 1777年确立了燃烧理论。此后的化学反应的定比例法则 (Joseph Louis Pro

6、ust, 1799) 及化学元素分析方法的发展, 为有机化学的出现奠定了基础。,3.有机化学的发展 简单的说, 有机化学就是H, C, N, O的化学。 其发展是必然的, 因为人对生命物质的兴趣要比对非生命物质更浓。化学分析的手段发展后, 势必要用来研究有机的物质。通过有机化学研究知道的物质结构, 成为生物化学研究的起点。 有机化学的发展, 是从尿素的合成开始的。 1828年 Wohler (德) 从无机盐合成了尿素 1831年 Liebig (德) 有机物元素分析定量法的发明 1840年 有机基团 (group) 的概念的形成 1848年 Pasteur (法) 酒石酸的光学异构体的发 18

7、58年 Kekule (德) C原子的四价理论 1865年 Kekule (德) Benzen环结构的发现 1869年 元素周期表的确立 1874年 vant Hoff (荷) C4的正四面体结构 1884年 Fischer (德) 糖的化学结构研究的开始,4.生物化学重大发展年代表,1897年 Buchner 发现酵母细胞质能使糖发酵1902年 Fischer 肽键理论1926年 Sumner结晶得到了脲酶,证明酶就是蛋白质1935年 Schneider将同位素应用于代谢的研究 1944年 Avery等人证明遗传信息在核酸上 1953年 Sanger的胰岛素氨基酸序列测定 Waston-Cl

8、ick提出DNA 双螺旋模型 1958年 Perutz等解明肌红蛋白的立体结构 1970年 发现了DNA限制性内切酶 1972年 DNA重组技术的建立 1978年 DNA双脱氧测序法的成功 1990年 人类基因组计划的实施,2003年完成,进入 后基因组时代,生物化学中的关键技术,电泳（1923） 生物大分子的分离、分析超离心（1925）蛋白质、细胞亚器官的 分离；分子量的确定同位素标记（1934）物质代谢途径、生物大分子结构测定层析（1944 ） 生物大分子的分离纯化X-光衍射、NMR：生物大分子结构测定,五生物化学与分子生物学 同有关学科的关系,生物化学与分子生物学是生物学的最深层次；生物

9、化学与分子生物学是化学的最高层次；生物化学与分子生物学为农学、医学和食品科学提供理论依据和研究手段；物理学、信息科学和数学为生物化学与分子生物学提供研究手段。,课外阅读书籍,Lehninger ：Principles of Biochemistry Stryer：Biochemistry 王镜岩生物化学 沈仁权生物化学教程 郑集普通生物化学 Garrett,and Grisham: Biochemistry (影印版) 罗纪盛等 生物化学简明教程 朱玉贤 李毅 现代分子生物学 Robert F.Weaver: Molecular biology (影印版),六学习方法,积极培养学习的兴趣；记忆

10、与理解相互促进；注重阅读和练习；注重学习科学思维的方法和实验技能；注重与数理化特别是化学知识的联系；注重与生物学功能的联系。,蛋白质的结构与功能,第一章,Structure and Function of Protein,什么是蛋白质?,蛋白质(protein)是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物。,蛋白质研究的历史,1833年，Payen和Persoz分离出淀粉酶。1838年，荷兰科学家 G. J. Mulder引入“protein”（源自希腊字proteios，意为primary）一词 1864年，Hoppe-Seyler从

11、血液分离出血红蛋白，并将其制成结晶。19世纪末，Fischer证明蛋白质是由氨基酸组成的，并将氨基酸合成了多种短肽 。,1951年, Pauling采用X（射）线晶体衍射发现了蛋白质的二级结构-螺旋(-helix)。 1953年，Frederick Sanger完成胰岛素一级序列测定。 1962年，John Kendrew和Max Perutz确定了血红蛋白的四级结构。20世纪90年代以后，随着人类基因组计划实施，功能基因组与蛋白质组计划的展开 ，使蛋白质结构与功能的研究达到新的高峰 。,蛋白质的分子组成The Molecular Component of Protein,第一节,蛋白质的生物

12、学重要性,分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。含量高：蛋白质是生物体中含量最丰富的生物大分子，约占人体固体成分的45%，而在细胞中可达细胞干重的70%以上。,1. 蛋白质是生物体重要组成成分,作为生物催化剂（酶）代谢调节作用免疫保护作用物质的转运和存储运动与支持作用参与细胞间信息传递,2. 蛋白质具有重要的生物学功能,3. 氧化供能,组成蛋白质的元素,主要有C、H、O、N和 S。 有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘 。,各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16。,由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可

13、以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：,100克样品中蛋白质的含量 (g %)= 每克样品含氮克数 6.25100,1/16%,蛋白质元素组成的特点,一、组成人体蛋白质的20种L-氨基酸,存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属 L-氨基酸（甘氨酸除外）。,C,+,N,H,3,C,O,O,-,H,除了20种基本的氨基酸外，近年发现硒代半胱氨酸在某些情况下也可用于合成蛋白质。硒代半胱氨酸从结构上来看，硒原子替代了半胱氨酸分子中的硫原子。硒代半胱氨酸存在于少数天然蛋白质中，包括过氧化物酶和电子传递链中的还原酶等。硒代半胱氨酸参与蛋白质合成时，并不是由目前已知的密

14、码子编码，具体机制尚不完全清楚。,体内也存在若干不参与蛋白质合成但具有重要生理作用的L-氨基酸，如参与合成尿素的鸟氨酸（ornithine）、瓜氨酸（citrulline）和精氨酸代琥珀酸（argininosuccinate）。,非极性脂肪族氨基酸极性中性氨基酸芳香族氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸,二、氨基酸可根据侧链结构和理化性质进行分类,(一)侧链含烃链的氨基酸属于非极性脂肪族氨基酸,(二)侧链有极性但不带电荷的氨基酸是极性中性氨基酸,甲硫氨酸,(三)侧链含芳香基团的氨基酸是芳香族氨基酸,(四)侧链含负性解离基团的氨基酸是酸性氨基酸,(五)侧链含正性解离基团的氨基酸属于碱性氨基酸,几种特殊氨基

15、酸,脯氨酸（亚氨基酸）, 半胱氨酸,胱氨酸,在蛋白质翻译后的修饰过程中，脯氨酸和赖氨酸可分别被羟化为羟脯氨酸和羟赖氨酸。蛋白质分子中20种氨基酸残基的某些基团还可被甲基化、甲酰化、乙酰化、异戊二烯化和磷酸化等。这些翻译后修饰，可改变蛋白质的溶解度、稳定性、亚细胞定位和与其他细胞蛋白质相互作用的性质等，体现了蛋白质生物多样性的一个方面。,三、20种氨基酸具有共同或特异的理化性质,两性解离及等电点,氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。,等电点(isoelectric point, pI) 在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时

16、溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。,（一）氨基酸具有两性解离的性质,pH=pI,pHpI,pHpI,氨基酸的兼性离子,阳离子,阴离子,（二）含共轭双键的氨基酸具有紫外吸收性质,色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在 280 nm 附近。,大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。,芳香族氨基酸的紫外吸收,（三）氨基酸与茚三酮反应生成蓝紫色化合物,氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm处。由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。,四、氨基酸通过肽键连接而形成蛋白质或活性肽,

17、肽键(peptide bond)是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。,（一）氨基酸通过肽键连接而形成肽,+,甘氨酰甘氨酸,肽键,肽(peptide)是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。,两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽,肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。,由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。,N 末端：多肽链中有游离-氨基的一端C 末端：多肽链中有游离-羧基的一端,多肽链有两端：,多肽链(polypeptid

18、e chain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。,N末端,C末端,牛核糖核酸酶,蛋白质是由许多氨基酸残基组成、折叠成特定的空间结构、并具有特定生物学功能的多肽。一般而论，蛋白质的氨基酸残基数通常在50个以上，50个氨基酸残基以下则仍称为多肽。,（二）体内存在多种重要的生物活性肽,1. 谷胱甘肽(glutathione, GSH),GSH过氧化物酶,GSH还原酶,NADPH+H+,NADP+,GSH与GSSG间的转换,体内许多激素属寡肽或多肽,神经肽(neuropeptide),2.多肽类激素及神经肽,蛋白质的分子结构The Molecular Structure of Protei

19、n,第二节,蛋白质的分子结构包括:,一级结构(primary structure)二级结构(secondary structure)三级结构(tertiary structure)四级结构(quaternary structure),定义:蛋白质的一级结构指在蛋白质分子从N-端至C-端的氨基酸排列顺序。,一、氨基酸的排列顺序决定蛋白质的一级结构,主要的化学键:肽键，有些蛋白质还包括二硫键。,一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础，但不是决定蛋白质空间构象的唯一因素。,目前已知一级结构的蛋白质数量已相当可观，并且还以更快的速度增加。国际互联网有若干重要的蛋白质数据库，例如EMBL（Eur

20、opean Molecular Biology Laboratory Data Library）Genbank （Genetic Sequence Databank）PIR（Protein Identification Resource Sequence Database）收集了大量最新的蛋白质一级结构及其他资料，为蛋白质结构与功能的深入研究提供了便利。,二、多肽链的局部主链构象为蛋白质二级结构,主要的化学键：氢键,-螺旋 ( -helix) -折叠 (-pleated sheet) -转角 (-turn) 无规卷曲 (random coil),蛋白质二级结构,所谓肽链主链骨架原子即N（氨基氮

21、）、 C（-碳原子）和Co（羰基碳）3个原子依次重复排列。,（一）参与肽键形成的6个原子在同一平面上,参与肽键的6个原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所处的位置为反式(trans)构型，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元 (peptide unit) 。,-螺旋 ( -helix) -折叠 (-pleated sheet) -转角 (-turn) 无规卷曲 (random coil),（二）-螺旋结构是常见的蛋白质二级结构,蛋白质二级结构,（二）-螺旋结构是常见的蛋白质二级结构,（三）-折叠使多肽链形成片层结构,（四）-转角和无规卷曲在蛋白质分子中普遍存在,-

22、转角,无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。,（五）二级结构可组成蛋白质分子中的模体,在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个有规则的二级结构组合，被称为超二级结构。,二级结构组合形式有3种：， 。,二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，称为模体(motif) 。,模体是具有特殊功能的超二级结构。,钙结合蛋白中结合钙离子的模体,锌指结构,-螺旋-转角（或环）-螺旋模体链-转角-链模体链-转角-螺旋-转角-链模体,模体常见的形式,（六）氨基酸残基的侧链影响二级结构的形成,蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。一

23、段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成-螺旋或-折叠，它就会出现相应的二级结构。,三、多肽链在二级结构基础上进一步折叠形成三级结构,整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。,定义:,（一）三级结构是指整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置,肌红蛋白 (Mb),（二）结构域是三级结构层次上的独立功能区,分子量较大的蛋白质常可折叠成多个结构较为紧密且稳定的区域，并各行其功能，称为结构域 (domain) 。,大多数结构域含有序列上连续的100至200个氨基酸残基，若用限制性蛋白酶水解，含多个结构域的蛋白质常分解出独立的结构域，而各结构域的构象可以基本不改变，并保持其

24、功能。超二级结构则不具备这种特点。因此，结构域也可看作是球状蛋白质的独立折叠单位，有较为独立的三维空间结构。,3-磷酸甘油醛脱氢酶亚基的结构示意图,（三）蛋白质的多肽链须折叠成正确的空间构象,分子伴侣(chaperon)通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构。,分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，如此重复进行可防止错误的聚集发生，使肽链正确折叠。,分子伴侣也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。,分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫键的正确形成起了重要的作用。,亚基之间的结合主要是氢键和离子键。,四、含有二条以上多肽链的蛋白质具有四级结构,蛋

25、白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。,许多功能性蛋白质分子含有2条或2条以上多肽链。每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基 (subunit)。,由2个亚基组成的蛋白质四级结构中，若亚基分子结构相同，称之为同二聚体(homodimer)，若亚基分子结构不同，则称之为异二聚体(heterodimer)。,血红蛋白的四级结构,五、蛋白质的分类,根据蛋白质组成成分:,根据蛋白质形状:,蛋白质家族（protein family） : 氨基酸序列相似而且空间结构与功能也十分相近的蛋白质。属于同一蛋白质家族的成员，称为同源蛋白质（homologous

26、protein） 。,蛋白质超家族（superfamily） : 2个或2个以上的蛋白质家族之间，其氨基酸序列的相似性并不高，但含有发挥相似作用的同一模体结构。,蛋白质结构与功能的关系The Relation of Structure and Function of Protein,第三节,（一）一级结构是空间构象的基础,一、蛋白质一级结构是高级结构与功能的基础,天然状态，有催化活性,尿素、 -巯基乙醇,去除尿素、-巯基乙醇,非折叠状态，无活性,（二）一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构与功能,一级结构相似的多肽或蛋白质，其空间构象以及功能也相似。, 氨基酸残基序号胰岛素 A5 A6 A10

27、 A30 人 Thr Ser Ile Thr 猪 Thr Ser Ile Ala 狗 Thr Ser Ile Ala 兔 Thr Gly Ile Ser 牛 Ala Gly Val Ala 羊 Ala Ser Val Ala 马 Thr Ser Ile Ala,（三）氨基酸序列提供重要的生物进化信息,一些广泛存在于生物界的蛋白质如细胞色素(cytochrome C)，比较它们的一级结构，可以帮助了解物种进化间的关系。,（四）重要蛋白质的氨基酸序列改变可引起疾病,例：镰刀形红细胞贫血,这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。,肌红蛋白/血红蛋白含有血红素辅基,血红素结构,二、蛋白质

28、的功能依赖特定空间结构,（一）血红蛋白亚基与肌红蛋白结构相似,肌红蛋白(myoglobin，Mb),肌红蛋白是一个只有三级结构的单链蛋白质，有8段-螺旋结构。血红素分子中的两个丙酸侧链以离子键形式与肽链中的两个碱性氨基酸侧链上的正电荷相连，加之肽链中的F8组氨酸残基还与Fe2+形成配位结合，所以血红素辅基与蛋白质部分稳定结合。,血红蛋白(hemoglobin，Hb),血红蛋白具有4个亚基组成的四级结构，每个亚基可结合1个血红素并携带1分子氧。Hb亚基之间通过8对盐键，使4个亚基紧密结合而形成亲水的球状蛋白。,脱氧Hb亚基间和亚基内的盐键,Hb与Mb一样能可逆地与O2结合， Hb与O2结合后称为

29、氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。,（二）血红蛋白亚基构象变化可影响亚基与氧结合,肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线,协同效应(cooperativity),一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。 如果是促进作用则称为正协同效应 (positive cooperativity)如果是抑制作用则称为负协同效应(negative cooperativity),血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中，继而引起肽链位置的变动。,别构效应(allosteric effec

30、t),蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，称为别构效应。,（三）蛋白质构象改变可引起疾病,蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。,蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。,这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。,疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作

31、用下可转变成全为-折叠的PrPsc，从而致病。,疯牛病中的蛋白质构象改变,第四节,蛋白质的理化性质The Physical and Chemical Characters of Protein,一、蛋白质具有两性电离的性质,蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。,当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。,蛋白质的等电点( isoelectric point, pI),二、蛋白质具有胶体性质,蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万

32、至100万之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。,颗粒表面电荷水化膜,蛋白质胶体稳定的因素:,水化膜,带负电荷的蛋白质,溶液中蛋白质的聚沉,三、蛋白质空间结构破坏而引起变性,在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。,蛋白质的变性(denaturation),造成变性的因素:如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等 。,应用举例:临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。此外, 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。,若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素

33、后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation) 。,天然状态，有催化活性,尿素、 -巯基乙醇,去除尿素、-巯基乙醇,非折叠状态，无活性,在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。,蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。,蛋白质沉淀,蛋白质的凝固作用(protein coagulation),四、蛋白质在紫外光谱区有特征性吸收峰,由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的A280与

34、其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。,蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。,蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。,五、应用蛋白质呈色反应可测定蛋白质溶液含量,茚三酮反应(ninhydrin reaction),双缩脲反应(biuret reaction),第五节,蛋白质的分离纯化与结构分析The Separation and Purification and Structure Analysis of Protein,一、透析及超滤法可去除蛋白质溶液中的小分子化合物,应用正压或离心力使蛋白质溶

35、液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。,透析(dialysis),超滤法,利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。,二、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀是常用的蛋白质浓缩方法,使用丙酮沉淀时，必须在04低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。,盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。,免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性

36、质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。,三、利用荷电性质可电泳分离蛋白质,蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳(elctrophoresis) 。根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。,几种重要的蛋白质电泳:,四、应用相分配或亲和原理可将蛋白质进行层析分离,待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离

37、的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。,层析(chromatography)分离蛋白质的原理,离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。,蛋白质分离常用的层析方法,五、利用蛋白质颗粒沉降行为不同可进行超速离心分离,超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。,蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient, S)表

38、示，沉降系数与蛋白质的密度和形状相关 。,因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。,六、应用化学或反向遗传学方法可分析多肽链的氨基酸序列,分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成,测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基,把肽链水解成片段，分别进行分析,测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法,一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。,通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列,按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列,分离编码蛋白质的基因,

39、测定DNA序列,排列出mRNA序列,离子交换层析分析蛋白质的氨基酸组分,人血红蛋白双向肽图,肽的氨基酸末端测定法,七、应用物理学、生物信息学原理可进行蛋白质空间结构测定,二级结构测定通常采用圆二色光谱(circular dichroism，CD)测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。 -螺旋的CD峰有222nm处的负峰、208nm处的负峰和198 nm处的正峰三个成分；而-折叠的CD谱不很固定。,三级结构测定X射线衍射法(X-ray diffraction)和核磁共振技术(nuclear magnetic resonance, NMR)是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。,同源模建：将待研究的序列与已知结构的同源蛋白质序列对齐补偿氨基酸替补、插入和缺失通过模建和能量优化计算，产生目标序列三维结构。序列相似性越高，预测的模型也越准确。折叠识别：通过预测二级结构、预测折叠方式和参考其它蛋白的空间结构，从而产生目标序列的三维结构。从无到有：根据单个氨基酸形成二级结构的倾向，加上各种作用力力场信息，直接产生目标序列三维结构。,根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构：,