丝状真菌的遗传课件.ppt

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1、第一节 粗糙链孢菌的遗传分析,生活史四分体遗传分析随机孢子遗传分析,粗糙链孢霉的生活史,图5-9红色链孢霉的生活史(引自Russell,1992),生活史,生殖方式,无性世代 ： 菌丝体 分生孢子 菌丝体有性世代 ：原子囊果+分生孢子 二倍体合子4个核8个子囊孢子,遗传分析,二倍体合子减数分裂形成四个单倍体子囊孢子，也称四分孢子。这四个减数分裂的产物不仅 留在一起，而且以直线方式排列在子囊中，所以又称顺序四分子（ordered tetred）。对四分体进行遗传分析，就叫四分子分析。,基本概念,真菌类的遗传学分析,主要以粗糙链孢菌(Neurospora crassa)和酵母菌(Saccharom

2、yces)为例。都是真菌，属于低等真核生物。,粗糙链孢菌的特点：,子囊孢子是单倍体，表型直接反映基因型。一次只分析一个减数分裂产物。体积小，易繁殖，易于培养。可进行有性生殖，染色体结构和功能类似于高等生物。,四分子分析(tetrad analysis)： 单一减数分裂的4个产物留在一起， 称为四分子。对四分子进行遗传学 分析称为四分子分析。,方法,无交换,发生交换,杂交后代分析 非交换型（1）+ + - - （+ + + + - - - -） （2）- - + + （- - - - + + + +） 交换型（3）+ - + - （+ + - - + + - -） （4）- + - + （- -

3、 + + - - + +） （5）+ - - + （+ + - - - - + +） （6）- + + - （- - + + + + - -）,第一次分裂分离,第二次分裂分离,MI模式,MII模式, , , , , , ,总结 ： 如果两个基因的分离发生在第一次减数分裂，则基因与着丝粒之间未发生重组;如果两个基因的分离发生在第二次减数分裂，则说明基因与着丝粒之间发生了重组。,着丝粒作图(centromere mapping),链孢霉的野生型又称为原养型(prototroph)， 子囊孢子按时成熟呈黑色。营养缺陷型(auxotroph)，只能在完全培养基上生长， 成熟较慢，子囊孢子呈灰白色。,p

4、rototroph,auxotroph,利用四分子分析法，测定基因与着丝粒之间的距离。,遗传分析,着丝粒距离=,如：将两种菌株进行杂交lys+ lys，得如下结果,Lys 基因与着丝粒之间的距离是7.3cM。,两个连锁基因的作图,P192,两对基因杂交，如不考虑孢子排列，只考虑性状组合时，子囊可以分为3种四分子类型。,亲二型(parental ditype , PD)，有两种基因型，并与 亲代相同。包括子囊型和。非亲二型(non-parental ditype ,NPD)，有两种基因型 都跟亲代不同，是重组型。包括子囊型和。四型（tetratype, T），有四种基因型，2种与亲代相 同，2种

5、重组型，包括子囊型、和。,下图是从染色体交换和重组来理解各类子囊的形成原因。,交换类型,染色体图象,重组,四分子类型,子囊型,无交换,四 线双交换,单交换,0%,100%,50%, a,n , a,n , a,n ,a , a , n , n,(PD), , na , na,(NPD), , a , n , na,(T),交换类型,染色体图象,重组,四分子类型,子囊型,二 线双交换,单交换,四 线多交换,50%,0%,100%, a,n ,a , na , , n,(T),a , n, a , n,(PD), na , , na,(NPD), a,n , a,n , a,n , na , a

6、, n,( T ),50%,三线双交换,资料分析：,计算nic与着丝粒之间的重组率：,2. 计算ade与着丝粒之间的重组率：,3. 判断 nic、ade 基因是独立分配还是连锁。,如果两个基因是自由组合的话，则PDNPD =11而实验结果PD=808+90=898，NPD=1+1=2，PD远远大于NPD。说明这两个基因是相互连锁的。,哪一种排列正确呢？,再让我们根据四分体来计算nic 和ade之间的重组频率，以便判断nic 和ade与着丝粒的相对位置。 依图9-5 知每一个四分体中均会含有四条染色单体，由于每个T型四分体中含有2条重组染色单体，每个NPD型的四分体中含有4条重组染色单体，每个P

7、D型四分体中不含重组染色单体，所以重组染色单体数目是 2 T + 4 NPD ；染色单体的总数是 4 (T + PD + NPD)，因此 nic 和ade 基因间的重组频率可根据下列公式计算：,重组染色单体数目 2 T + 4 NPD 重组频率 = _ 100% = _ 100% 染色单体总数目 4 (T + PD + NPD) 1 / 2 (90 + 5 +5) + (1+1) nic-ade重组率= _ 100% = 5.2% 1000,也就是说，nic 和ade之间的相对距离为5.2。由于nic 和着丝粒的距离为5.05，ade和着丝粒的距离为9.3，因此可以判定nic 和ade在染色体

8、上的排列顺序和相对距离为图: _ 。_nic_ade_ 5.05 5.20 9.3 图 nic 、ade和着丝粒之间的距离,由上图可见，通过着丝粒距离计算得到的ade与着丝粒距离为9.3，而由重组频率测得的距离为5.2 + 5.05 = 10.25。虽然两个数值相近，但并不相等。这是因为在着丝粒距离方法中，在求ade与着丝粒之间的距离时，是将所有第二次分裂分离型的子囊数加起来再除以二倍的总子囊数。在此将少量的在着丝粒和ade间发生双交换的子囊遗漏了，因此造成着丝粒与ade的距离偏低。,第二节 构巢曲霉,1、四分体无序 2、三种类型 3、P196,在构巢曲霉(A. nidulans)中，一次减数

9、分裂的全部产物虽然也同处于一个子囊内，但是其子囊孢子不象粗糙脉孢菌那样呈直线排列，而是无顺序的排列。 我们将这种不是以直线方式排列在一个子囊内的四个减数分裂产物称为非顺序排列四分体。,二、构巢曲霉有性杂交的遗传分析 构巢曲霉有性杂交产生的是非顺序排列的四分体，无法判断它们是属于第一次分裂分离还是第二次分裂分离，因此在粗糙脉孢菌中适用的通过第二次分离子囊数来计算着丝粒距离的方法，在构巢曲霉有性杂交中不适用。 但把四分体归纳为PD、NPD何T三种类型时，是以四分体中子囊孢子性状的组合方式划分的，没有考虑四分体中孢子的排列顺序。所以在构巢曲霉有性杂交中可采用四分体中PD、NPD和T的出现频率来进行遗

10、传分析。 另外，也可用随机孢子分析法来进行分析。,第三节 真菌的准性生殖(parasexual cycle)真菌在进行有性循环时，通过减数分裂可产生重组体，是实现基因重组的一条重要途径。但是有很多真菌，特别是半知菌亚门的真菌，没有或很少发生有性生殖过程，却仍然表现出了较高频率的变异，这种变异就是通过另一条独立于有性生殖的基因重组途径 _ 准性生殖。准性生殖是真菌的一种导致基因重组的过程，包括异核体的形成、二倍体的形成以及体细胞交换和单元化。,真菌的准性生殖(Parasexuality)是指异核体真菌菌丝细胞中两个遗传物质不同的细胞核可以结合成杂合二倍体的细胞核，这种二倍体细胞核在有丝分裂过程中

11、可以发生染色体交换和单倍体化，最后形成遗传物质重组的单倍体的过程。准性生殖和有性生殖的主要区别在于，有性生殖是通过减数分裂进行遗传物质重组和产生单倍体。而准性生殖是通过二倍体细胞核的有丝分裂交换进行遗传物质的重新组合，并通过产生非整倍体后不断丢失染色体来实现单倍体化的。,每一个分生孢子都有一个单个的核。任何一个孢子的表型都和它的基因型是一致的，这样便于鉴别。若将两个单倍体品系混合，菌丝融合，两种类型的核都同时存在胞质中，这种品系称为异核体（heterckaryon）。和其他品系一样，异核体将产生单核的分生孢子。在少数情况下异核体中的两个单倍体核融合产生一个二倍体核，这一过程称为二倍化（dipl

12、oidization）。二倍体品系的曲霉产生的无性孢子将具有二倍体核。二倍体细胞是可能要经历有丝分裂交换，产生遗传重组。因为二倍体的核不稳定，最终通过有丝分裂产生单倍体核，此单倍体核含有来自两个单倍体亲本的等位基因的重组。由二倍体核形成单倍体核的过程称为单倍化（hapliodization）,概念,二、准性生殖的过程 (一) 异核体的形成 当带有不同遗传性状的两个单倍体细胞或菌丝相互融合时，会导致在一个细胞或菌丝中并存有两种或两种以上不同遗传型的细胞核，这样的细胞或菌丝就叫异核体。异核体的形成是进行准性生殖的第一步。以构巢曲霉为例,当把构巢曲霉A接合型的亮氨酸缺陷突变株(leu met+) 与

13、A接合型的蛋氨酸缺陷型突变株(leu+ met-) 混合接种在基本培养基上培养时，常常可以产生少量原养型菌落，这些菌落是异核体。这是因为两个亲本的菌丝间发生相互联结，形成了细胞质和细胞核相互混杂的异核体。在异核体中两种细胞核能彼此提供所缺少的酶，因此可不需亮氨酸和蛋氨酸而在基本培养基上生长。,1异核体的证实将两个营养缺陷型菌株混合培养，出现原养型菌落的原因可能是由于互养、异核体、二倍体或单倍重组体的存在。如何证明？(1)互养这一解释的排除(2)二倍体或单倍体的排除,的证实,异核体,1、互养2、二倍体和重组单倍体,A、leu-met+B、 leu+met-,基本培养基,含leu培养基,含met培

14、养基,基本培养基,2异核体的生物学意义 异核现象在自然界普遍存在。早在1938年就已在35属的半知菌中发现32属有异核现象。异核现象在自然界这样普遍的一个原因是异核体包含着不同基因型的细胞核，具有生长优势，另外是具有更好的环境适应能力。此外，异核体在遗传分析中也很重要，由于异核体内的两个不同营养缺陷型的细胞具有互补作用，因此可以用异核体进行基因等位性的测定等研究。 一般地说，异核体的形成与A、a接合型之间没有关系，但接合型可影响形成异核体的难易程度，相同接合型的菌株间更容易形成异核体。异核体的形成是由基因型决定的，在粗糙脉孢菌中已发现至少有10个基因与异核体的形成有关。,(二)杂合二倍体的形成

15、 异核体细胞中存在着核融合的可能。核融合是指两个单倍体核融合形成一个二倍体核的现象。基因型相同的核融合形成纯合二倍体，基因型不同的核融合形成杂合二倍体。异核体中两个基因型不同的细胞核可以以极低的频率融合成杂合二倍体。研究表明异核体发生核融合而产生二倍体的频率为10-710-5。用某些理化因素(如紫外线、樟脑蒸气或高温)处理，可提高二倍体产生的频率。原因可能是由于在处理过程中使某些抑制核融合的基因发生突变的结果。,1956年，Pontecorvo等人在用构巢曲霉白色突变株(w-y+ )和黄色突变株(w+ y- )进行异核体的研究时发现，在培养基中可产生形成绿色孢子的菌株。由异核体( w-y+ /

16、 w+ y- )所产生的孢子应该是白色和黄色两种，那么绿色的孢子是怎样形成的呢？绿色分生孢子的形成是由于异核体中的两个核融合而形成二倍体( w-y+ / w+ y- )的缘故。由于白色突变型和黄色突变型对于绿色野生型来讲都是隐性的，所以二倍体的分生孢子必然呈绿色。,例子,1、W+Y-黄色W-Y+白色 -绿色？（ W+Y-/ W-Y+ ）2、 W+Y-/ W-Y+绿色-白、黄。？,二倍体有什么特性呢？1、二倍体分生孢子大于单倍体的分生孢子；2、尽管分生孢子的大小是一样的，但每个分生孢子中核的数目是不相同的, 二倍体分生孢子中核数约为单倍体分生孢子的一半。,(三) 体细胞交换和单元化 准性生殖循环

17、过程中产生的二倍体并不象有性生殖过程中的二倍体那样进行减数分裂，它们仍以有丝分裂的形式增殖。从稳定性来看，二倍体细胞比异核体较为稳定。从异核体所取得的分生孢子属于两个亲本菌株，从二倍体得到的分生孢子则一律都是二倍体。 可是稳定性是相对的，正像从异核体中可以得到少数二倍体犯不着一样，从大量的二倍体分生孢子中也可以得到少数体细胞分离子。所谓分离子包括重组体和非整倍体或单倍体。产生非整倍体或单倍体的过程称为单元化，产生重组体的过程称为体细胞交换。,体细胞重组体的产生经研究发现，体细胞重组体的出现是由于在有丝分裂过程中同样染色体间发生染色体交换，从而导致部分基因的纯合化。,此外，研究发现二倍体细胞在有

18、丝分裂过程中通过产生非整倍体或单倍体-单元化过程亦可形成重组体(图 )。,在准性生殖过程中，体细胞交换和单元化是两个独立发生的。体细胞交换产生部分基因纯合化的二倍体的重组体，而单元化过程则产生各种类型的非整倍体和单倍体的重组体。因此，可以通过体细胞重组和单元化过程进行有丝分裂定位。,第四节 丝状真菌的遗传物质和基因表达调控 真菌的遗传物质包括5种成份:染色体基因、线粒体基因、质粒、转座因子及病毒基因。,核基因组（重复、内含子、分散）丝状真菌的基因组 线粒体基因组（几十Kb） 质粒、转座因子、病毒,粗糙脉孢霉单倍体基因组为4.3107bp，G+C含量为54%,每条染色体的大小为410.3Mb。端

19、粒与人的端粒相同。线粒体内含有质粒。已经鉴定了2000多个不同的粗糙脉孢菌基因，目前正在构建基因组的物理图谱，德国和美国的科学家及其单位正在进行基因组测序。,2. 核基因组结构 丝状真菌中功能相关的结构基因一般是不连锁的、分散存在于基因组中。但也有一些如与脯氨酸代谢有关的4个基因、与奎尼酸代谢有关的7个基因以及有关青霉素生物合成的3个基因是连锁的，聚集在一起构成基因簇，前两个基因簇同时还包含结构基因和调节基因。基因簇中所有各基因都是分别产生各自的mRNA，并不象原核生物那样形成操纵子结构。 1989年在自然界分离的粗糙脉孢菌菌株中发现了丝状真菌的第一个转座子Tad，该转座子全长7kb，在核基因

20、组中以多拷贝存在，插入DNA时产生靶序列的重复。后来，在其它真菌如尖镰刀菌中也发现了转座因子，而且发现转座子与植物病原菌的致病和培养性状的高度变异有关。,3. 线粒体基因组 丝状真菌线粒体是大小为几十个kb的环状结构，它含16S和23S rRNA基因和20多个tRNA基因，还有几个与电子传递链有关的结构基因。此外，还还有一些尚未鉴定的ORF。 线粒体基因组在正常复制过程中经常发生分子内重组，造成基因组大小的多变。重组的内容和方式有多种，如线粒体DNA重排、DNA片段的插入或缺失。还有因内含子剪接不同造成基因内所含内含子数目不等等。,二、基因结构(1)启动子 许多丝状真菌基因的5非编码区存在高等

21、真核生物基因启动子中普遍具有的CAAT和TATA盒。但有许多丝状真菌基因并不含上述保守序列。(2)上游激活序列 上游激活序列是与激活蛋白结合的部位。在粗糙脉孢菌奎尼酸代谢(qa)基因簇中，qa-1F编码的激活蛋白能与该基因簇中5个结构基因的5非编码区结合，并对转录起激活作用。,(3)增强子 缺失分析发现粗糙脉孢菌的am基因(编码谷氨酸脱氢酶)受两个5上游远距离序列的调节，一个序列在转录起始点上游1.4kb，另一个在上游2.13.2kb之间。当同时缺失这两个序列时，只保留516%的表达水平，推测这两个序列可能是弱的增强子。,三、基因表达的调控 随着分子生物学研究方法在丝状真菌研究中的应用,已经开

22、展了对丝状真菌基因的表达及其调控全方位的研究，并取得了一定的进展。 如在抗生素生物合成的基因簇结构、基因表达调控；分生孢子形成的结构基因及其分生孢子发育过程中基因表达的时空秩序性；参与营养物质代谢的基因及其表达调控等方面已做了较深入的研究工作。下面以粗糙脉孢菌奎尼酸代谢为例，阐述其调控机制。,粗糙脉孢菌的qa基因簇（奎尼酸代谢基因簇） 粗糙脉孢菌的qa基因簇包含5个结构基因和2个调节基因，全长18 kb(图)。5个结构基因从左到右依次是:qa-X、qa-2、qa-4、qa-3 和qa-Y；2个调节基因分别是qa-1F 和qa-1S。 这2个调节基因qa-1F 和qa-1S，分别编码激活蛋白和阻

23、遏蛋白，在无奎尼酸时这2个基因属于低水平的组成型表达。 5个结构基因的转录受奎尼酸的协同诱导，同时受qa-1F 和qa-1S的协同调节，诱导时的转录水平比无诱导时高501000倍。所有qa基因簇(包括结构基因和调节基因)的转录都需要qa-1F 编码的蛋白的激活。无诱导物时， qa-1S编码的阻遏蛋白与激活蛋白结合，阻止了qa-1F 基因的转录，从而使qa结构基因及其qa-1S基因的转录受阻，仅维持在基础水平的转录。,有诱导物时，诱导物与阻遏蛋白结合，使qa-1F 基因脱阻遏，产生的激活蛋白促进qa结构基因的转录，与此同时也促进qa-1S的转录，因此一旦诱导物水平下降，已逐渐积累的阻遏蛋白便可立

24、即将整个系统关闭。在qa基因簇中共有13个激活蛋白的结合部位，该部位是部分对称的16 bp的保守序列GGATAANNNNTTATCC，说明有些基因启动子上游有1个以上的激活蛋白结合部位。,四、丝状真菌的接合型基因 已经对多数丝状子囊菌和担子菌的接合型基因进行了克隆和特征分析。接合型基因的名称现在倾向于统一用MAT来表示，但对于个别旧的称呼仍然延用。 粗糙脉孢菌的接合型有A和a两种类型,mat a的长度为3235 bp，含有一个ORF,即mat a1，编码382个氨基酸；mat A的长度为5301bp，含有3个ORF，即mat A-1、mat A-2和mat A-3,它们编码的产物的氨基酸长度分

25、别为293、373和324 (图 )。mat a和mat A这两个DNA区段并无同源性，但它们两侧的DNA序列是相同的。mat a和mat A这两个不同的DNA区段在单倍体细胞中对应的相同的染色体上占据着相同的位置，被叫做二极性(idiomorphs)，而不叫等位基因。 mat a-1和mat A-1是细胞接合和有性生殖所必需的，而mat A-2和mat A-3能提高有性生殖能力但并不是有性生殖所必需的。,mat a和mat A的作用可能与酿酒酵母中的接合型基因类似，编码调节蛋白，对接合信息素的分泌和受体的产生进行调控。其它丝状子囊菌如Gibberella、Podospora、Pyrenope

26、riza、P. anserina等都有与粗糙脉孢菌类似的结构，即mat a含有单一ORF而mat A含有3个ORF，其作用可能也类似。但担子菌的接合型基因的结构和作用则不同于子囊菌。在担子菌中，接合型基因直接编码信息素和受体，直接控制着细胞的融合和有性孢子的形成。,第五节 丝状真菌的转化及其特点一、外源DNA导入丝状真菌受体的方法外源DNA导入丝状真菌中最普遍使用的方法是CaCl2/PEG介导的原生质体转化。首先是用溶壁酶处理菌丝体或萌发的孢子获得原生质体，然后将原生质体、外源DNA混合于一定浓度的CaCl2、PEG(聚乙二醇)缓冲液中进行融合转化，然后将原生质体涂布于再生培养基中选择转化子。

27、 对于难以获得原生质体的丝状真菌来说，也可利用醋酸锂介导的完整细胞的转化，但转化率低。在丝状真菌中也应用了电转化技术，与普遍采用的CaCl2/PEG方法相比，虽然简化了操作步骤，但对提高转化率并无明显作用。基因枪注射(或生物导弹)转化技术，最近几年也在丝状真菌中得到应用，它同样不能十分有效地提高转化率。,二、载体及其选择标记1.载体 转化DNA进入寄主细胞后，可独立寄主细胞核染色体而自主复制，或整合到寄主染色体上而随寄主染色体一起复制，前者被称为复制型转化，后者被称为整合型转化。 已实现转化的丝状真菌中，绝大多数都是整合型转化。早期应用的载体通常以细菌质粒如pBR322、pUC等为主，在钙离子

28、和PEG作用下向受体菌原生质体进行转移，转化效率较低，一般每微克转化DNA产生100个以下的转化子。这类载体引起的转化一般属于整合型转化，常常载体携带的真菌基因和载体本身会同时整合到受体染色体上。DNA进入受体细胞后，是通过同源重组和非同源重组两种方式而整合到受体菌的染色体上的。,2.选择标记 所用的选择标记分两类，一类是营养互补标记，另一类是显性标记(抗生素或药物抗性)。,三、丝状真菌转化子的表达及其稳定性 克隆基因在转化受体菌中的表达水平与多种因素有关，包括载体中所用启动子及其其它调控序列的存在、目的基因整合位置、整入拷贝数和受体菌株等。 一般来说，无论整合型转化子还是复制型转化子，其在有

29、丝分裂过程中是稳定的，大多数转化DNA在经过几十代的有丝分裂后仍保持稳定性。但经过减数分裂表现出高度的不稳定，尤其是粗糙脉孢菌。经过有性过程导致转化DNA丢失的机制有:质粒的丢失、DNA的切离、DNA重排等。,第六节 丝状真菌中的质粒质粒最初是在细菌中发现的，后来在真核生物中也发现质粒。真核生物中记载最多的是真菌中含有质粒，少数植物含有质粒，动物细胞内没有质粒。真菌细胞中的质粒一般是环状或线状的双链DNA分子，而且大多是不编码任何表型性状的隐蔽质粒，位于细胞核或线粒体内。一、丝状真菌中的天然质粒及其分布到目前为止，已经发现很丝状真菌中都具有质粒，丝状真菌中的质粒有环状和线状两种类型，位于真菌的

30、线粒体内(表2-3)。,表2-3 含有质粒的真菌名称Absidia glauca 灰色梨头霉Agaricus spp. 伞菌Ascobolus immerses 埋生粪盘菌Ascosphaeria apis 蜂状囊菌Alternaria alternata 链格孢菌Claviceps purpurea 麦角菌Cochliobolus 旋孢腔菌Epichloe typhina 香柱菌Erisyphe graminis 禾白粉菌Fusarium solani 茄腐皮镰刀菌Fusarium oxysporum 尖孢镰刀菌Leptosphaeria maculans 十字花科子囊腔菌Morchella

31、 conica 尖顶羊肚菌,Nectria haematococca 赤球丛赤壳菌Neurospora crassa 粗糙脉孢菌Neurospora intermedia 中脉孢菌Podospora anserine 四孢壳孢菌Phythium spp. 腐霉菌Rhizoctonia solani 立枯丝核菌Tilletia spp. 腥黑粉菌Tricoderma viride 绿木霉a,有些丝状真菌中质粒的命名最早是根据质粒寄主的采集地点而定的。如粗糙脉孢霉菌中的Mauriceville质粒，中脉孢菌中的Lebelle和Fiji质粒等。对脉孢霉属的质粒概况研究表明，该属含有11种不同的质粒，

32、质粒具有线状和环状两种类型(见表2-4)。对尖胞镰刀菌、立枯丝核菌的研究表明，每种真菌中都含有一种或一种以上的质粒。值得注意的是，在研究最多的曲霉中尚还没有发现质粒。表2-4 脉胞霉菌中的质粒同源组质粒类型 同源组环状 Mauriceville，Fiji，LaBelle，Java，MBI，VS，Harbin-2线状 Kalilo，Maranhar，Moorea，Zhisi,二、质粒的表型和质粒结构实际上，对所有丝状真菌中的质粒而言，其对寄主表型的影响仍然不清楚。在大多数情况下，没有发现对寄主真菌的生长有明显的影响作用。也许质粒能够赋予寄主选择优势，如在线粒体代谢或分裂的某些方面。另外，有些质粒

33、与宿主真菌的老化有关。上面例举的具有质粒的真菌很多都是寄生真菌。真菌中的天然质粒最常见的是线状，环状质粒主要存在于在脉胞霉菌中，其它个别种如：旋孢腔菌、麦角菌和灰绿梨头霉中也有环状质粒。 据DNA的双向电泳和脉冲电泳，可将线性质粒与线粒体DNA区分开。大多数线型质粒在两条DNA链的5末端各有一个共价结合的蛋白，保护DNA免受酶的降解。在真菌中，环状质粒的检测比较复杂，常用探针检测线粒体部分，根据带型来进行确定。,1.线型质粒 研究最深入的是脉孢霉菌中的天然质粒，对环状质粒和线状质粒都进行了全序列分析研究，特征见图。线状质粒Kalilo和Maranhar的总体结构是目前发现的大多数其它丝状真菌中

34、线状质粒的典型代表。其特点如下：(1)有末端反向重复序列 (TIR)，其长度因每种质粒而异；(2)在质粒的两个5末端各有一个结合蛋白，保护质粒不受核酸外切酶的破坏；(3)有两个非重叠的ORF，每个ORF都起始于末端反向重复序列内，但转录方向相反，即转录方向都是从末端指向中央。其中一个ORF编码DNA 聚合酶，另一个编码RNA 聚合酶，它们与噬菌体和酵母线粒体中的多聚酶具有相似性。在两个ORF之间有基因间隔区，虽然含有转录信号，但尚未发现有什么功能。大多数真菌的线状质粒有两个类似的ORF，但有些只有一个ORF。不同的质粒，其ORF的排列可能也不同。,立枯丝核菌中的3个线状质粒在几方面表现出非典型

35、性，首先它们的末端似乎是闭合的发夹结构，其次是ORF都不大于91个氨基酸。,2.环状质粒脉孢菌属中的环状质粒也不具有抗性特征。Fiji 和LaBelle这两种环状质粒编码DNA 聚合酶；Mauriceville和 Varkud这两种环状质粒编码反转录酶(reverse transcriptase)。脉孢菌属中的环状质粒都产生全长的RNA转录物,特别是在Mauriceville 和 Varkud质粒中。VS质粒只存在于含有Varkud质粒的真菌菌株中，自己本身没有编码蛋白质的ORF，可能依赖于Varkud质粒提供的功能，但确在体内发现VS的转录物。,三、质粒的遗传一般线粒体质粒的遗传与线粒体和线

36、粒体DNA(mtDNA)有相同的遗传方式。在有性杂交中，母本的质粒绝大多数或全部地传递给子代，一个例外是四孢壳孢菌AL2菌株中的pAL2-1质粒，当AL2在杂交中作为母本时，有些后代不含质粒。 实验室内的研究表明,在种内和种间存在着水平转移。粗糙脉孢霉菌中的Kalilo 和Maranhar质粒能通过异核现象在菌株间进行水平转移。另外，中脉孢霉菌和粗糙脉孢霉菌混合培养时，前者的Kalilo质粒能够进入粗糙脉孢霉菌不含质粒的菌株中，一定是通过部分或瞬间异核体。 在麦角菌中，天然质粒通过原生质融合能从一个菌株转移到另一个菌株中。研究也发现Kalilo质粒存在于脉孢菌和Gelasinospora sp

37、ecies中，可能是种间转移的结果，也可能是来自相同的祖先。,四、质粒整合到mtDNA 中脉孢霉菌的 Kalilo质粒和粗糙脉孢霉菌中的 Mauriceville质粒能整合到线粒体DNA上，引起寄主菌株的衰老和死亡。大多数野生型菌株并衰老，而是在长的生长管中继续生长。衰老表型是一种反常现象，表明质粒的存在与菌株的衰老呈正相关，质粒的转移也引起衰老表型在菌株间的转移，最终在寄主死亡之前或死亡之时，几乎所有衰老菌株的mtDNA分子都是整合型，但游离的质粒也存在于培养物中。DNA的致死作用还不清楚,但有证据表明，质粒的过度复制使线粒体蛋白的合成受到抑制，则引起宿主菌的衰老。a 质粒 Mauricev

38、ille和Kalilo插入方式与以前在真核或原核生物中观察到的插入方式完全不同。其机理还有待深入研究。,五、质粒的复制 1.环状质粒的复制 脉孢菌环状质粒的复制一直是较有兴趣的研究课题。最新研究表明，Mauriceville 编码的反转录酶，与质粒的复制有关。 2.线状质粒的复制 许多丝状真菌中的线型质粒，都具有末端重复序列TIR和共价结合蛋白TP(表 )。,表 丝状真菌中具有TIR和TP的线型质粒 质粒 来源 大小 TIR TP pA12 Ascobolus immerses 5.6 kb 700 bp 有 pMC32 Morchella cortica 6 kb 750 bp 不详 pCF

39、637 Ceratocystis fimbriata 8.2 kb 不详 有 pFQ501 Ceratocystis fimbriata 6 kb 750 bp 不详 pRS64 立枯丝核菌(Rhizoctonia solani) 2.6 kb 不详 不详 pEM Agaricus bitorquis 7.3 1 kb 不详 pMPJ Agaricus bitorquis 3.6 不详 不详 kal DNA 中脉孢菌(Neurospora intermedia) 9 kb 1361 bp 有,FOXC1 尖胞镰刀菌(Fusarium oxysporum) pFOXC2 尖胞镰刀菌(Fusari

40、um oxysporum) 1.9 kb 50 bp 有 pFOXC3 尖胞镰刀菌(Fusarium oxysporum) pCIK1 Claviceps purpurea 6.7 kb 327 bp 有 pFSC1 Fusarium solani f. sp. Cucurbitae 9.2 kb 1211 bp 80 kDa pFSC2 Fusarium solani f. sp. Cucurbitae 8.3 kb 1027 bp 80 kDa pLPO1 Pleurotus ostreatus 10 kb 不详 有 pLPO2 Pleurotus ostreatuAs 9.4 kb 不详

41、 有 pLLE1 Lentinus edodes 11 kb 不详 有,过去，对丝状真菌线型质粒的复制了解得很少。由于它具有5末端蛋白，因此一般认为质粒复制象腺病毒和噬菌体29那样，以蛋白质作为引物进行复制。但通过对尖胞镰刀菌中的质粒：pFOXC1、pFOXC2、pFOXC3的研究表明，它们编码的反转录酶与质粒的复制有关。,(四)线状质粒和线状染色体的复制和转移1.TP作为引物引导的DNA复制无论是从链霉菌、酵母菌或其它真菌还是从玉米中发现的线型质粒都具有两个共同特征：第一是线状DNA的两个末端具有反向重复序列；第二是DNA的5端结合着末端蛋白(terminal protein)。腺病毒(Ad

42、enovirus)和枯草杆菌噬菌体29具有与线状质粒一样的共同特征。而且，已经知道S. rochei中的pSLA2质粒，通过位于质粒DNA中央的复制起点进行双向复制，在3端留下280 bp的单链空隙，然后靠TP作为引物进行复制而补齐。天蓝色链霉菌也是从oriC向双向进行复制，可能在3端留下的单链空隙，也是依靠TP作为引物而完成复制。 图 显示的是腺病毒、枯草杆菌噬菌体29及几种线状质粒的分子结构的典型代表。,(1)起始阶段：病毒编码的P6蛋白和P17蛋白与复制起点结合形成蛋白-核酸复合物，使双链DNA的末端解螺旋，产生单链区。一分子游离的TP与特异的DNA聚合酶(DNA聚合酶B家族，由噬菌体编

43、码)结合形成TP-DNA聚合酶复合物，然后TP-DNA聚合酶复合物识别并与复制起点结合。在对应于5末端的dATP存在时，DNA聚合酶催化TP的丝氨酸上的OH基与dAMP共价结合。,(2)延伸阶段：DNA复制起始后，在相同的DNA聚合酶的作用下，通过”链弃置机理”(strand-displacement mechanism)进行DNA链的延伸，即合成新链的同时使带有TP的亲本链游离出来，单链结合蛋白(SSB) p5 结合在被弃置的母链上，同时起始蛋白从DNA链上脱离下来。复制是连续进行的，没有岗歧片段的出现。在从DNA的一端起始合成后，另一端也以同样的方式开始复制，形成所谓的type-复制中间体，即全长的双链DNA、并带有一个或2个单链分枝。当复制继续进行，两个复制叉相遇时，type-复制中间体在空间上相互分开，形成2个type复制中间体。每个type复制中间体，都具有全长的DNA，并且起始合成的一端是双链DNA，尚未完成复制的另一端是单链DNA。,(3)终止阶段：随着SSB蛋白从单链DNA上的移去，复制继续进行到DNA的另一端，完成复制。一旦合成全长的双链DNA分子，DNA聚合酶就会与另一个TP结合，开始新一轮DNA的复制。,